EV71感染對手足口病患兒DCs成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細胞因子表達的影響

李冬

(盤錦職業技術學院醫學分院，遼寧盤錦124000)

EV71感染對手足口病患兒DCs成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細胞因子表達的影響

李冬

(盤錦職業技術學院醫學分院，遼寧盤錦124000)

目的 探究腸道病毒71型(EV71)感染對手足口病患兒樹突狀細胞(DCs)成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細胞因子表達的影響。方法 選擇手足口病患兒40例，根據感染程度將患兒分為輕癥感染組(20例)、重癥感染組(20例)，另選取同期同年齡段健康兒童20例作為對照組。抽取各組DCs體外培養、誘導后檢測表面標志的變化、細胞凋亡情況及MAPK信號通路活化情況，并對細胞培養上清中炎性細胞因子表達水平進行檢測。結果 輕度感染組、重度感染組CD80、CD83及CD86陽性率隨感染程度的加重而上升，其中CD80、CD83與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。對照組凋亡細胞檢出率及死亡細胞檢出率在三組中最高；輕度感染組凋亡細胞及死亡細胞檢出率與對照組相比降低；重度感染組凋亡細胞及死亡細胞檢出率最低；三組細胞凋亡率及死亡率比較差異有統計學意義(P均<0.05)。輕度感染組、重度感染組p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達量均隨感染程度加深而增加(P均<0.05)。IL-6及IL-12表達隨感染程度的加重而呈上升趨勢，其中IL-6變化明顯，三組間比較差異有統計學意義(P均<0.05)，IL-12略有升高，三組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)；TNF-α表達隨感染程度的加重呈先升高后降低的趨勢，三組間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。結論 EV71感染可促進DCs成熟并分泌細胞因子，同時抑制其凋亡，活化MAPK信號通路，上調炎性細胞因子表達。

腸道病毒71型；樹突狀細胞；MAPK信號通路;炎性細胞因子

腸道病毒71型(EV71)是兒童手足口病的主要致病源[1]，其感染人數逐年上升。EV71感染所致手足口病起病急、發展快[2]，輕度感染患兒預后良好，重度感染患兒多伴隨腦膜炎等并發癥[3]，且致殘致死率高。目前針對該類手足口病尚無有效的疫苗及藥物。研究顯示EV71可使感染患兒體液免疫系統紊亂[4]，并通過感染樹突狀細胞導致炎性細胞因子表達改變。2014年12月，我們通過比較手足口病不同感染階段兒童樹突狀細胞(DCs)體外培養、誘導后成熟及凋亡情況、MAPK信號通路活化情況及炎性細胞因子表達變化情況，以期為EV71型手足口病疫苗的研究及開發提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6～12月我院收治并確診的手足口病患兒40例作為感染組,男22例、女18例,年齡10個月～9歲。根據《手足口病診療指南(2010年版)》對患兒進行診斷并評估病情，其中20例為輕度感染患兒(輕度感染組)，20例為重度感染患兒(重度感染組)。另選取同期同年齡段健康兒童20例作為對照組。感染組及對照組兒童年齡、性別具有可比性。均于入院24 h內采集外周血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.2 DCs分離培養 裂解外周血血漿中紅細胞，離心獲得單個核細胞(PMBC)。吸出的PMBC經無血清RPMI1640洗滌并以2×106/mL接種于T25細胞培養瓶中，37 ℃、5%CO2條件下靜置培養2 h。輕柔洗去未貼壁細胞，余下即為單核細胞。單核細胞采用完全培養基(RPMI1640+10%FBS)、100 U青鏈霉素抗生素，37 ℃、5%CO2條件下培養，并加入100 ng/mL 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、50 ng/mL IL-4以誘導DCs分化。2～3 d換液1次，連續培養7 d后收獲。

1.3 DCs表面標志物細胞數檢測 取感染組及對照組誘導培養后DCs直接用熒光抗體染色標記，抗體為PE標記的鼠抗人CD11c、CD80、CD83、CD86，陰性對照采用PE標記的鼠抗人Ig。用流式細胞儀檢測細胞陽性比例，對單核細胞進行免疫表型分析，根據免疫表型分析結果比較兩組DCs成熟度。

1.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V/PI雙染色法對誘導培養后的DCs凋亡情況進行檢測。取感染組及對照組誘導培養后細胞各490 μL，每組加入FITC-Annexin V 5 μL和PI 5 μL,避光溫浴10 min，PBS洗滌。每組取1×105個細胞經流式細胞儀分析。在488 nm氬離子激光器下，FITC呈綠色熒光，PI呈紅色熒光。保存流式細胞儀檢測結果，并用相關分析軟件進行結果處理。

1.5 信號通路蛋白檢測 各取感染組和對照組誘導培養后的細胞5×106個，裂解細胞并提取總蛋白，用Western blotting法檢測兩組細胞p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達情況，將膠片進行掃描，用凝膠成像分析系統分析蛋白磷酸化水平，將各樣品p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達量與對應GAPDH相除，得到相對表達量。

1.6 外周血炎性細胞因子檢測 收集感染組及對照組的細胞上清液，采用雙抗夾心ELISA法對外周血中細胞因子進行定量檢測。檢測的細胞因子包括IL-6、IL-12及TNF-α。

2 結果

2.1 EV71感染對DCs成熟的影響 誘導培養后的對照組細胞多為貼壁細胞，細胞無毛刺樣凸起；感染組細胞多為懸浮細胞，細胞周圍有毛刺樣凸起產生，且毛刺較長。三組DCs表面標志物檢測結果比較見表1。

表1 三組DCs表面標志物檢測結果比較(%，±s)

2.2 EV71感染對DCs凋亡的影響 Annexin V/PI雙染色法中早期凋亡細胞可被FITC染色，晚期凋亡細胞及壞死細胞可被PI染色。對照組、輕度感染組、重度感染組細胞凋亡率分別為(54.89±7.10)%、(30.18±5.33)%、(16.41±1.39)%，死亡率分別為(21.77±6.13)%、(14.25±5.37)%、(1.56±0.73)%，三組細胞凋亡率及死亡率比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 三組EV71感染后信號通路活化情況比較 見表2。

2.4 三組細胞因子定量檢測結果比較 見表3。

3 討論

EV71導致的兒童手足口病癥狀較其他病毒引發的疾病更嚴重，部分患兒會產生嚴重后遺癥。目前臨床主要為抗病毒化學藥物及細胞因子等治療，效果不佳。因此，制備有效的抗病毒疫苗成為EV71防治的重心。DCs是體內最重要的抗原遞呈細胞，未成熟DCs的主要功能為攝取加工抗原及隨體內循環系統遷移，成熟DCs負責遞呈抗原以刺激T細胞增殖并激活免疫系統[5]。病毒感染機體后首先遇到的就是DCs[6]，DCs可被病毒感染，亦能攝取病毒感染的細胞，同時又是機體適應性T細胞免疫應答的激活者[7]。CD83作為成熟DC特有的表面標志，通常被用來識別和分離成熟DCs；CD86、CD80、CD11c亦是成熟DCs表達的重要共刺激因子，其表達量上調代表DCs成熟[8]程度的加深。本研究中，輕度感染組、重度感染組各標志物的表達均高于對照組，其中CD83、CD80的上調與對照組相比差異有統計學意義，表明EV71感染對DCs成熟起到明顯促進作用。成熟DCs在激活機體免疫系統的同時分泌各種炎性細胞因子，參與免疫應答并發揮免疫調節作用[9]。本實驗結果表明，隨感染程度的加深，IL-6、IL-12均顯著增加，而TNF-α在感染初期表達水平較高，而在重度感染時反而出現降低現象。炎性因子的增加又可繼續刺激DC細胞成熟，成熟DCs可能對EV71繁殖有抑制作用[10]。而重度感染時TNF-α表達下降，推測是由于DCs成熟程度較高，對TNF-α產生了負反饋而導致。彭宏君等[11]發現，感染可促進DCs成熟、提高體外培養DCs活性并增強炎性細胞因子表達，與本實驗結果一致。

表2 三組p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達量比較(±s)

表3 三組細胞因子定量檢測結果比較(pg/mL，±s)

研究[12]表明，p38MAPK信號轉導通路參與介導DCs的凋亡。p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白均為此信號通路的重要節點，其含量上調，表明此信號通路被激活。本實驗中，隨感染程度的加深，p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白含量隨之上升，表明此信號通路參與介導的促細胞凋亡信號在增強。而細胞生存能力實驗卻表明，隨感染程度的加深，DCs的生存狀況反而較優。原因可能EV71感染后機體由于應激反應，DCs細胞趨向成熟，以刺激T細胞對抗病毒。DCs對初始T細胞的增殖活化起關鍵作用，因此隨感染程度的加深細胞死亡及凋亡率降低，這是機體抵御病毒感染的自然反應。EV71感染未成熟DCs激活細胞凋亡信號通路，但由于本研究是將已被病毒感染患兒的單核細胞提出體外誘導培養，未成熟的DCs在體外無持續病毒感染情況下被誘導成熟，因此導致雖然信號通路開啟，但細胞凋亡及死亡率降低。

綜上所述， EV71感染可促進DCs成熟并分泌細胞因子，同時抑制其凋亡，活化MAPK信號通路，上調炎性細胞因子表達。

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