蓽茇酰胺對人肺腺癌A549細胞輻射敏感性的影響

肖楠，徐黨輝，潘志堯，姚志峰

(1江蘇聯合職業技術學院南京衛生分院，南京210038；2南京中醫藥大學第一附屬醫院；3浙江大學醫學院；4南京醫科大學第二附屬醫院)

蓽茇酰胺對人肺腺癌A549細胞輻射敏感性的影響

肖楠1，徐黨輝2，潘志堯3，姚志峰4

(1江蘇聯合職業技術學院南京衛生分院，南京210038；2南京中醫藥大學第一附屬醫院；3浙江大學醫學院；4南京醫科大學第二附屬醫院)

目的 探討蓽茇酰胺對人肺腺癌A549細胞輻射敏感性的影響。方法 體外培養人肺腺癌A549細胞，分別加入1、2、4、8、16 μmol/L蓽茇酰胺作用24、48、72 h，采用CCK-8法檢測各組細胞增殖抑制率，篩選出對A549細胞毒性最低的濃度。將A549細胞分為空白對照組、蓽茇酰胺組、單純照射組以及聯合處理組，空白對照組不做處理，蓽茇酰胺組加入1 μmol/L蓽茇酰胺，單純照射組給予8 Gy X線照射，聯合處理組先給予1 μmol/L蓽茇酰胺作用48 h后再給予8 Gy X線照射。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖抑制率，流式細胞術觀察各組細胞周期及凋亡情況。結果 不同濃度蓽茇酰胺處理A549細胞24、48、72 h后，1 μmol/L蓽茇酰胺的細胞增殖抑制率均低于其他各組(P均<0.05)。聯合處理組48 h時的細胞增殖抑制率高于單純照射組和蓽茇酰胺組(P均<0.05)。聯合處理組G0/G1期細胞比例較單純照射組增多,而S期細胞比例減少，細胞凋亡率高于單純照射組(P均<0.05)。結論 1 μmol/L蓽茇酰胺能夠增加A549細胞對X射線的輻射敏感性，其機制可能與促進細胞增殖抑制、誘導細胞凋亡、引起細胞G0/G1期阻滯有關。

蓽茇酰胺；肺腺癌；X射線；輻射敏感性；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

蓽茇酰胺是從胡椒科植物蓽茇的根中提取的酰胺類化合物，具有鎮痛、鎮靜、抗炎、抗焦慮、抗抑郁、抗腫瘤等多種生理及藥理活性[1～8]。我們的前期研究發現，蓽茇酰胺對三陰性乳腺癌細胞具有輻射增敏效應[9]。2015年7～10月，我們觀察了蓽茇酰胺對肺腺癌A549細胞輻射敏感性的影響，為蓽茇酰胺作為輻射增敏劑擴大應用范圍提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞由東南大學吳健雄重點實驗室惠贈。蓽茇酰胺用二甲基亞砜配成5 mmol/L的儲備液，過濾除菌，-20 ℃保存。使用時用無血清培養基逐級稀釋至設定的實驗濃度。高糖DMEM培養基、0.25%胰酶、PBS、青-鏈霉素溶液為Gibco公司產品；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；二甲基亞砜、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒為南京凱基公司產品；余為國產分析純試劑。

1.2 細胞培養 取A549細胞加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養液，置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，單層貼壁生長，每2～3日傳代1次。取對數生長期細胞，加入0.25%胰酶消化，制成5×104/mL的單細胞懸液。

1.3 蓽茇酰胺對A549細胞毒性最低濃度的確定 將A549細胞懸液接種到96孔板。培養24 h后，更換培養液，分別加入1、2、4、8、16 μmol/L蓽茇酰胺250 μL，每個濃度設5個復孔。繼續培養24、48、72 h。于實驗終止前4 h加入CCK8試劑10 μL，置培養箱內培養4 h，于450 nm波長處用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度OD值。另設空白對照組，不施加任何處理因素。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值)/(空白對照組OD值)]×100%。取細胞增殖抑制率最低的濃度用于后續實驗。

1.4 蓽茇酰胺對A549細胞輻射敏感性的影響觀察

1.4.1 細胞分組與處理 將A549細胞接種于6孔板(用于檢測細胞周期和細胞凋亡)和96孔板(用于檢測細胞增殖抑制率)，分為蓽茇酰胺組、單純照射組、聯合處理組，每組設5個復孔。蓽茇酰胺組加入毒性最低濃度的蓽茇酰胺；單純照射組給予X線照射，輻射源為直線加速器產生的6 MV高能X線，源皮距100 cm，劑量率300 cGy/min，照射野20 cm×20 cm，細胞面覆蓋1.5 cm補償膜，常溫下照射，吸收劑量為8 Gy；聯合處理組先給予毒性最低濃度的蓽茇酰胺作用24 h后，再給予8 Gy X線照射，繼續培養24 h。另設空白對照組，不施加任何處理因素。

1.4.2 細胞增殖抑制率檢測 先給予毒性最低濃度的蓽茇酰胺作用24 h后，再給予8 Gy X線照射，繼續培養24 h。采用CCK8法檢測細胞增殖抑制率，具體方法同1.3。

1.4.3 細胞周期和細胞凋亡檢測 取3組細胞分別加入0.25%胰酶消化，離心收集細胞。取一部分細胞加入70%冰乙醇固定，4 ℃過夜，依次加入1 mg/mL核糖核酸酶10 μL、0.5 mg/mL碘化丙啶(PI)50 μL，4 ℃避光染色30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期；另一部分細胞經AnnexinV-FITC和PI雙染色，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 蓽茇酰胺對A549細胞毒性最低濃度 不同濃度蓽茇酰胺處理A549細胞24、48、72 h后，1 μmol/L蓽茇酰胺的細胞增殖抑制率均低于其他各組(P均<0.05)，1 μmol/L蓽茇酰胺對A549細胞的增殖抑制作用最弱。見表1。

表1 不同濃度蓽茇酰胺對A549細胞的增殖抑制率比較

注：與1 μmol/L組比較，*P<0.05。

2.2 蓽茇酰胺聯合X射線照射對A549細胞增殖的影響 空白對照組、蓽茇酰胺組、單純照射組和聯合處理組的細胞增殖抑制率分別為0、11.25%±1.11%、13.32%±1.52%、43.46%±2.73%，聯合處理組高于其他各組(P均<0.05)。

2.3 各組G0/G1期、S期細胞比例及細胞凋亡率比較 聯合處理組G0/G1期細胞比例較單純照射組增多，而S期細胞較單純照射組減少(P均<0.05)；聯合處理組細胞凋亡率高于單純照射組(P均<0.05)。見表2。

3 討論

研究表明，蓽茇酰胺可顯著抑制膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病細胞等多種實體瘤和血液系統腫瘤的生長增殖[2]，誘導腫瘤細胞凋亡[10，11]，并能干擾細胞周期進程[11，12]，而腫瘤細胞的輻射敏感性與細胞凋亡以及細胞在增殖周期各時相的分布密切相關。本研究結果表明，蓽茇酰胺在體外能抑制肺腺癌A549細胞增殖，且隨濃度增加、作用時間延長，其抑制作用逐漸增強。

表2 各組細胞G0/G1期、S期細胞比例及細胞凋亡率比較±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與單純照射組比較，△P<0.05。

不恰當的細胞增殖是腫瘤的特征之一，因此不少抗腫瘤藥物作用于細胞周期調控點，以此減少腫瘤細胞的分裂增殖。細胞的分裂在調節細胞功能中發揮重要作用。Jyothi等[11]報道，蓽茇酰胺處理過的小鼠胚胎癌細胞被阻滯在G1期。Kong等[12]發現，不同濃度的蓽茇酰胺作用于前列腺癌PC-3細胞后，相當一部分細胞被阻滯于G2/M期，且PC-3細胞的生長抑制作用與G2/M期阻滯相關。本研究顯示，蓽茇酰胺能使A549細胞阻滯于G0/G1期，表明蓽茇酰胺作用后的細胞倍增時間明顯延長，處于靜止期(G0期)的細胞明顯增多，細胞周期進程明顯減緩，最終使細胞增殖速度減慢，凋亡明顯增多，細胞凋亡前選擇性的G1期阻滯預示著DNA合成階段受阻。本研究篩選出蓽茇酰胺對A549細胞毒性最低的濃度為1 μmol/L，將其與X射線聯合作用后，明顯增加了細胞增殖抑制率，即在無明顯毒性作用的劑量下提高了A549細胞的輻射敏感性。蓽茇酰胺能使A549細胞阻滯于G0/G1期，同時明顯降低S期細胞比例，而G2/M期細胞沒有明顯變化，提示蓽茇酰胺可引起A549細胞周期阻滯，通過改變細胞周期時相的分布而發揮輻射增敏作用。蓽茇酰胺先作用于A549細胞后再進行一定劑量的X線照射，同樣出現明顯的G0/G1期阻滯效應，并且消除了X線對細胞輕度的G2/M期阻滯作用。說明蓽茇酰胺的輻射增敏機制是通過增加凋亡最敏感的G0/G1期細胞比例，降低輻射抗拒的S期細胞，而不是增加輻射敏感的G2/M期細胞比例實現的。

細胞受到輻射后凋亡是其主要的死亡形式，腫瘤對放療抵抗的原因之一就是腫瘤細胞對凋亡產生了抵抗性[13]。流式細胞術檢測細胞凋亡的結果表明，蓽茇酰胺除自身能誘導肺腺癌A549細胞凋亡外，還能增強輻射對肺腺癌細胞凋亡的誘導作用，聯合處理組較單純照射組細胞凋亡率顯著增加。前文述及蓽茇酰胺使細胞周期阻滯于G1期，因處于該期的細胞受照射后未能完全修復，易發生凋亡，因此凋亡細胞比例明顯提高。一般而言，凋亡反應的增加預示細胞對于輻射更加敏感[14，15]。本實驗聯合處理組的細胞凋亡率較單純照射組顯著增加，說明蓽茇酰胺很可能增加了輻射所致的細胞凋亡。Kong等[12]研究發現，用蓽茇酰胺處理的前列腺癌PC-3細胞出現空泡化以及染色體濃集現象等細胞凋亡的典型表現，并檢測到Caspase-3活性升高，證實蓽茇酰胺能促進前列腺癌細胞的凋亡，進一步研究發現蓽茇酰胺未明顯改變Bax的表達，但使Bcl-2表達下降、Bax/Bcl-2比值下降，而腫瘤細胞Bax/Bcl-2的表達程度與其輻射敏感性呈正相關[16]。蓽茇酰胺是否也通過凋亡抑制蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相對表達量的改變誘導A549細胞凋亡的發生，進而表現出輻射增敏效應值得進一步研究。

研究發現，蓽茇酰胺對多種腫瘤細胞株的增殖有明顯抑制作用的同時，對正常細胞的增殖無影響或影響很小[2，5]。本研究顯示，蓽茇酰胺明顯抑制A549細胞增殖，而且有效抑制濃度處于微摩爾水平，劑量很小，毒性反應可能較輕。理想的放射增敏劑應能顯著增加腫瘤細胞的放療療效，而對正常組織沒有或很少有不良反應，從這一點來看，蓽茇酰胺具備明顯優勢，值得進一步深入研究。

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Effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAONan1,XUDanghui,PANZhiyao,YAOZhifeng

(1NanjingHealthSchoolofJiangsuUnionTechnicalInstitute,Nanjing210038,China)

Objective To investigate the effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 1, 2, 4, 8 and 16 μmol/L piplartine for 24, 48 and 72 h. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group and then we selected the minimum concentration which had no obvious toxic effect on A549 cells. A549 cells were divided into four groups: the control, piplartine group, radiation group and the combination treatment group. The control group was not treated. The piplartine group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine, the radiation group was given X-ray radiation of 8 Gy alone, and the combination treatment group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine for 48 h, then was exposed to X-ray radiation of 8 Gy. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group. Cell cycle and apoptosis of A549 cells were analyzed by flow cytometry (FCM).Results After being treated with piplartine for 24, 48 and 72 h, the proliferation inhibition rate of the piplartine group was lower than that of the other groups (allP<0.05). The proliferation inhibition in the combination treatment group was higher than that of the radiation group and the piplartine group at 48 h (allP<0.05). The percentage of cells in the G0/G1phase of the combination treatment group was significantly increased, and was decreased in the S phase, and apoptosis rate was also higher than that of the radiation group (P<0.05).Conclusion Piplartine at the concentration of 1 μmol/L can enhance the radio-sensitivity of A549 cells, which may be associated with the enhancement of radiation-induced inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis as well as cell arrest in G0/G1phase.

piplartine; pulmonary adenocarcinoma; X-ray; radio-sensitization; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

肖楠(1984-)，男，碩士，講師，主要研究方向為胸部影像診斷學。E-mail： 15996301027@126.com

姚志峰(1986-)，男，碩士，主治醫師，主要研究方向為腫瘤的放射治療。E-mail： yzf058565@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.004

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0013-04

2016-08-05)