Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53與輔助生殖早孕期流產的相關研究

安彥玲，周立飛，莫中福，馬靖茹，李慧娜

(河北省石家莊市第六醫院婦產科，河北 石家莊 050051)

·論 著·

Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53與輔助生殖早孕期流產的相關研究

安彥玲，周立飛，莫中福，馬靖茹，李慧娜

(河北省石家莊市第六醫院婦產科，河北 石家莊 050051)

目的研究Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53基因與輔助生殖早孕期流產的相關性。方法選擇輔助生殖早孕期流產者40例為試驗組，正常妊娠早孕人工流產者40例為對照組。收集清宮術后2組新鮮絨毛組織和蛻膜組織，采用缺口末端標記法檢測絨毛組織和蛻膜細胞的凋亡指數，采用免疫組織化學法檢測2組Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎兒絨毛組織和蛻膜組織中的表達，計算表達面積百分比。結果試驗組蛻膜組織和絨毛組織的細胞凋亡指數均高于對照組(P<0.05)。試驗組Caspase-3、Bax和p53蛋白表達百分比均顯著高于對照組(P<0.05)；試驗組絨毛組織細胞Bcl-2蛋白表達面積百分比低于對照組，蛻膜組織細胞Bcl-2蛋白表達面積百分比顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表達失調可能與輔助生育早孕期流產有關。

生殖技術，輔助；早孕期流產；細胞凋亡

早孕期流產是一種比較常見的現象，其發病原因較多，包括內分泌、遺傳疾病、免疫性疾病等因素，還有60%左右原因不明。近年來，隨著輔助生育的開展，早孕期流產的問題更為突出[1-2]。已有報道發現，細胞凋亡在胚胎著床、胎盤的發育及胎兒的生長發育過程中具有重要的作用[3]。而流產其實就是一個細胞凋亡的過程。本研究擬通過檢測胎兒絨毛和蛻膜組織細胞的凋亡指數及Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達，探討早孕期流產的相關機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2015年6月在本院門診就診的輔助生殖早孕期流產者40例為試驗組，入選標準：①卵巢功能正常，無生殖器官畸形和子宮疾??；②進入體外受精-胚胎移植周期的原因只是因為輸卵管問題；③進入檢測者按照標準長方案(促性腺激素釋放激素激動劑重組卵泡刺激素)；④排除免疫性遺傳性疾病及染色體異常者。試驗組年齡21～32歲，平均(25.01±3.27)歲，體質量指數22.04±3.19，胎齡(59.94±8.63) d。另選擇在本院門診就診的正常妊娠早孕且進行人工吸宮流產者40例為對照組，入選標準：身體健康，未服用任何相關藥物，自愿實施人工流產者。對照組年齡21～31歲，平均(25.34±3.26)歲，體質量指數21.67±3.15，胎齡(57.85±7.52) d。2組年齡、體質量指數、胎齡差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

本研究征得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 標本采集 收集清宮術后2組新鮮絨毛組織和蛻膜組織，用10%福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋，制作成4 mm切片，以備試驗用。

1.3 細胞凋亡指數檢測 試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司，采用缺口末端標記法(TUNEL法)測定絨毛組織和蛻膜組織的細胞凋亡情況，設陽性和陰性對照，陽性細胞也就是凋亡細胞(為在光學顯微鏡下細胞核有棕黃色顆粒者)，每張切片找3個視野，觀測100個細胞并計算凋亡指數。

1.4 免疫組織化學檢測 檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53相關一抗、二抗試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司，采用SP法檢測蛻膜組織和絨毛組織中各蛋白的表達。設置陽性和陰性對照。Bcl-2、Bax表達陽性為胞漿棕黃色，p53、Caspase-3表達陽性為細胞核棕黃色。每張切片3個視野，計數100個細胞中陽性細胞數，計算陽性細胞比率；陽性細胞數<10%為陰性，10%～25%為弱陽性，>25%～50%為陽性，>50%為強陽性。

1.5 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組細胞凋亡指數比較 試驗組蛻膜組織和絨毛組織的細胞凋亡指數均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 2組絨毛組織和蛻膜組織免疫組織化學結果 試驗組絨毛組織和蛻膜組織細胞的Caspase-3蛋白、Bax蛋白、p53蛋白表達面積百分比均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；試驗組絨毛組織細胞的Bcl-2蛋白表達面積百分比顯著低于對照組，而蛻膜組織顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組細胞凋亡指數比較

表2 2組Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎兒絨毛及蛻膜組織中表達比較 ，陽性面積百分比(%)]

3 討 論

近年來，隨著醫學研究的快速發展，人們對細胞凋亡在妊娠中的作用日益重視。研究表明，在妊娠胎兒的發育過程中，一些關鍵蛋白因子維持在一定的水平對細胞凋亡與增殖平衡狀態具有重要的作用；外界不良因素的刺激可打破這種平衡，致使細胞發生異常凋亡，有可能導致胎兒發育不良甚至流產；絨毛滋養細胞在早期胎盤發育過程中通過增殖和侵入母體細胞從而獲得胎兒發育和增殖過程所需的各種營養物質，這個過程中時刻伴隨著細胞的增殖和凋亡[4]。有研究表明，在胎盤形成過程中，胎盤滋養細胞的增殖和凋亡是胎兒生長發育的重要調節機制，其獲得母體營養物質的能力主要依靠其增殖和凋亡功能[5]。

凋亡是多因素、多階段和多基因嚴格控制的過程，受多因素的調控影響。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族就是在細胞凋亡中發揮重要作用的水解酶。研究表明，妊娠早期就有滋養細胞正常的細胞凋亡現象，當出現不良外界因素的時候，滋養層細胞就會發生過度凋亡現象，打破了絨毛正常凋亡和生殖的平衡狀態，導致病理性妊娠的發生[6]。本研究結果顯示，試驗組絨毛組織和蛻膜組織細胞凋亡指數均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步證實孕早期流產與凋亡有關。Caspase家族中目前唯一在胎盤組織表達的是Caspase-3，是一種細胞凋亡關鍵效應酶,它處在傳導通路的下游，是誘導細胞凋亡的關鍵酶，Caspase-3一旦被激活，細胞凋亡必將發生，且不可逆轉。本研究結果表明，試驗組絨毛組織和蛻膜組織Caspase-3表達面積百分比明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。這與董楓等[7]、Panzan等[8]的研究結果一致。因此，認為Caspase-3基因高表達有可能是導致流產的重要因素，Caspase-3在組織細胞中的高表達很可能啟動線粒體/細胞色素C及Fas介導的凋亡途徑，引起滋養層細胞凋亡增加，而絨毛細胞的大量凋亡勢必影響其正常的生理功能，絨毛生長受到影響，阻礙了孕卵的生長和發育，繼而引起流產。

Bcl-2蛋白主要分布在人早孕的滋養層細胞和蛻膜細胞中。已有研究表明，Bcl-2家族在細胞凋亡中起到關鍵性作用，細胞凋亡調控與Bcl-2和Bax蛋白水平的高低密切相關，Bax增高可促進凋亡，Bcl-2增高可抑制細胞凋亡[9]。細胞受到外界不良因素的刺激后，在早孕過程中細胞凋亡的發生由Bcl-2/Bax比率所決定，一旦比值發生變化，Bcl-2和Bax蛋白就會形成Bcl-2/Bax同源二聚體，該二聚體使細胞內線粒體功能發生改變，通過一系列轉導有可能導致大量細胞凋亡。所以，Bcl-2和Bax在早孕期胎兒正常發育過程中保持一定比率共同調節胎兒發育，使得細胞的增殖與凋亡處在一個平衡體系中，這樣有利于胎兒的正常生長發育。如果受到外界不良因素的影響，就會打破了這一平衡，影響到妊娠結局。池永斌等[10]研究表明，復發性流產者蛻膜組織的NK細胞受體免疫球蛋白樣受體2DL4、免疫球蛋白樣轉錄物2、免疫球蛋白樣轉錄物4表達下調就影響孕期蛻膜化和免疫細胞活化變化，引起流產。梁彤等[11]研究表明Bcl-2在妊娠期糖尿病、妊娠期糖耐量組胎盤絨毛細胞中表達少于正常組，Bax、Fas表達量低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。說明Bcl-2、Bax、Fas在胎盤中的異常表達導致胎盤細胞過度凋亡，從而導致不良妊娠結局。Qi等[12]報道，復發性流產者的滋養層細胞中能檢測到大量的凋亡細胞。賀子秋等[13]實驗結果表明外界因素致妊娠鼠流產中絨毛滋養層細胞凋亡較正常鼠高。郭冬瑾等[14]報道，在絨毛組織細胞凋亡指數試驗中，自然流產組明顯高于對照組(P<0.05)，絨毛組織細胞中Bcl-2陽性率下降，Bax陽性率增高，其比值升高，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。本研究結果表明，試驗組絨毛組織Bcl-2表達百分比低于對照組，Bax表達百分比顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；試驗組蛻膜組織Bcl-2蛋白表達百分比顯著高于對照組，Bax蛋白表達量也高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。Bcl-2與Bax調節細胞凋亡的機制可能通過以下方面實現：①Bcl-2家族蛋白通過精確改變線粒體膜的通透性來調節促凋亡因子的釋放，從而促進細胞凋亡；②Bcl-2家族蛋白通過誘導線粒體使其孔道開放，與Bax形成同源二聚體來降低線粒體外面的穩定性，促進細胞色素C的釋放，激活Caspase-9等，進一步激活Caspase-3產生級聯反應，從而導致大量細胞凋亡[4]。

p53蛋白作為轉錄因子，通過調節多個基因表達來維持細胞的完整性，同時具有誘導細胞分化和細胞凋亡的作用[15]。有研究表明，p53蛋白參與了細胞凋亡發生的機制，p53作為調節基因，當p53與Bax的結合位點結合以后就可以調控Bcl-2、Bax的表達，從而促進細胞凋亡[16]。本研究結果表明，試驗組絨毛和蛻膜組織的p53蛋白表達百分比高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。p53與Bax在自然流產中絨毛和蛻膜組織表達的一致性，說明p53參與了Bcl-2/Bax誘導的細胞凋亡，從而導致早孕流產的發生。p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導細胞凋亡中發揮著極其重要的作用。5氟尿嘧啶處理人結腸癌細胞后p53表達升高，激活Bcl-2相關蛋白，最終導致凋亡發生;另外，博來霉素通過誘導神經元細胞的DNA損傷，進而激活p53依賴途徑的細胞凋亡[17]。Bcl-2蛋白能夠編碼Bid,而p53能夠通過Bid的表達上調，調節下游靶基因參與p53介導的細胞凋亡過程，p53還可以通過Bax的活化促進Bax蛋白插入到線粒體膜中，從而使線粒體的通透性增加，導致細胞凋亡[18]?？傊?，p53是已經研究證實了的腫瘤抑制基因，其在控制細胞周期、細胞凋亡及腫瘤的發生發展過程中起著非常大的作用，其決定性的機制有待于進一步研究。

綜上所述，Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表達失調可能與輔助生殖早孕期流產有關。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-12-06；

2017-03-23

河北省醫學科學研究重點課題(ZD20140386)

安彥玲(1970-)，女，河北行唐人，河北省石家莊市第六醫院主治醫師，醫學學士，從事婦產科疾病診治研究。

R339.2

B

1007-3205(2017)05-0610-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.028