基于MAPK通路研究五味甘露藥浴散加減方治療類風濕關節炎的藥效機制

左芳　韋婷　童東　張藝　陳小?！≡?/p>

[摘要] 研究發現五味甘露藥浴散加減方藥浴有良好的抗炎活性，可以明顯改善關節炎癥程度，對類風濕性關節炎具有一定的治療作用，推測其可能與調控滑膜細胞MAPK通路有關。該實驗通過建立佐劑關節炎大鼠（AA）模型，進一步探討其調控滑膜細胞MAPK通路的機制。采用酶聯免疫法測定給藥2周AA大鼠血清中TNFα的水平，免疫組化法測定給藥4周踝關節滑膜組織蛋白激酶ERK1/2，p38的含量，采用熒光定量PCR（RTPCR）法檢測膝關節滑膜組織中JNK1，ERK1，p38的mRNA表達。結果顯示，與模型組比較，給藥2周，可明顯降低AA大鼠血清中TNFα的水平（P<0.05）；給藥4周，降低踝關節滑膜組織中p38，ERK1/2的蛋白表達（P<0.05或P<0.01），降低膝關節滑膜組織JNK1，p38，ERK1的基因表達（P<0.05或P<0.01）。綜上可見，五味甘露藥浴散加減方有效治療類風濕關節炎的作用機制可能與其降低血清中TNFα的水平和滑膜組織中p38，ERK1/2的表達以及JNK1，p38，ERK1的基因表達，調控MAPK通路有關。

[關鍵詞] 五味甘露藥浴散加減方； 佐劑型關節炎； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

Pharmacodynamic mechanism of modified Ganlu Yaoyu San intreatment of

rheumatoid arthritis based on MAPK signaling pathway

ZUO Fang， WEI Ting， TONG Dong， ZHANG Yi*， CHEN Xiaorui， ZENG Yong

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] According to the findings， modified Ganlu Yaoyu San has a good antiinflammatory activity， and can significantly alleviate the degree of arthritis. Its therapeutic effect for rheumatoid arthritis may be related to the regulation of MAPK pathway of synovial cells. In the study， the rat adjuvant arthritis（AA） model was established to further investigate the pharmacodynamic mechanism for regulating MAPK pathway of synovial cells. Enzymelinked immune assay was used to determine the serum TNFα level of AA rats administered with drug for two weeks， synovial tissue protein kinases ERK1/2 and p38 content were determined by immunohistochemistry， synovial tissue JNK1， ERK1， p38 gene（mRNA） expression were detected with fluorescence quantitative PCR（RTPCR） method. According to the results， after administration for two weeks， the levels of serum TNFα of AA rat was significantly decreased（P<0.05）. After administration for four weeks， the protein expressions of p38 and ERK1/2 in synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）， the gene expressions of JNK1， p38 and ERK1 in knee joint synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）. In conclusion， modified Ganlu Yaoyu San can effectively treat rheumatoid arthritis. Its mechanism might be related to the reduction of TNFα levels in serum， protein expression of p38 and ERK1/2 in synovial tissue， and JNK1， p38 and ERK1 gene expressions， and regulation of MAPK pathway.

[Key words] modified Ganlu Yaoyu San； adjuvant arthritis； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因未明的慢性破壞性關節病變疾病，屬于全身性自身免疫性疾病，以對稱性、進展性、多關節滑膜炎和關節外病變為主要臨床表現[12]。藏藥浴療法是藏醫治療風濕、類風濕性關節炎的常用手段[3]。五味甘露方是藏藥浴的基礎配方，最早記載于藏醫經典巨著《四部醫典》[4]。臨床應用最多的是五味甘露藥浴散加減方。研究表明五味甘露顆粒能抑制各種炎癥模型所致炎癥[5]，尤其對寒濕痹阻型類風濕關節炎療效顯著。韋婷等[67]通過建立大鼠AA模型，研究五味甘露藥浴散加減方的抗炎活性，結果表明其能有效減小AA大鼠致炎側足跖腫脹度，改善致炎側踝關節滑膜病理改變，提示五味甘露藥浴散加減方藥浴有良好的抗炎活性，對類風濕性關節炎具有一定的治療作用。研究發現，細胞間網絡信號通路轉導異常引發的滑膜、關節等全身結締組織的破壞和解聚是RA主要的病理基礎，滑膜細胞的信號通路異常轉導是其重要的發病機制之一[810]?；ぜ毎倪^度異常增生、凋亡受阻和炎癥細胞的激活、浸潤是導致關節滑膜炎癥持續存在的原因，絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號轉導通路中的各種信號蛋白激酶都不同程度的參與了以上病理過程[1112]。故本實驗在前期研究基礎上擬通過建立AA模型，基于MAPK通路進一步探討五味甘露藥浴散加減方治療類風濕關節炎的相關藥效機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠（SPF級），體重（200±20） g，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（川）201324。

1.2 藥品與試劑 受試藥物：五味甘露藥浴散加減方由西藏藏醫學院制備，外觀為棕褐色固體粉末，有刺鼻香味。經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定為五味甘露藥材。方藥組成：刺柏葉Folium Junipfri 500 g，水柏葉Myricaria pulcherrima 500 g，麻黃Ephedrae Herba 500 g，大籽蒿Artemisia sieversiana 500 g，青稞Hordeum vulgare Linn 100 g，峨參Anthriscus sylvesteis 10 g，喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica Edgew.Heim 10 g，蒺藜Tribulus terrestris 10 g，黃精Polygonati Rhizoma 10 g，乳香Olibanum 10 g，天冬Asparagus cochinchinensis 10 g，決明子Cassiae Semen 10 g，黃葵子Belmoschus manihot L.Medic 10 g，堿花Saponaria officinalis 10 g，甘松Nardostachys chinensis Batal 10 g，巖精Bragzhun 10 g，寒水石Gypsum Rubrrum 10 g，黃硫磺Sulfur 10 g。功能發汗解表，消炎，平黃水，舒筋通絡，活血止痛。臨床上常用0.04 g·mL-1藥液浸泡全身或組織。藥液制備：將五味甘露藥各取等份同時放入容器中，注入開水，浸泡1夜后，拌勻，加熱、煮沸，至水分全部吸入藥材中。發酵藥物冷卻至與皮膚溫度相近時加入酵母或酒糟，重新裝入容器內并密封，置20 ℃左右的室內發酵3 d后，聞之，既有酒味，又有酸味和藥味時即可。發酵好的藥材中加入適量水，放置1 d，提取出藥液，如此連續操作3次，至第3天把3份提取液混合即可。

醋酸地塞米松（國藥準字H33020822，批號130123，浙江仙琚制藥股份有限公司，規格0.75 mg/片）；完全弗氏佐劑（Freund′s adjuvant complete，Sigma公司，批號#SLBF 9338V，規格1 g·L-1滅活結核桿菌）；卡介苗凍干粉（上海瑞楚生物科技有限公司，批號201409，規格60 mg/支）。TNFα ELISA試劑盒（批號YAD2015090302，北京雅安達生物技術有限公司）。

JNK1抗體，兔多克隆抗體，批號ab199380（德國默克集團密理博中國有限公司）；p38MAPK抗體，兔多克隆抗體，批號ab197348（德國默克集團密理博中國有限公司）；ERK1/2抗體，兔多克隆抗體，批號ab184699[英國abcam艾博抗（上海）貿易有限公司]；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L），批號13152A11；三抗：辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素（HRP/AV），批號13152A11；山羊血清，批號13152A11；顯色劑：濃縮型DAB試劑盒，批號K135925C，均由北京中衫金橋生物有限公司提供。

Trizol（Ambion公司，貨號15596026）；SYBR Green PCR試劑盒（TAKARA公司，貨號RR420Q）；逆轉錄試劑盒（TAKARA公司，貨號639505）；RNaseⅠ（Fermentas公司，貨號AM2295）。PCR引物由南京金斯瑞合成。

1.3 儀器 2015型轉輪式切片機[德國徠卡（Leica）儀器有限公司]；ImagePro Plus 6.0 圖像分析系統（美國Media Cybernetics公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數儀（美國Thermo公司）； Motic Images Advanced圖像分析軟件；T100Thermal Cycler PCR儀（BIORAD）；熒光定量PCR儀（RealTime System，BIORAD）；水平電泳設備DYC31D（BIORAD）；凝膠成像系統Universal Hood II（BIORAD）。

2 方法

2.1 AA大鼠模型的建立及給藥 SD健康大鼠60只，適應性飼養1周后，隨機選取10只作為正常對照組，其余50只于大鼠右后足跖皮內每只每次注射0.1 mL弗氏完全佐劑致炎，正常組在右側后肢足跖皮下注射0.1 mL生理鹽水，用足趾容積測量儀測量致炎前大鼠右后足足容積（mL）2次，取其平均值作為致炎前正常足容積作為基礎值。16 d后大鼠繼發性關節炎癥狀出現，成功誘發AA大鼠模型。將AA大鼠隨機分為模型組、地塞米松組、五味甘露藥浴散加減方高劑量組（104.00 g·L-1） 、中劑量組（52.00 g·L-1） 、低劑量組（26.00 g·L-1）。

五味甘露藥浴散加減方高、中、低劑量組每天藥浴，將大鼠固定在大鼠固定器內，用橡皮筋將固定器固定在底部直徑約32 cm，高為21 cm左右的木桶內壁上，使大鼠后肢浸泡在2 L的藥液中[高劑量組（104.00 g·L-1）、中劑量組（52.00 g·L-1）、低劑量組（26.00 g·L-1）]，將木桶放在直徑約60 cm裝有水的大水盆里，電熱棒加熱大水盆里的水使木桶中水溫控制在（40±1） ℃，每天藥浴1次，每次30 min。模型組和對照組每天同體積溫水浴，條件同藥浴組，地塞米松組每天（0.150 mg·kg-1）灌胃1次，連續給藥4周。

2.2 AA大鼠血清中炎性細胞因子的測定 給藥第14天，大鼠后眼眶靜脈取血1.5 mL，靜置10～20 min，

于3 000 r·min-1下離心10 min，分離血清，采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書，測定大鼠血清中細胞因子TNFα的含量。

2.3 AA大鼠踝關節滑膜組織ERK1/2，p38表達的測定 免疫組化法測定大鼠踝關節滑膜組織ERK1/2，p38的表達，給藥4周，大鼠麻醉取血處死，剪下致炎側足踝關節，用10%甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片，采用SP免疫組化法，一抗稀釋比為1∶200，顯色后中性樹膠封片。切片染色后，陽性表達顏色為淺黃色或棕黃色，表達主要集中在細胞漿、細胞膜或間質等，陰性表達為藍色，底色為白色。

2.4 RTPCR法測定受試藥物對AA大鼠膝關節滑膜組織JNK1，ERK1，p38基因表達的影響 給藥結束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，腹主動脈取血處死固定，鈍性分離關節囊的纖維層和滑膜層，無菌剝離完整滑膜組織，稱量，放入1.5 mL EP管中，加入質量10倍體積的RNAlater備用。cDNA鏈合成：按逆轉錄試劑盒說明書操作。取上述反轉后的cDNA，進行PCR擴增。引物序列包括：JNK1的上游引物5′TTTGGAGGAGCGAACT3′，下游引物5′GTCTGTATCCGAGGC3′；ERK1的上游引物5′GGGGTCTCCTCGTTCA3′，下游引物5′AGCCCTTCCATTCCA3′；p38的上游引物5′ CAGGGTAGTGGAGTGAT3′，下游引物5′CGTAAGGGACAGGAAT3′。

2.5 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理分析，所有指標結果均以±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 給藥14 d大鼠血清中細胞因子TNFα的含量 與正常組比較，模型組大鼠血清中TNFα含量明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，地塞米松組大鼠血清中TNFα含量明顯降低（P<0.05）；五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠血清中TNFα含量明顯降低（P<0.05），見表1。

3.2 AA大鼠踝關節滑膜組織ERK1/2，p38表達的測定 與正常組相比，模型組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯升高（P<0.01），與模型組相比，地塞米松組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯降低（P<0.01或P<0.05）；五味甘露藥浴散加減方中劑量組大鼠滑膜組p38，ERK1/2蛋白含量降低（P<0.05），五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯降低（P<0.01），見表2、圖1，2。

3.3 五味甘露藥浴散加減方對AA大鼠膝關節滑膜組織JNK1，ERK1，p38基因表達的影響 模型組大鼠膝關節滑膜中JNK1，ERK1，p38基因mRNA表達量均較正常組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，地塞米松組和五味甘露藥浴散加減方高、中劑量組JNK1，p38表達量顯著降低（P<0.01），五味甘露藥浴散加減方低劑量組JNK1，p38表達量有降低趨勢（P<0.05），各給藥組ERK1表達量顯著降低（P<0.01），見圖3。

4 討論

RA是一種以全身多關節慢性滑膜炎癥為主要表現的常見自身免疫性疾病。目前治療RA的藥物主要集中在非甾體抗炎藥、腎上腺糖皮質激素、免疫抑制劑等，但都普遍存在不良反應較多，患者耐受性差等特點，且以緩解癥狀為主[13]。五味甘露藥浴療法是水浴療法和藥物療法的結合，采用藏區道地藥材制成藥液，將病體浸泡于溫熱藥液中洗浴，利用水的溫熱作用，打開人體毛孔、疏通人體經絡，使藥物的有效成分迅速透皮滲透吸收，直達病所，再通過發汗祛風將病毒排出體外，從而達到祛病強身的目的。由于RA發病原因和機制仍未完全明確，無特效治療措施，所以構建和應用合適的RA動物模型是篩選臨床治療RA藥物、考察其治療有效性和作用機制的研究基礎。目前比較常用的RA動物模型主要有4種，其中AA模型的制備方法簡單，成功率較高，發病快，足跖腫脹明顯，有大量炎細胞浸潤，病理學改變與RA臨床表現相似，并結合課題組前期研究等各方面因素，考慮選擇使用AA大鼠模型。

細胞因子作為免疫調節介質在RA的發展過程中發揮著重要作用，TNFα由活化的單核/巨噬細胞分泌，能夠促進細胞生長以及參與免疫調節，具有多種炎性和免疫反應生物活性，是RA滑膜炎癥反應中重要的關鍵性細胞因子，幾乎所有RA炎癥環節都有它們的參與。兩者常同時分泌合成，相互影響，可促進炎性細胞浸潤、滑膜組織和新血管增生，血管翳形成，引起骨和軟骨破壞，關節腫脹、疼痛[1415]。TNFα可激活RA滑膜細胞分泌細胞黏附分子、膠原酶、環氧化酶、基質金屬蛋白酶、前列腺素E2（PGE2）等致炎因子，進而促進成纖維樣滑膜細胞的活化、破壞關節組織以及參與關節炎性破壞過程。從本實驗結果可以看出，AA大鼠在給予五味甘露藥浴散加減方14 d后，其血清中的TNFα較模型組明顯降低，五味甘露藥浴散加減方有較好的抗炎作用。

RA過程涉及多細胞間信號網絡通路的調控，促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPKs）是細胞漿內一類高度保守的絲氨酸蛋白激酶，為細胞增殖和傳遞應激信號的關鍵性蛋白激酶，在許多細胞因子的信號傳導中起著重要的中介作用。MAPK的主要功能是將炎癥刺激信息傳遞給細胞核，通過激活下游炎癥因子介導RA慢性炎癥及關節損傷，從而參與其發病機制。與RA病理狀態的維持及病情進展密切相關的MAPKs有cjun氨基末端激酶（JNK）、細胞外信號調節激酶ERK、p38MAPK 3種。其中JNK與基質金屬蛋白酶的產生相關，從而調節細胞外基質的降解；p38MAPK通過微調抗炎及促炎信號影響炎性反應。JNK通路是MAPK通路中重要通路之一，廣泛參與免疫應答和炎癥反應，能調節多種炎癥蛋白基因的表達，在炎癥反應中起關鍵作用[16]。實驗結果表明，五味甘露藥浴散加減方能夠明顯降低踝關節滑膜JNK1的蛋白表達和膝關節滑膜JNK1基因的表達。五味甘露藥浴散加減方可降低TNFα的水平，通過降低對JNK通路的刺激作用，下調MMP3的表達。這些炎癥因子促進了類風濕關節炎的發展，五味甘露藥浴散加減方通過調控JNK通路、降低TNFα等炎癥因子的表達對類風濕關節炎產生治療作用。此外，ERK通路的活化可促使T細胞增殖過度和多種細胞因子異常分泌增多，研究發現TNFα可通過ERK1/2信號轉導通路抑制Ⅱ型膠原和連接蛋白的基因表達，進而干擾關節軟骨合成和重建[17]，本實驗中，五味甘露藥浴散加減方能夠降低踝關節滑膜的ERK1/2蛋白表達和膝關節滑膜ERK基因的表達。在RA滑膜組織T細胞和滑膜內皮細胞上能檢測到磷酸化p38 MAPK，其能調節編碼細胞黏附分子基因表達。本實驗中，五味甘露藥浴散加減方能夠降低踝關節滑膜p38蛋白表達和膝關節滑膜p38基因表達。五味甘露藥浴散加減方可降低TNFα的水平，降低RA滑膜細胞中p38顯著表達。通過p38 MAPK通路調控，降低滑膜細胞炎性因子的分泌和減弱關節組織的破壞。

綜上，MAPK信號通路參與了RA的炎癥反應過程，JNK，ERK和p38途徑在類風濕關節炎滑膜中活化顯著增強。關節局部的炎癥及骨質的破壞都與這3條通路的活化增強有關。實驗發現，與模型組相比，給藥14 d后，五味甘露藥浴散加減方高劑量大鼠血清中TNFα的水平降低，給藥28 d后，滑膜組織中JNK1，ERK和p38的表達下降。實驗結果說明五味甘露藥浴散加減方在控制類風濕關節炎的關節炎癥狀，緩解關節腫脹方面具有明顯療效，揭示其機制可能為通過抑制MAPK信號傳導通路，從而減少炎性因子的釋放，抑制滑膜異常增殖，達到阻抑類風濕關節炎關節骨質侵蝕的目的。而類風濕性關節炎發病十分復雜，涉及多條炎癥通路網絡，同時涉及免疫、內分泌等多個系統，因此后續實驗應從其他途徑探討五味甘露藥浴散加減方治療類風濕性關節炎的機制，從而為今后的臨床工作提供更多科學理論依據。

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[責任編輯 張寧寧]