甲狀腺癌的DNA甲基化研究進展

綜述審校

復旦大學附屬腫瘤醫院頭頸外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

甲狀腺癌的DNA甲基化研究進展

曹一鳴綜述，朱永學審校

復旦大學附屬腫瘤醫院頭頸外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學改變，在腫瘤的發病、診斷、預后評估及治療中都有重要的臨床意義。甲狀腺癌是臨床最常見的內分泌系統惡性腫瘤，目前國內外關于甲狀腺癌的DNA甲基化的研究相對較少，該文總結近年來甲狀腺癌領域相關的基因甲基化研究，就甲狀腺癌的DNA甲基化研究進展進行綜述。

甲狀腺癌；表觀遺傳學；DNA甲基化

甲狀腺癌是臨床最常見的內分泌系統惡性腫瘤，在全世界范圍內約占全部惡性腫瘤的1%，并且近年來發病率迅速上升［1］。甲狀腺癌的治療以手術治療和放射性131I治療為主，輔以甲狀腺激素抑制治療，總體預后相對較好，其中最常見的甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)術后10年生存率可達90%，但臨床上仍有部分病例侵襲性較強，容易出現淋巴結轉移和復發［2-3］。目前臨床上對甲狀腺癌手術的范圍、頸部淋巴結清掃的選擇及放射性131I治療的適應證均存在爭議，表觀遺傳學研究或許可以為我們提供甲狀腺癌在早期診斷、治療方案選擇和預后評估方面的新思路。

近年來關于甲狀腺癌的遺傳學和表觀遺傳學研究逐漸增多，基因突變和甲基化改變在甲狀腺癌發生、發展過程中發揮重要作用［4］。BRAF、RAS和RET基因突變在甲狀腺癌中發揮的作用已得到廣泛認可，其中BRAF突變在PTC中最為常見，約占29%～83%［5-6］，具有BRAF突變的腫瘤往往具有較差的臨床表型和不良預后，BRAF突變致癌的相關機制目前還不明確，DNA的甲基化可能在其中發揮重要作用［7-10］。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學的改變，啟動子CpG島的甲基化改變具有調控基因表達、維持染色體完整性和調節DNA重組等作用［11］。抑癌基因啟動子的高甲基化可使其表達降低，而癌基因啟動子的低甲基化可使其表達升高，從而導致腫瘤的發生。DNA甲基化是惡性腫瘤發生中的一種常見改變，反映了環境因素與遺傳因素的相互作用，DNA甲基化具有可逆性，有望通過藥物治療改變基因的甲基化狀態，達到治療腫瘤的目的，因此，研究DNA甲基化在腫瘤的發病機制、早期診斷和預后評估方面均具有重要意義［12］。

目前，在甲狀腺腫瘤細胞中研究較多的主要有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、磷脂酰肌醇3激酶/絲/蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine/ threonine protein kinase，PI3K/Akt)通路、促甲狀腺激素受體/環磷酸腺苷(thyroid stimulating hormone receptor/cyclic adenosine monophosphate，TSHR/cAMP)通路和Wnt/β連環蛋白(Wnt/ β-catenin)通路，許多基因的遺傳學改變或表觀遺傳學改變會激活或抑制這些通路，進而促使腫瘤發生［13-15］。例如，在PTC中，常常出現RET/PTC重排和RAS、BRAF基因突變，這些改變在MAPK通路激活的患者中約占70%，其在腫瘤發生過程中起到關鍵作用［16］。另外，許多抑癌基因的甲基化與BRAF基因突變相關，如ARAS相關區域家族基因1A(Ras-association domain family 1A，RASSF1A)、維甲酸受體β2(retinoic acid receptor β2，RARβ2)、組織金屬蛋白酶抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)、溶質載體蛋白家族5A8(solute carrier family 5 member 8 gene，SLC5A8)和mut-L同源基因1(mut-L homolog 1，MLH1)等，提示其很可能通過MAKP通路發揮作用。而在濾泡性甲狀腺癌(follicular thyroid cancer，FTC)中則更多出現PI3K/Akt通路的激活，PIK3CA基因的突變和擴增在其中發揮重要作用，RAS、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)、甲狀腺轉錄因子-過氧化物酶體增殖物激活受體(paired box 8/peroxisome proliferatoractivated receptor，PAX8/PPAR)、金屬硫蛋白1G(metallothionein 1G，MG1T)等基因的突變和甲基化都是PI3K/Akt通路激活和腫瘤發生的重要因素。TSHR/cAMP信號通路的相關研究比前兩者少，TSHR基因突變在甲狀腺癌中不常見，但TSHR基因的高甲基化和低表達則常常出現，另外其下游叉頭基因E1(forkhead box E1，FOXE1)也常出現基因突變和異常甲基化，可能與腫瘤發生相關。Wnt/β-catenin通路的激活被認為是甲狀腺未分化癌(undifferentiated thyroid cancer，UTC)發生中的晚期事件，近年來有研究證實，其在PTC中也發揮重要作用［17］，上皮鈣黏附素(E-cadherin，ECAD)和谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)等基因的甲基化可能在其中發揮調控作用［18］。上述4條通路并不是互相獨立的，許多基因可以受多條通路調控，如PAX8基因可以同時參與PI3K/Akt通路與Wnt/β-catenin通路的激活［19-20］。

該文總結近年來甲狀腺癌領域甲基化基因的相關研究，從4條主要信號通路入手，列舉了目前已知的和潛在的可能在甲狀腺癌中存在異常甲基化的基因，簡單分析其與BRAF突變的相關性(表1)，探討他們在甲狀腺領域可能的應用價值［6,10,21-40］。

1 MAPK通路相關基因

1.1 RASSF1A

RASSF1A是Ras超家族的成員，是一種在各種器官中廣泛表達的抑癌基因，它通過抑制細胞周期蛋白D1，延緩細胞周期，并通過活化哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1)、MST2等介導細胞凋亡。RASSF1A在正常組織中廣泛表達，而在腫瘤組織中經常表達缺失，在多種腫瘤細胞中都發現其啟動子存在高甲基化狀態。有文獻報道，RASSF1A在甲狀腺癌中甲基化率為15%～75%［41-42］。Xing等［21］研究了在正常甲狀腺組織、甲狀腺濾泡性腺瘤(follicular adenoma，FA)、FTC和PTC中RASSF1A的甲基化情況，發現其甲基化率分別為0%、44%、75%和20%，提示RASSF1A基因的異常甲基化是腫瘤發生過程中的早期事件。Kunstman等［22］針對PTC中RASSF1A甲基化的研究表明，相比正常甲狀腺組織，PTC中RASSF1A發生高甲基化(8.9% vs 2.1%)，并且RASSF1A的高甲基化狀態與腫瘤的多灶性和包膜外侵犯相關。

1.2 RARβ2

RARβ2在調節上皮細胞的生長及腫瘤進展中發揮重要作用。在甲狀腺癌轉移復發治療中，維甲酸治療可以恢復轉移灶的攝碘能力，進而提高放射性131I治療的療效。Brait等［43］的研究顯示，RARβ2在甲狀腺癌中的甲基化率為14%，高于正常甲狀腺組織(7%)和甲狀腺良性腫瘤(2%)，并且RARβ2基因的甲基化與BRAF基因突變相關。Vivaldi等［24］研究發現，甲狀腺癌細胞株中存在RARβ2基因高甲基化，通過5-氮雜胞苷處理后發現，RARβ2表達明顯提高，且腫瘤的生長受到抑制，這種抑制在去除5-氮雜胞苷后仍然存在，提示基因甲基化在腫瘤發生、發展中起關鍵作用。

表 1 甲狀腺癌中常見的異常甲基化基因Tab. 1 Aberrant methylated genes in thyroid cancer

1.3 TIMP3

TIMP3能夠與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)結合，有效抑制MMPs的活性，進而抑制腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成，發揮抑癌作用［44］。TIMP3基因啟動子的甲基化已在多種惡性腫瘤中得到證實，并常與惡性腫瘤的生長、侵襲和淋巴結轉移相關。Hu等［25］的研究指出，TIMP3基因在甲狀腺癌中高甲基化，且與腫瘤的包膜外侵犯、淋巴結轉移和病灶多發性相關。

1.4 SLC5A8

SLC5A8是一種位于甲狀腺濾泡細胞頂膜的被動碘轉運體，具有Na+/短鏈脂肪酸協同轉運載體的功能。有研究指出，SLC5A8是結腸癌的抑癌基因，在其第一外顯子區常常出現高甲基化并導致基因沉默，恢復表達則可抑制腫瘤細胞生長。SLC5A8在甲狀腺癌中也常常出現高甲基化，其功能尚不明確，但其高甲基化很可能在甲狀腺癌的發生中起到關鍵作用。Porra等［30］的研究提示，SLC5A8基因在典型PTC中高甲基化(90%)，而在其他類型的PTC中甲基化率僅為20%，此外SLC5A8的低表達還與BRAF T1796A基因突變具有相關性，提示SLC5A8甲基化可能通過MAPK通路發揮作用。

2 PI3K/Akt通路相關基因

2.1 PTEN基因

PTEN基因編碼一種特異性的磷酸酶，可以使磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidyl inositol triphosphate 3，PIP3)去磷酸化，從而抑制PI3K/ Akt信號通路的激活。而PI3K/Akt通路是甲狀腺細胞中最為重要的信號通路之一，在細胞增殖、細胞功能等方面發揮基礎性作用，其異常激活在腫瘤發生過程中起重要作用［45］。有研究表明，甲狀腺癌中PTEN基因低表達，并且與PTEN突變無相關性，因此表觀遺傳學改變很可能在其中發揮關鍵作用［31］。Alvarez-Nu?ez等［32］的研究發現，PTEN在正常甲狀腺組織、PTC、FA和FTC中的甲基化率分別為0、45.7%、83.3%和85.7%，提示PTEN在甲狀腺癌中高度甲基化，尤其是FA。Hou等［31］研究了FA、FTC和UTC中PTEN的甲基化狀態，結果提示，PTEN甲基化水平在FA(12%)、FTC(51%)和UTC(69%)中逐漸提高，并且PTEN的甲基化與PI3K/Akt信號通路中基因(如PIK3CA、RAS)突變相關，提示PTEN甲基化及PI3K/Akt信號通路的改變在甲狀腺腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。

2.2 MT1G

MT1G是金屬硫蛋白家族的成員，是一種高度保守的富含半胱氨酸的小分子，主要參與金屬相關的轉運工作，如為各種酶和轉錄因子提供鋅和銅等。有研究表明，MT1G基因在甲狀腺癌、肝癌、結腸癌和前列腺癌中均存在異常甲基化。體內外實驗均證實，恢復MT1G基因的表達可以抑制腫瘤的生長，提示MT1G基因具有抑癌作用。Fu等［33］的研究表明，MT1G基因在甲狀腺癌中存在異常甲基化(在惡性腫瘤中為30.3%，在良性腫瘤中為18.8%)，且表達顯著降低，提示MT1G基因的甲基化與其低表達相關。進一步研究提示，恢復MG1T基因的表達可以抑制PTC的生長和浸潤，并誘導細胞周期抑制和細胞凋亡，其作用機制可能是抑制PI3K/AKT通路或Rb/E2F通路。另外，MG1T的高甲基化狀態還與腫瘤的淋巴結轉移相關(OR=2.40，95%CI：1.19～4.83)。

2.3 共濟失調-毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutated gene，ATM)

ATM編碼的蛋白屬于PI3/PI4酶家族，ATM及其相關激酶ATR在細胞周期調節通路中發揮重要作用，參與DNA雙鏈斷裂的修復過程，并維護基因的穩定性。Smith等［46］的研究表明，ATM在PTC中高甲基化(50%)，正常甲狀腺組織為0，但ATM的甲基化狀態與腫瘤的T分期、淋巴結轉移情況及術后復發均不存在明顯的相關性。

3 TSHR/cAMP通路相關基因

3.1 甲狀腺特異性基因

甲狀腺特異性基因主要包括TSHR、鈉-碘同向轉運體(sodium/iodide symporter，NIS)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，TG)和甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)基因，這些基因主要在甲狀腺碘攝取和維持甲狀腺正常功能方面發揮重要作用。有研究表明，在BRAF突變的甲狀腺癌中，TSHR、NIS、Tg和TPO表達均降低［35］，在PTC中，TSHR和NIS基因均存在異常甲基化且表達降低，低表達的TSHR和NIS可能與腫瘤的發生、發展相關，而TSHR和NIS的低表達同時又減弱了腫瘤細胞的攝碘能力，從而成為放射性131I治療失敗的重要原因［35,47-48］。

3.2 甲狀腺特異轉錄因子1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)

TTF-1是一種在甲狀腺、肺和中樞神經系統中發現的含有同源結構域的轉錄因子。TTF-1能調控甲狀腺相關基因(TG、TPO、TSHR和NIS)的表達，從而在調控甲狀腺的生長發育和功能方面發揮重要作用。Katoh等［49］研究證實，TTF-1基因在甲狀腺癌中低表達。Kondo等［50］研究TTF-1在甲狀腺癌中的甲基化狀態發現，TTF-1基因在細胞系和UTC中高甲基化且低表達，而在正常甲狀腺和PTC樣本中不出現高甲基化改變。

4 Wnt/β-catenin通路相關基因

4.1 ECAD基因

ECAD基因主要介導細胞間的黏附作用，在結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中都可以觀測到其表達水平的改變，ECAD的低表達常與惡性腫瘤的生長、侵襲、淋巴結轉移和不良預后相關。Smith等［46］研究發現，甲狀腺癌中ECAD甲基化程度升高，為56%(18/32)，正常甲狀腺組織為0(0/27)，進一步研究發現，ECAD的甲基化與甲狀腺癌的T分期和淋巴結轉移情況均無明顯相關性，在經過2.6年隨訪后，其甲狀腺癌復發情況也與ECAD甲基化無相關性。

4.2 Y染色體相關HMG-box基因17(SRY-related HMG-box 17，SOX17)

SOX17編碼特異性的轉錄因子，在胚胎發育過程中起重要作用，它可以抑制腫瘤細胞中Wnt/β-catenin通路的激活，從而在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用。Li等［37］研究指出，SOX17在PTC中甲基化程度升高，為60.3%(38/63)，正常甲狀腺組織為0(0/10)，SOX17的甲基化狀態與β-catenin的表達成負相關。

5 細胞周期和細胞凋亡相關基因

5.1 P16

P16是多種腫瘤的抑癌基因，其編碼產物為細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶抑制劑，是一種細胞周期的負性調控因子，能夠通過抑制細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶4的活性，進而阻止Rb蛋白磷酸化，阻止細胞進入S期，從而調控細胞周期。P16基因的異常表達，會使細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶4過度活化，刺激細胞的異常增殖進而導致腫瘤的發生［39］。Ishida等［51］研究報道，P16基因高甲基化(35.9%)。國內研究報道的P16基因甲基化率為15.6%～54.0%［52-54］。

5.2 MLH1

MLH1是重要的錯配修復基因，在DNA的損傷修復和維持基因組穩定方面發揮重要作用。在結腸癌中發現MLH1基因啟動子存在高甲基化，MLH1基因的低表達與BRAF V600E突變、RET/PTC重排及微衛星不穩定表型(microsatellite instability，MSI)相關。Brait等［43］研究了甲狀腺中MLH1的甲基化狀態，結果顯示，在正常甲狀腺細胞中MLH1甲基化率為7%，在FA中為19%，而在甲狀腺癌中為27%，提示MLH1基因甲基化可能為腫瘤發生過程中的早期事件。Santos等［6］的研究提示，甲狀腺癌中存在MLH1的異常甲基化和低表達，并且MLH1的低表達狀態與BRAF、IDH1和NRAS基因突變及MSI相關。Guan等［38］研究指出，MLH1的異常甲基化狀態與PTC的淋巴結轉移情況顯著相關，提示MLH1有望作為PTC淋巴結轉移的分子標志物。

5.3 死亡相關蛋白激酶(death associated protein，DAPK)

DAPK是一種鈣調蛋白調節的Akt，主要在細胞凋亡過程中發揮重要作用，DAPK的異常表達可以阻礙正常的細胞凋亡進程，從而導致腫瘤的發生。有研究表明，多種腫瘤細胞中存在DAPK基因的異常甲基化和基因沉默，包括甲狀腺癌。Hu［25］等的研究指出，DAPK基因的高甲基化水平與腫瘤的大小和病灶多發性相關。

6 其他潛在的異常甲基化基因

近年來，DNA甲基化是一個新的研究熱點，許多基因作為潛在的異常甲基化位點得到研究，包括MGMT、FOXE1、CITED1、RUNX3、RASSF2、RASSF10、FGFR2、GPX3、DACT2、RIZ1、Maspin和14-3-3σ等［26,55-65］，其他信號通路如JAK-STAT、NF-κB、HIF1α和Notch等在甲狀腺癌中的作用也逐漸得到認識［14,66］，但目前這些基因和通路在甲狀腺癌中研究報道相對較少，多數作用機制目前并不明確，有待進一步的研究。

7 小結

隨著過去十幾年來遺傳學和表觀遺傳學的不斷發展，越來越多的研究者認識到腫瘤的發生并不完全由遺傳基因決定，表觀遺傳學的后天影響同樣發揮重要作用。甲狀腺癌中的表觀遺傳學改變主要體現為抑癌基因和甲狀腺相關基因的異常甲基化。研究甲狀腺癌的DNA甲基化可以為我們提供新的分子標志物，為早期診斷、治療方案選擇和預后評估提供可靠依據。另外，設計針對特異性靶點的去甲基化藥物，重新激活抑癌基因功能，有望成為治療腫瘤的新方案。

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Research progress of DNA methylation in thyroid cancer

CAO Yiming, ZHU Yongxue (Department of Head and Neck Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZHU Yongxue E-mail: zhuyongxue163@126.com

DNA methylation is an important epigenetic modification. Evaluating the status of DNA methylation could be useful for diagnosis, prognostic evaluation and predicting the risk of cancer. Thyroid cancer is the most prevalent endocrine malignancy in humans. Growing evidence shows that epigenetic abnormalities participate with genetic alterations in carcinogenesis of thyroid cancer. This article reviewed the recent research progress of DNA methylation in thyroid cancer.

Thyroid cancer; Epigenetics; DNA methylation

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.04.011

R736.1

A

1007-3639(2017)04-0304-08

2016-09-15

2016-11-20）

上海市自然科學基金資助項目(12ZR1406800)。

朱永學 E-mail: zhuyongxue163@126.com