姜黃素對非小細胞肺癌A459細胞增殖及CDH13甲基化狀態的影響

趙瑩，李英姿

(徐州市中醫院，江蘇徐州221009)

姜黃素對非小細胞肺癌A459細胞增殖及CDH13甲基化狀態的影響

趙瑩，李英姿

(徐州市中醫院，江蘇徐州221009)

目的 觀察姜黃素對非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞DNA甲基化轉移酶(Dnmts)活性和抑癌基因人H-鈣黏蛋白(CDH13)的影響，探討姜黃素的去甲基化機制。方法 將A549細胞分為兩組，觀察組加入40 μmol/L姜黃素和培養液，對照組僅加入培養液。采用MTT法檢測兩組細胞增殖能力，RT-PCR方法檢測CDH13 mRNA表達，甲基化特異性PCR(MSP)檢測CDH13啟動子CpG島的甲基化狀態，酶活性連續循環比色法檢測Dnmt1、Dnmt3b活性。結果 觀察組和對照組的細胞增殖OD值分別為0.638±0.184、0.859±0.040，觀察組低于對照組(P<0.05)。兩組CDH13 mRNA的相對表達量分別為0.64±0.09、0.43±0.12，觀察組高于對照組(P<0.05)。對照組出現甲基化擴增條帶，無去甲基條帶；觀察組除甲基化條帶外，出現去甲基化條帶。觀察組和對照組每mg核蛋白中Dnmt1的活性分別為(0.153±0.016)、(0.770±0.014)μmol/min，Dnmt3b的活性分別為(0.137±0.020)、(0.179±0.013)μmol/min，觀察組Dnmt1、Dnmt3b活性均較對照組下降(P均<0.05)。結論 姜黃素可通過降低Dnmts活性來抑制CDH13的甲基化狀態，從而抑制A549細胞增殖。

非小細胞肺癌；姜黃素；甲基化轉移酶；人H-鈣黏蛋白；細胞增殖

DNA異常甲基化是誘發肺癌的重要原因。DNA甲基化是通過三種DNA甲基化轉移酶(Dnmts)Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的催化實現的，其中Dnmt1、Dnmt3b的轉錄和活性增加是引起抑癌基因啟動子CpG島高甲基化的原因之一[1]。由于CpG島甲基化導致抑癌基因失活是一個可逆轉的表觀遺傳學基因修飾過程，去甲基化修飾可直接恢復抑癌基因的功能[2]，因此Dnmts成為腫瘤治療的熱點靶向分子。阻斷Dnmts能夠阻止啟動子CpG島的甲基化，抑癌基因重新表達，從而抑制腫瘤生長。姜黃素是一種有效的抑癌中藥提取物，對抑癌基因具有潛在的去甲基化作用[3，4]。2015年9月～2016年5月，我們應用姜黃素處理非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞，由于A549細胞中抑癌基因人H-鈣黏蛋白(CDH13)是完全甲基化狀態[5]，因此以CDH13為信號，觀察姜黃素的去甲基化效果，同時觀察Dnmt1、Dnmt3b活性的變化，探討姜黃素對A549細胞的去甲基化機制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞株購自上海細胞生物所。姜黃素粉劑為美國Sigma公司產品(純度為98%，將其加入二甲基亞砜配置成10 mmol/L的溶液，-20 ℃避光存儲，用前加入RPMI1640稀釋至40 μmol/L)、通用型基因甲基化檢測試劑盒、Dnmt1和Dnmt3b活性檢測試劑盒購自上海Genmed公司；總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent為美國Invitrogen公司產品；RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產品；DNA抽提試劑盒為美國Omega Bio-tec公司產品；RPMI1640培養基、核蛋白提取試劑盒及實驗相關引物合成由南京凱基生物公司提供。

1.2 細胞培養 A549細胞株培養于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2。每2日換液1次，每3～4日消化傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用MTT法。取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔培養板，每孔100 μL。將細胞分為兩組，每組設6個復孔。觀察組加入30 mL培養液及40 μmol/L姜黃素30 μL，對照組加入30 mL培養液。孵育24 h后，棄培養液，重復以上步驟二次處理細胞，加入3 mL清洗液清洗。收集細胞，加入MTT液(5 g/L)10 μL，37 ℃孵育4 h后加入100 μL二甲基亞砜孵育15 min，振蕩器振蕩10 min充分溶解，于分光光度儀上測定各孔490 nm處的吸光度OD值，減去空白孔的OD值，作為觀察結果。

1.4 CDH13 mRNA和甲基化檢測以及Dnmts活力檢測

1.4.1 細胞培養與分組處理 取對數生長期細胞接種于培養瓶中，37 ℃培養箱孵育24 h。將細胞分為觀察組和對照組，觀察組加入30 mL培養液及40 μmol/L姜黃素30 μL，對照組加入30 mL培養液，孵育24 h后，棄培養液；重復以上步驟二次處理細胞，加入3 mL清洗液清洗，收集細胞用于以下實驗。

1.4.2 CDH13 mRNA表達檢測 采用半定量RT-PCR方法。兩組分別收集1×106個細胞，加入TRIzol提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA。使用CDH13特異性引物進行PCR擴增，以β-actin作為內參。CDH13引物序列上游5′-GCAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC-3′，下游5′-AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC-3′，退火溫度60 ℃，產物片段為393 bp。β-actin引物序列:上游5′-GAGAGGGAACTCGTGCGTGAC-3′，下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，退火溫度55 ℃，產物片段為452 bp。取反應產物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析。計算目的基因與β-actin的光密度比值作為CDH13 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4.3 CDH13啟動子CpG島的甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR(MSP)方法。收集兩組細胞，使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計鑒定。使用甲基化檢測試劑盒對提取的DNA進行磺化修飾和純化，轉化后的DNA樣本溶于20 μL TE溶液中，-20 ℃保存。按照甲基化檢測試劑盒說明書進行MSP檢測，反應體系共25 μL，包括轉化后的DNA模板1 μL(100 ng)，15 mL擴增液，CDH13甲基化或去甲基化上下游引物各1 μL，雙蒸水7 μL補齊反應體系總量至25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。CDH13甲基化引物序列:上游5′-TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC-3′，下游5′-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3′；CDH13去甲基化引物序列:上游5′-TTGTGGGGTTTGTTTTTTGT-3′，下游5′-AACTTTTCATTCATACACACA-3′。退火溫度54 ℃，產物片段均為243 bp。取反應產物行瓊脂糖凝膠電泳。以人類胎盤組織DNA經甲基化酶SssⅠ轉化后作為甲基化的陽性對照，健康人淋巴細胞DNA作陰性對照，雙蒸水作空白對照。

1.4.4 Dnmt1、Dnmt3b活性檢測 使用核蛋白提取試劑盒提取兩組細胞中的核蛋白，考馬斯亮藍法測定提取液蛋白濃度。用Dnmt1、Dnmt3b活性酶連續循環比色法定量檢測試劑盒，取20 μg核蛋白檢測處理前后細胞中Dnmt1、Dnmt3b的活性。Dnmts的特異性活性=樣本總活性-樣本非特異性活性。1個單位活性代表Dnmts在37 ℃，pH 8.0條件下，1 min可轉移1 μmol S-腺苷甲硫氨酸甲基到半鏈甲基化寡核苷酸分子上。計算每mg核蛋白所含Dnmts的單位活性。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 觀察組和對照組的相對OD值分別為0.638±0.184、0.859±0.040，觀察組低于對照組(P<0.05)。

2.2 兩組CDH13 mRNA表達檢測 觀察組與對照組CDH13 mRNA的相對表達量分別為0.64±0.09、0.43±0.12，觀察組高于對照組(P<0.05)。

2.3 兩組CDH13甲基化狀態比較 見圖1?？瞻讓φ諢o甲基化和去甲基化產物；陰性對照可見去甲基化擴增條帶(1u，243 bp)；陽性對照可見甲基化擴增條帶(2m，243 bp)。對照組可見甲基化擴增條帶(4m)，無去甲基條帶；觀察組除甲基化條帶(3m)外，出現去甲基化條帶(3u)。提示CDH13的啟動子CpG島在姜黃素的作用下發生了去甲基化。

注：0為空白對照，1為陰性對照，2為陽性對照，3為觀察組，4為對照組。M為Marker，m為甲基化擴增，u為非甲基化擴增。

圖1 MSP檢測細胞處理前后CDH13基因啟動子的甲基化狀態

2.4 兩組Dnmts活性比較 觀察組和對照組每mg核蛋白中Dnmt1的活性分別為(0.153±0.016)、(0.770±0.014)μmol/min，Dnmt3b的活性分別為(0.137±0.020)、(0.179±0.013)μmol/min，觀察組Dnmt1、Dnmt3b活性均較對照組明顯下降(P均<0.05)。

3 討論

DNA的甲基化和去甲基化修飾是重要的表觀遺傳學調控方式。DNA甲基化通過Dnmts催化實現，其中Dnmt1是主要的維持甲基化酶，Dnmt3b則催化從頭甲基化，它們與正常的胚胎發育、衰老和腫瘤發生關系密切[2]。研究表明，Dnmts在腫瘤組織和腫瘤細胞系中呈過度表達[6]，抑制或選擇性沉默Dnmts可抑制腫瘤生長[7]。這種表觀遺傳學調控是可逆轉的，因此尋找有效的去甲基化藥物能夠為腫瘤的靶向治療提供新的方向。目前發現的去甲基化藥物包括核苷類、氨基苯甲酸類、肼類、茶多酚類等，以及中藥中新發現的砒霜(三氧化二砷)和姜黃素[8]。美國FDA已經批準上市了兩種核苷類去甲基化藥物，用于治療骨髓異常增生類疾病[7]。但由于核苷類對正常細胞的細胞毒作用，影響了其臨床應用。姜黃素作為一種低毒的中藥提取物，為尋找低毒高效的抗腫瘤藥物提供了新思路。

姜黃素是從莪術、姜黃等中草藥中提純出來的一種植物多酚，具有抗氧化、鎮痛、抗炎和抗腫瘤等作用[3]。研究顯示，姜黃素能夠抑制胰腺癌[9]、乳腺癌[10]、結腸癌[11]、肺癌[12]、肝癌[13]等腫瘤生長，其抑癌機制包括調節信號傳導途徑、誘導細胞凋亡[13]、調控細胞周期[14]等。姜黃素是一種潛在的去甲基化藥物，其對抑癌基因的去甲基化作用已引起人們的高度關注。研究顯示，姜黃素可能具有多靶點的抗腫瘤機制。Xu等[12]發現，姜黃素衍生物可以誘導肺癌細胞自噬，促進其凋亡，這與抑制Hedgehog信號傳導途徑有關，而對正常肺泡上皮細胞無毒性作用。Li等[9]發現，姜黃素可通過下調NF-κB及其下游調控因子抑制人胰腺癌細胞生長，誘導其凋亡。Ke等[14]發現，姜黃素可下調Aurora-A，抑制乳腺癌細胞的有絲分裂，使其停滯在S期及G2/M期，從而阻止乳腺癌肺轉移；姜黃素還可以增加乳腺癌細胞對順鉑、長春瑞濱等化療藥物的敏感性。

本研究應用40 μmol/L姜黃素處理A549細胞株后，發現細胞增殖受到抑制，甲基化特異性PCR提示細胞中完全甲基化的抑癌基因CDH13啟動子CpG島的甲基化狀態部分逆轉，CDH13 mRNA的轉錄水平提高。提示姜黃素對A549細胞株的抑制作用與其去甲基化作用有關，在此過程中Dnmt1和Dnmt3b的催化活性下降，說明姜黃素可能通過抑制Dnmt1和Dnmt3b的催化活性發揮去甲基化作用，Dnmts活性下降提示姜黃素在蛋白水平抑制了Dnmts的作用。Liu等[4]研究認為，姜黃素的去甲基化作用可能通過與Dnmt1的巰基共價結合而實現的，Dnmt1的甲基轉移位點被姜黃素占據，導致其轉移甲基的效率下降，妨礙了基因啟動子的甲基化修飾，從而起到去甲基化作用。Liu等[15]發現，姜黃素的衍生物雙去甲氧基姜黃素可以使A549細胞株中的抑癌基因WIF-1表達增加，具有較強的去甲基化作用。Chamani等[10]發現，使用姜黃素衍生物處理肝癌細胞株后，Dnmts的轉錄水平提高，抑癌基因miR-34家族miR-34a、miR-34b和miR-34c的轉錄也明顯上升。以上研究表明，姜黃素對癌細胞株的去甲基化作用可能是通過多種途徑實現的。

綜上所述，姜黃素具有去甲基化作用，能夠提高抑癌基因CDH13的表達，降低甲基化轉移酶Dnmts的活性。由于腫瘤的發生發展及抗癌藥物的作用機制極其復雜，體外腫瘤細胞株的研究不能完全復制體內腫瘤細胞的生活狀態。因此,姜黃素的去甲基化作用還需要更多的實驗支持。此外，姜黃素的生物利用度低、穩定性差、在體內代謝快等缺陷，在一定程度上影響了其應用。姜黃素的多種天然和合成的衍生物，如去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃、含氮雜環姜黃素等，較姜黃素更穩定，抗腫瘤作用也得到了實驗驗證[14]。我們下一步的研究將著重于姜黃素及其衍生物在動物體內的去甲基化作用，期待以姜黃素作為前體的衍生物成為一種高效、低毒的靶向治療藥物，在腫瘤治療領域發揮更重要的作用。

[1] Rhee I, Bachman KE, Park BH, et al. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J]. Nature, 2002,416(6880):552-556.

[2] Klutstein M, Nejman D, Greenfield R, et al. DNA Methylation in Cancer and Aging[J]. Cancer Res, 2016,76(12):3446-3450.

[3] Shehzad A, Lee J, Lee YS. Curcumin in various cancers[J]. Biofactors, 2013,39(1):56-68.

[4] liu Z, Xie Z, Jone W, et al. Curcumin is a potent DNA hypomethylation agent[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2009,19(3):706-709.

[5] Daskalos A, Oleksiewicz U, Filia A, et al. UHRF1-mediated tumor suppressor gene inactivation in nonsmall cell lung cancer[J]. Cancer, 2011,117(5):1027-1037.

[6] Schmidt WM, Sedivy R, Forstner B, et al. Progressive up-regulation of genes encoding DNA methyltransferases in the colorectal adenoma-carcinoma sequence[J]. Mol Carcinog, 2007,46(9):766-772.

[7] Ghoshal K, Bai S. DNA methyltransferases as targets for cancer therapy[J]. Drugs Today(Barc),2007,43(6):395-422

[8] 陳淑瑜.DNA去甲基化藥物研究現狀[J].齊齊哈爾醫學院學報,2013,34(4):559-561.

[9] Li L, Aggarwal B, Shishodia S, et al. Nuclear factor-kappaB and ikappaB kinase are constitutively active in human pancreatic cells, and their down-regulation by curcumin (diferuloylmethane) is associated with the suppression of proliferation and the induction of apoptosis[J]. Cancer, 2004,101(10): 2351-2362.

[10] Bimonte S, Barbieri A, Palma G, et al. Dissecting the role of curcumin in tumour growth and angiogenesis in mouse model of human breast cancer[J]. Biomed Res Int, 2015(2015),878134.

[11] Half E, Arber N. Colon cancer: preventive agents and the present status of chemoprevention[J]. Expert Opin Pharmacother, 2009,10(2):211-219.

[12] Xu J, Yang H, Zhou X. et al. Autophagy accompanied with bisdemethoxycurcumin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer cells[J]. Biomed Environ Sci, 2015,28(2):105-115.

[13] Chamani F, Sadeghizadeh M, Masoumi M, et al. Evaluation of MiR-34 family and DNA methyltransferases 1, 3A, 3B gene expression levels in hepatocellular carcinoma following treatment with dendrosomal nanocurcumin[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016,17:219-224.

[14] Ke CS, Liu HS, Yen CH, et al. Curcumin-induced Aurora-A suppression not only causes mitotic defect and cell cycle arrest but also alters chemosensitivity to anticancer drugs[J]. J Nutr Biochem, 2014,25(5):526-539.

[15] Liu YL, Yang HP, Gong L, et al. Hypomethylation effects of curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin on WIF-1 promoter in non-small cell lung cancer cell lines[J]. Mol Med Rep, 2011,4(4):675-679.

Effect of curcumin on proliferation and CDH13 methylation status of non-small-cell lung cancer cell line A549

ZHAOYing,LIYingzi

(XuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xuzhou221009,China)

Objective To observe the effect of curcumin on DNA methyltransferase (Dnmts) activity and tumor suppressor gene human H-cadherin (CDH13) in non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cells and to explore the mechanism of curcumin's demethylation.Methods A549 cells were divided into two groups: the observation group and the control group. Cells in the observation group were cultured with 40 μmol/ L curcumin and the culture medium, while cells in the control group only with the culture medium. MTT assay was used to detect the cell proliferation, and RT-PCR was used to detect the expression of CDH13 mRNA. CpG island methylation status of CDH13 promoter was detected by methylation-specific PCR (MSP), and catalytic activity of Dnmts was detected by enzyme colorimetric determination kit. Results The OD of the observation group was 0.638±0.184, which was lower than that (0.859±0.040) of the control group (P<0.05). The relative expression level of CDH13 mRNA in the observation group was 0.64±0.09, which was higher than that (0.43±0.12) of the control group. There were methylation amplification bands, but no demethylation bands in the control group, and there were both methylation amplification bands and demethylation bands in the observation group. In the observation group and the control group, the activities of Dnmt1 were separately (0.153±0.016) and (0.770±0.014) μmol/min, and the activities of Dnmt3b were (0.137±0.020) and (0.179±0.013) μmol/min, respectively. The activities of Dnmt1 and Dnmt3b in the observation group were lower than those in the control group (allP<0.05). Conclusion Curcumin inhibits the methylation status of CDH13 by decreasing the activity of Dnmts, and thereby inhibits A549 cell proliferation.

non-small-cell lung cancer; curcumin; methyltransferase; human H-cadherin; cell proliferation

江蘇省中醫藥局科技項目(YX1230)。

趙瑩(1986-)，女，主治醫師，主要研究方向為呼吸道腫瘤的診治。E-mail： njmuzy@126.com

李英姿(1968-)，女，主任醫師，主要研究方向為腫瘤的中醫診治。E-mail： lblyz652@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.003

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0009-04

2016-08-16)