基于貴金屬納米簇的電化學發光傳感器在生命分析中的應用

安曉剛， 杜 捷,*， 盧小泉

(1. 西北師范大學 生命科學學院， 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省生物電化學與環境分析重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

基于貴金屬納米簇的電化學發光傳感器在生命分析中的應用

安曉剛1， 杜 捷1,2*， 盧小泉2

(1. 西北師范大學 生命科學學院， 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省生物電化學與環境分析重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

為了更好地研究貴金屬納米簇的合成機理、擴展貴金屬納米簇-電化學傳感器的應用，闡述和比較了貴金屬納米簇的制備方法、電化學發光原理及特點,重點介紹了貴金屬納米簇-電化學傳感器在生命分析領域的應用進展及本課題組相關研究,并展望了其發展和應用前景，以期為貴金屬納米簇電化學傳感器在生命分析中的研究提供一定的參考。

貴金屬納米簇； 電致化學發光； 電化學生物傳感器； 生命分析

1 引 言

電致化學發光(Electrogenerated chemilumines-cence,ECL)是指一些中間體，主要是自由基離子在電的激發下產生于電極表面，繼而進行高能電子遷移反應，形成激發態而產生的一種發光現象[1-3]。ECL由于具有快速、高靈敏度以及簡化的光學裝置等優點，作為一種新型的分析工具，被廣泛應用于臨床、環境和工業等領域，主要涉及免疫分析[4-6]、食品和水質的分析檢測[7-9]、藥物分析[10]等。

貴金屬納米簇(Noble metal clusters,MNCs)，如Au和Ag納米簇等，是近年來新興的一類低毒性的“綠色”熒光標記材料，具有低毒、光學穩定、水溶性好、生物相容性好及優良的電致化學發光性質，可以彌補量子點成像時閃爍的不足。另外，由于MNCs特有的物理尺寸小、熒光可調及生物相容性等優異的性能，使得其在生物成像及檢測領域都有著廣泛的應用前景[11]。如Ag NCs，由于其具有良好的物理、電學和光學特性，已經應用于表面增強拉曼散射[12]、化學傳感[13]、光學器件[14]、生物成像[15]、催化[16]等領域。Liu[16]等用牛血清白蛋白(BSA)作為穩定劑和還原劑，用“一鍋法”制備了高水溶性的Au NCs，并將其與ECL有效結合，用于ECL 靈敏、高效地檢測多巴胺。

基于貴金屬納米簇的優越性和 ECL 技術的高靈敏性構建的 ECL 生物傳感器被廣泛應用于生命分析領域，取得了一些可喜的研究成果。一些成果研究應用到了我們的實際生活中，為人類健康服務，如羅氏血糖儀及羅氏電化學發光全自動免疫分析儀等是最好的應用實例。

2 MNCs合成及電化學發光特性

2.1 貴金屬團簇的合成

貴金屬團簇的制備方法主要包括物理法和化學法兩大類，及近年來出現的物理化學綜合合成方法。光誘導還原法、惰性氣體蒸發冷凝制備法及輻射誘導合成法是物理類中最主要的3種方法。制備金屬團簇需要合適的穩定劑作為團簇保護劑與穩定劑，但因為物理法獲得的團簇沒有適當的穩定劑作為保護，所以極易發生聚集，導致其結構與性質發生改變。另外，物理方法合成時，合成產物一般顆粒較大，粒徑分布不均一且穩定性差。因此，化學合成方法在研究中較為常用，主要包括單分子層保護(MPCs)和模板法。

模板法主要基于微乳液[18]、高分子聚合物[19]、聚合電解質[20]以及功能性生物分子如 DNA、多肽和蛋白質等分子[19]的特殊空間結構或功能，在強還原劑(NaBH4)存在條件下獲得穩定、熒光可調的貴金屬團簇。然而，當運用模板法制備MNCs時，必須選用一些物質制備模板和起到穩定合成的作用，通常選用巰基化合物、蛋白質等作為模板，用于穩定或還原金屬離子，否則容易形成聚集現象[19]。

此外，物理化學綜合方法是近些年出現且研究比較熱的新合成方法，主要包括超聲化學合成法和微波輔助化學合成方法。相比物理合成法及化學合成法，超聲化學合成法更顯優越性，如反應速率快、條件可控、產物純度高、粒徑大小可控等，因此該方法被很多研究者所采用，如Liu等[16]用超聲化學合成法制備得到了Ag NCs，大大縮短了反應時間。

微波輔助化學合成具有操作簡單、低能耗、反應快速高效、粒徑大小可控、環境友好等優越性能，從而被稱作“綠色”合成技術。Liu等[21]采用微波輔助合成法以 L 型谷胱甘肽作為合成反應過程中的穩定劑及還原劑，利用微波法在幾分鐘內快速高效地合成了 GSH/Ag NCs，大大縮短了反應時間。Shang等[22]也采用微波法成功制備了二氫硫辛酸包裹的Au NCs，將反應時間從傳統合成方法的幾個小時縮減到幾分鐘，進一步顯示出微波法的優越性。

2.2 貴金屬團簇的電化學發光性質

貴金屬團簇的物理尺寸較小(< 2 nm)，當其尺寸接近或小于電子的費米波長時，金屬連續的能級會變為準連續甚至是離散能級，從而使團簇產生光致發光現象。熒光是團簇最為重要的性質，當構成團簇的原子數目不同即團簇大小不同時，能級之間能量差值也不同，因此其熒光性質也隨之變化。通常具有熒光性質的金屬納米簇都具有電化學發光特性，但是電化學發光原理與一般化學發光不同，主要是自由基離子在外加電的激發下產生于電極表面，繼而形成激發態，隨后當激發態向基態能級躍遷時伴隨光子產生。

ECL 技術由于具有快速、高選擇性、高靈敏性、高穩定性、便于操作和控制等特點，已經發展成為一種非常強大的分析工具被應用于各個領域。近年來，基于貴金屬納米簇-ECL生物傳感器的研究進一步促進了其在醫學檢測、食品安全檢測等領域的發展。

3 納米簇的ECL的原理及特點

納米簇的電化學發光是電化學反應和化學發光反應的結合，主要涉及兩個反應過程：電化學過程和化學發光過程。在電化學反應過程中，在外加電壓作用下生成發生化學發光反應的自由基離子；在化學發光反應過程中，自由基離子之間或自由基離子與反應體系中其他組分之間發生化學反應產生激發態分子，當這些激發態分子向基態能級躍遷時伴隨光子產生。

ECL 技術是融合化學發光和電化學的技術，不需要使用任何外部光。作為一種新的分析方法，主要有以下幾個特點：(1)靈敏度高，線性范圍寬；(2)反應可控性強；(3)分析速度較快，實驗裝置簡單；(4)試劑用量少，耗費低；(5)獲得信息的途徑較多；(6)多種技術聯用，可以實現對復雜樣品的同時分離與檢測。

4 在生命分析中的應用

4.1 電化學免疫分析應用

電化學免疫分析是基于免疫學基礎，結合電化學技術發展起來的一種有效分析技術。該技術與單純的免疫反應相比，其最大特點是將抗體 (或抗原) 作為分子識別元件，構建到電極表面，從而將免疫反應的特異性與電化學的高靈敏性相結合，進而實現對目標物的特異性與超靈敏檢測。

圖1 三重放大ECL免疫生物傳感器檢測假狂犬病病毒抗體示意圖[5]

Zhang等[16]基于貴金屬納米簇的夾心免疫反應原理，將鉑納米粒子標記抗體引入電極表面，進而實現響應信號的放大和檢測限的極大提高。Shao等[5]基于三重放大電化學傳感器對于檢測低豐度生物標志物的優越性，以“Stretch-Stowage-Growth”策略構建了三重放大 ECL 免疫生物傳感器來超靈敏檢測假狂犬病病毒抗體 (圖1)，對假狂犬病病毒抗體的檢測限可達到0.4 pg·mL-1。該技術具有很好的應用前景。

4.2 在癌癥等疾病診斷方面的應用研究

癌癥也稱惡性腫瘤，目前已成為中國乃至全世界最重要的死亡原因，也是非常重要的公共健康問題[28]。對癌癥的早期有效診斷措施是對患者血清中的特殊腫瘤標志物進行特異性、高靈敏檢測，從而實現對腫瘤(癌)的預警及早期診斷、治療。常見腫瘤(癌)及腫瘤標志物如表1所示。

如何有效、靈敏地對癌癥等疾病進行早期診斷檢測與治療仍是生命分析研究亟需解決的問題和研究熱點。目前，針對腫瘤標志物的免疫分析方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[29-30]、化學發光免疫法[31-32]、熒光免疫分析法[33-34]等，其中將高特異性的免疫分析方法與高靈敏的電化學方法相結合而構建的電化學免疫傳感器一直是研究熱點[35-37]。

表1 常見腫瘤(癌癥)及其標志物

Bruno等[38]構建了體外DNA寡核苷酸適配體ECL傳感器檢測炭疽桿菌。Xiang等[8]設計了一種可在同一位點同時檢測多種目標物的基因傳感器(圖2)，能同時分別檢測來自鼠傷寒沙門氏桿菌病原體(gyrB基因)和直腸腫瘤(K-ras基因)的基因生物標記物。Huang等[39]運用鈀納米簇，設計了一種雙電位比率型 ECL策略用于免疫分析，并以癌胚抗原為模型，研究了該設計的可行性。結果表明：該設計對生物標記蛋白具有很好的選擇性和檢測，最低檢測限可達0.62 pg·mL-1。

圖2 同時檢測鼠傷寒沙門氏桿菌病原體(gyr基因)和直腸腫瘤(K-ras基因)的基因生物標記物電化學免疫傳感器[8]

Fig.2 Simultaneous detection of Salmonella typhimurium pathogen(gyrB gene) and rectal tumor(K-ras gene) gene biomarker electrochemical immunosensor[8]

Cao等[40]基于納米合金顆粒(Au-Pt)構建了檢測 CEA 的夾心免疫結構，其原理如圖3。由于 Au 和 Pt 之間的高效協同作用，Au-Pt 合金納米粒子除具有較大的比表面積、良好的生物相容性和優良的導電能力外，還可進一步催化底液中的H2O2溶液，進而利用Au-Pt納米粒子及HRP對過氧化氫的協同催化作用實現雙重信號放大。該傳感器用于測定CEA的濃度范圍為0.01～200 ng/mL。

Yang等[41]構建了一種新型的電流型免疫傳感器，對腫瘤標志物 CEA 的檢測限為12 pg·mL-1。

圖3 用于CEA檢測的Au-Pt 雙金屬電化學傳感器[40]

另外，Zhou等[17]用氮摻雜石墨烯設計了一種猝滅型ECL免疫傳感器，以腫瘤標志物甲胎蛋白(Alpha-fetal protein,AFP)為模型探究了該傳感器的分析性能，當濃度范圍在0.01～100 ng·mL-1時具有很好的線性，最低檢測限可達到3.3 pg·mL-1。

最近文獻報道，Zhang等[42]設計了一種比率型ECL免疫傳感器，能夠超靈敏、特異性檢測腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)并對其具有很寬的線性檢測范圍(1 fg·mL-1～20 ng·mL-1)，最低檢測限可以達到1 fg·mL-1。Zhang等[43]基于魯米諾-金納米粒子構建了雙信號生物傳感器用于檢測端粒酶，該方法不僅能夠檢測100～9 000個HL 細胞中端粒酶的含量，還可以用于研究腫瘤細胞的凋亡。

4.3 對生物分子的檢測

Gu等[44]將碳量子點(CDs)制作成 “off-on” 型熒光探針檢測Au(Ⅲ)與谷胱甘肽含量，該方法可以用于細胞內不同狀態下谷胱甘肽含量的測定。多巴胺是下丘腦和腦垂體腺中的一種重要神經遞質，與人們的情緒息息相關，Liu等[25]首次基于他們合成的 Ag NCs 構建的電化學傳感器對多巴胺進行了檢測，檢測限可以達到 9.2×10-10mol/L。后來，Li等[27]基于他們合成的Au NC的ECL檢測多巴胺，并研究了Au NC的ECL發光機理。Zhang等[45]基于逐步化學反應策略，構建了高靈敏 ECL 傳感器檢測多巴胺，以 O2作為內源性共反應劑，大大提高了檢測信號及檢測限，下限可達到 26 pmol/L。

Yuan等[46]構建了石墨烯/多壁碳納米管/金納米簇復合型 ECL傳感器，用于檢測酚類化合物。Wu等[47]將制備的 AuNC@BSA-silica NPs 構建成固態 ECL傳感器檢測過氧化氫。Chen等[48]基于離子液體的優越性構建了離子液體誘導型 CO2傳感器檢測CO2，檢測限為 80 ×10-6，其反應過程如圖4所示。Jia等[49]基于Au-HS/SO3H-PMO構建了一種可靈敏檢測葡萄糖的非酶電化學傳感器，對葡萄糖的檢測限可達到 2.5×10-8mol/L，靈敏度為 6.45×102μA·mmol-1·L·cm-2，該方法為人類血清中葡萄糖含量的有效測定提供了一種可能。

Gui等[50]將 Ru(Ⅱ) 和氨卡青霉素連接在一起作為識別元件構建了一種新型的 ECL 生物傳感器用于檢測內酰胺酶(圖5)。在該過程中，構建的Ru-Amp不僅作為識別元件，同時也作為發光試劑，通過靜電吸附和分子內部的π-π鍵相互作用將其與制備的 Au NPs構建成復合納米材料。該復合材料會子組裝到 CNTs-Nf 修飾的玻碳電極上，基于Amp的自身水解反應，從而明顯增強 ECL 信號，可以對內酰胺酶進行高靈敏檢測，檢測濃度范圍為50 pg·mL-1～100 ng·mL-1，最低檢測限為 37 pg·mL-1。

Xu等[51]用釕(Ⅱ) 和1,10-菲咯啉-5,6-二酮絡合物(Ru-dpq)構建了一種可以高選擇性、靈敏檢測 GSH 的猝滅型ECL傳感器，在0.1 pmol/L～50 μmol/L范圍內呈良好線性，檢測限可以達 0.087pmol/L。質譜探究發現，在該反應過程中，GSH 使 Ru-dpq 反應后結構發生了改變，生成了一種氧化產物Ru-dcbpy，同時還原型 GSH 變成了氧化性 GSSG。

圖4 離子液體誘導型CO2傳感器檢測CO2[48]

Fig.4 Inducible ionic liquid CO2sensor CO2[48]

圖5 生物傳感器構建示意圖及目標檢測機制[50]

4.4 本課題組近年對生命分析的相關研究

Du等[52]基于三維石墨烯構建的電化學傳感器可以實現對對苯二酚(HQ) 和鄰苯二酚(CC)的同時檢測，HQ和CC的線性檢測范圍分別為3.10×10-7～1.31×10-5mol/L和2.50×10-7～1.29×10-5mol/L。Bi 等[53]基于2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)-氧化纖維素納米晶體(TOCNCs) 和 L-半胱氨酸修飾到金電極表面構建的電化學生物傳感器，能夠靈敏地檢測和鑒別手性氨基酸，包括苯基丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，這3種手性氨基酸與人體的代謝疾病相關。利用該電化學傳感器對正常人和糖尿病人血清進行檢測，結果表現出顯著性差異，從而為代謝疾病的篩查、診斷和治療具有重要的意義。

5 展 望

綜上所述，基于貴金屬納米簇的電化學發光傳感器為生命分析研究提供了強有力的技術支撐，利用免疫分析及 DNA 雜交技術構建的電化學生物傳感器被廣泛應用于生物電分析及生命分析領域。在我們的日常生活中，羅氏血糖儀及醫院常用的羅氏電化學發光全自動免疫分析儀等是最好的理論研究轉化為實際應用的實例。

盡管在醫學診斷、免疫分析、食品和水質分析檢測、藥物分析等方面的研究取得了一些可喜的成果，但對于癌癥等疾病的早期診斷與治療仍是生物學家和分析化學研究者所共同關注的問題和面臨的挑戰。很多研究報道了基于 NMCs 構建的ECL生物傳感器能超靈敏檢測癌癥等疾病，但這些研究只是局限于實驗室的理想條件下對細胞的研究，并沒有應用于體內復雜環境下的深層次研究。另外，如何將低毒性的貴金屬納米簇有效地作為藥物示蹤標記物應用到臨床疾病的靶向治療及藥物“負載-釋放”過程的可視化具有重要的研究意義。

近些年的研究趨勢充分體現了化學與生物的交叉融合、生物學家和化學家的協同合作?；诩{米材料與 ECL 技術的生物電化學傳感器及生物電分析的研究為生物學及生命分析的研究提供了更好的技術支撐。技術的發展是為了更好地服務于應用，只有當技術的發展永遠走在應用的前面，才能更好地服務于應用。相信隨著研究的不斷深入和技術的不斷進步，肯定會取得更大的成果，更好地為人類健康服務。

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安曉剛(1989-)，男，甘肅靜寧人， 碩士，2017年于西北師范大學獲得碩士學位，主要從事生物分析化學、電化學生物傳感器等方面的研究。

E-mail: axg225@163.com杜捷 (1971-)男，甘肅成縣人，博士，教授，2011年于西北師范大學獲得博士學位，主要從事遺傳學、生物分析化學、生物傳感器及納米分析技術的研究。

E-mail: dujie@nwnu.edu.cn

Application in Life Analysis of Electrochemiluminescent Sensor Based on Noble Metal Nanocluster

AN Xiao-gang1, DU Jie1,2*, LU Xiao-quan2

(1.CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofBioelectrochemistry&EnvironmentalAnalysisofGansuProvince,Lanzhou730070,China)

In order to study the synthesis mechanism of noble metal nanoclusters and the application of noble metal nanoclusters-electrochemical sensors, some methods of the synthesis and the properties of noble metal nanoclusters are described and compared. The principle and characteristics of electrogenerated chemiluminescence (ECL) are briefly described, the progress of application of noble metal nanoclusters-electrochemical sensor in life analysis and the related research of our research group are mainly introduced. The development and application are prospected, which may provide a reference for the research of noble metal nanoclusters-electrochemiluminescent sensor in life analysis.

noble metal clusters (MNCs); electrogenerated chemiluminescence (ECL); electrochemical biosensor; life analysis

1000-7032(2017)05-0675-10

2016-12-12；

2017-02-12

國家自然科學基金(21165015,21565020)資助項目 Supported by National Natural Science Foundation of China (21165015,21565020)

O657.1

A

10.3788/fgxb20173805.0675

*CorrespondingAuthor,E-mail:dujie@nwnu.edu.cn