結合基序蛋白6在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

王子昕,盛偉偉,董 明,周建平,孔凡民

(中國醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科,遼寧 沈陽110001)

結合基序蛋白6在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

王子昕,盛偉偉,董 明*,周建平,孔凡民

(中國醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科,遼寧 沈陽110001)

目的 探討RNA結合基序蛋白6(RBM6)在結直腸癌(CRC)中表達水平及臨床病理學意義。方法 應用免疫組織化學方法檢測92例配對的CRC及癌旁組織石蠟包埋標本RBM6表達水平，觀察其與CRC病人臨床病理學參數的關系；再以Western印跡和qRT-PCR檢測28例配對冷凍保存的新鮮CRC及癌旁組織中RBM的蛋白和mRNA表達水平。結果 免疫組化結果顯示：RBM6在92例CRC表達明顯高于癌旁組織表達水平(癌組織30.4%,28/92 vs 癌旁10.9%，10/92；P<0.01)?？ǚ綑z驗顯示：RBM6的表達與CRC腫瘤的大小、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移無明顯相關性(P>0.05)，但與患者TNM分期和遠處轉移呈正相關(P=0.026,P=0.021)。單因素分析發現：RBM6高表達CRC患者預后更差(P=0.024)。qRT-PCR和Western印跡結果顯示：RBM6在CRC中蛋白和mRNA表達均高于配對癌旁組織 (P<0.01;P=0.009)。結論 RBM6在CRC中呈高表達,并與患者臨床分期、遠處轉移及不良預后相關，可能參與CRC的惡性進展。

結直腸癌；結合基序蛋白6；預后

(ChinJLabDiagn,2017,21:0765)

結直腸癌(Coloractal Cancer,CRC)作為發病率最高的惡性腫瘤之一，其發病率在全球范圍呈上升趨勢。2012年估計有136萬新增病例，并有超過69萬人死于此病，占全部癌癥死亡人數的8.5%[1]。在中國，CRC的發病率達376.3/10萬人，死亡率達191人/10萬人，均位居惡性腫瘤第5位[2]。CRC的發生是多因素、多步驟、涉及多種腫瘤信號通路作用的結果，篩選有助于CRC早期診斷及監測預后的腫瘤標記物至關重要。RNA結合基序蛋白(RNA-Binding Motif protein,RBM)是一類mRNA結合酶，能夠通過選擇性剪切目的基因mRNA，抑制其靶基因表達而發揮作用[3]。以往文獻報道，RBM6在肺癌、惡性血液病、乳腺癌、骨骼肌肉瘤等腫瘤組織和細胞中存在不同程度的表達[4-7]，如在肺癌中RBM6通過選擇性剪切NUMB轉錄子，增強癌細胞克隆增殖能力[4]，但其在CRC中研究鮮有報道。本文采用免疫組織化學(IHC)、蛋白印跡(WB)和實時定量聚合酶鏈式反應 ( qRT-PCR )，檢測CRC中RBM6的表達，探討其表達的臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集 2013年1月至2014年12月，篩選我院具有完整臨床資料的原發性CRC切除標本92例，均有癌旁組織作為對照。另有28例CRC及配對的癌旁組織標本在術中切除后立即取樣，置液氮中冷凍保存。92例患者中，男49例，女43例，患者平均年齡(61±12)歲 ,其中≤65歲為37例，>65歲為55例。術后病理均證實為腺癌。腫瘤部位：結腸45例；直腸47例。根據2011年國內對國際UICC抗癌協會TNM分期標準解讀[8]，92例CRC中：Ⅰ期18例,Ⅱ期31例,Ⅲ期34例,Ⅳ期9例。分化程度:高分化18例，中低分化74例。

1.2 主要試劑

RBM6兔抗人單克隆抗體采購自Abcam 公司,GAPDH抗體購自美國Proteintech公司，羊抗兔及鼠二抗采購自北京中杉金橋公司。SP法免疫組織化學試劑盒及DAB顯色液采購自福州邁新公司。細胞裂解液(強)、蛋白酶抑制劑、BCA定量試劑、上樣緩沖液及ECL發光試劑盒均采購自碧云天生物公司。RNA分離提取試劑盒 Trizol、逆轉錄試劑盒(DRR047A)、SYBR Green等均采購自日本Takara公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 IHC

采用SP三步法：所有CRC組織標本均經10%福爾馬林固定,常規石蠟包埋，4 μm連續切片,以二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化。經3%過氧化氫室溫 15 min去除內源性過氧化物酶。用pH 7.4的PBS清洗后，置于pH 6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，以121℃高壓熱修復抗原3 min，待自然冷卻后，用PBS清洗3遍。滴加山羊血清，室溫封閉20 min。滴加RBM6一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜。次日室溫靜置30 min后，PBS清洗3遍，用生物素標記的羊抗兔IgG孵育，37℃ 20 min。PBS清洗3遍，用過氧化物酶標記的鏈霉親和素孵育，37℃15 min。DAB顯色，蘇木素復染10 min，鹽酸酒精分化10 s后水沖洗、脫水、透明，封片。

1.3.2 WB

提取癌及癌旁組織的蛋白質：每塊組織稱取50 mg，加入300 μl細胞裂解液(強)和3 μl蛋白酶抑制劑，超聲粉碎組織20 s，靜置30 min后，4℃下12000G離心15 min,收集上清。應用BCA定量試劑盒將樣品濃度均定為5 μg/μl,每條泳道的蛋白上樣量50 μg,經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,80V 90 min電轉印至PVDF膜。5%脫脂奶粉TBST封閉2 h,分別加入一抗：RBM6,1∶1 000；GAPDH,1∶2 000。4℃低溫孵育過夜。TBST洗膜后，用1∶40 000羊抗兔及1∶10 000 鼠二抗分別室溫孵育2 h,TBST清洗,增強化學發光劑(ECL) 以凝膠顯像儀 (MF-chemibis 3.2 DNR)顯像。

1.3.3 qRT-PCR

采用 RNA分離提取試劑 Trizol提取并純化組織總RNA；根據Takara逆轉錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。反應條件:95℃ 5 min 變性； 95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環,所有反應均設立復孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。引物均由上海生工設計并合成。RBM6上游引物5’-TGACAGGAAGTGATGGTGTCT-3’；下游引物5’-CTCCAGCCAGTAGCCTGTTG-3’，擴增產物112bp；GAPDH上游引物 5’-CCACCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3’；下游引物5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。

1.4 陽性結果判定

RBM6蛋白以胞核和部分胞漿出現棕黃/黃褐色染色為陽性。參考Sheng等[9]的文獻評分方法,隨機選擇5個視野的陽性細胞百分比和染色強度，采用半定量評分方法：①陽性細胞百分數：每個視野記數 100個細胞，計算5個隨機視野的陽性細胞的平均百分數，將平均百分數分為4級：陽性細胞數占0-9 % 為0分；10%-24%為1分；25%-49%為2分；50%-74%為3分；≥75%為4分。②排除非特異性染色后，染色強度分為4級：無著色0分；淡黃色1分；黃色或深黃色2分；褐色或棕色3分，分級標準為上述兩項乘積:<6分為陰性表達；≥6分為陽性表達。

蛋白印跡結果是根據ECL熒光成像得到的條帶和電泳條帶的面積和光密度，運用quantity one軟件，計算每個條帶的灰度值或吸光度值。

qRT-PCR分析結果得到標本中RBM6和GAPDH 的閾值循環數( CT)值與其相對應的GAPDH的 CT 值相減,得到校正 CT 值。如以正常結腸組織為對照，與癌組織比較公式：2^-ΔΔCT= 2^-[(ΔCT癌組織目的基因-ΔCT癌組織內參基因)-(ΔCT癌旁組織目的基因-ΔCT癌旁組織內參基因)] 。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計分析軟件，用相關樣本Wilcoxon符號秩檢驗比較RBM6在CRC與癌旁組織IHC染色結果，用卡方檢驗比較RBM6蛋白表達及其與患者臨床病理學參數的關系。采用配對t檢驗比較配對的癌與癌旁組織蛋白和mRNA表達水平。Kaplan-Meier單因素分析計算累積生存率，顯著性分析采用log—rank檢驗。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RBM6在CRC和癌旁組織中表達

RBM6蛋白在CRC組織中的胞漿及胞核中表達(圖1CD)；在癌旁細胞中呈弱或陰性表達(圖1AB)。RBM6在CRC組織中高表達占30.4%(28/92)，在癌旁組織中高表達僅占10.9%(10/92)，兩者比較有顯著的統計學差異 (t=3.934，P<0.01)。

A：癌旁組織中陰性表達； B：癌旁組織中弱表達；C:CRC中中度表達；D:CRC中強表達

2.2 RBM6蛋白表達與CRC患者臨床病理學參數關系

通過卡方檢驗，RBM6蛋白表達水平與CRC患者性別、年齡、腫瘤部位(結腸和直腸)、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度均無統計學差異(P>0.05)。但與患者預后TNM分期(Ⅰ+Ⅱ vs Ⅲ+Ⅳ，P=0.026)及遠處轉移(P=0.021)呈明顯正相關(表1)。

表1 臨床病理學資料與RBM6表達的關系

*本研究納入的遠處轉移病例，7例以腫瘤引起的急性腸梗阻為首發癥狀入院，急診行腫瘤姑息切除；2例存在肝轉移，行癌根治術及肝臟部分切除術。

2.3 RBM6蛋白表達與CRC患者術后生存關系

單因素分析發現，RBM6高表達CRC患者較其低表達者預后不良(χ2=5.097,P=0.024)(圖2)本研究納入的9例遠處轉移病例，其中7例為腫瘤引起的急性腸梗阻為首發癥狀入院，急診行腫瘤姑息切除，此部分病例預后較差。

圖2 RBM6蛋白表達與CRC患者預后的關系

2.4 RBM6在新鮮CRC及癌旁組織中蛋白和mRNA表達水平

WB顯示癌旁組織中 RBM6/GAPDH灰度比為0.447±0.292,CRC組織為0.905±0.834,兩者之間有明顯統計學差異(t=-3.059,P<0.01) (圖3) 。

圖3 CRC及癌旁組織中RBM6蛋白表達(取其中七對，N:癌旁組織；C：CRC)

qRT-PCR同樣顯示RBM6在28例CRC組織中mRNA表達高于配對的癌旁組織(t=-2.836,P=0.009)(圖4)。

3 討論

RBM6是1999年由Timmer等發現于肺癌細胞株，全長137 kb,由21個外顯子組成，位于3q21.3，其表達與腫瘤發生密切相關[10]。

研究表明，在急性巨核細胞白血病[5]、乳腺癌[6]和骨骼肌肉瘤[7]等人類腫瘤中存在RBM6 mRNA的高表達。在乳腺癌和骨骼肌肉瘤中，RBM6能夠與RBM5形成融合基因，其特異性存在于部分癌組織中并與腫瘤大小呈正相關[7]；在急性巨核細胞白血病中，RBM6能與CSF1R形成融合基因，轉染這個融合基因能誘導小鼠發生髓系增生性疾病[5]。而本研究發現：RBM6與CRC患者TNM分期、遠處轉移及不良預后呈明顯正相關，提示其參與CRC惡性進展，對于CRC診斷及預后評估具有重要意義。

圖4 A:14組配對CRC與癌旁組織qRT-PCR溶解曲線。B:癌旁組織及CRC中RBM6 mRNA表達水平(取其中14對，N:癌旁組織；C：CRC)

RBM6能調控NUMB的mRNA剪接,敲減RBM6能促進外顯子9的跳躍，從而抑制剪接異構體NUMB-PPRL 的形成[4]， NUMB-PPRL降低致NOTCH通路失活，最終抑制肺癌細胞增殖[11]。有文獻報道Numb在CRC中呈低表達，并與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴轉移呈負相關[12]，在本研究中，RBM6在CRC中呈明顯高表達，并與CRC患者臨床分期，腫瘤遠處轉移及不良預后密切相關，腫瘤分期越差，存在遠處轉移的腫瘤RBM6表達水平越高。同時我們前期研究發現Numb在CRC中表達與RBM6存在負相關趨勢(結果尚在統計中)，結合以往研究報道，Numb能夠抑制包括胰腺癌、食管癌及乳腺癌等多種腫瘤細胞侵襲和遷移[13，14]。由此我們推測，RBM6可能通過調節NUMB-PPRL亞型表達，增強CRC細胞的增殖、侵襲及轉移力，最終影響CRC惡性進展。

綜上所述，RBM6在CRC中呈高表達,并與患者臨床分期、遠處轉移及不良預后相關，可能參與CRC惡性進展。RBM6是否通過調控Numb亞型表達影響CRC生物學行為是我們未來研究方向。

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Expression of RNA binding motif protein 6 in colorectal cancer and its clinical significance

WANGZi-xin,SHENGWei-wei,DONGMing,etal.

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,FirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of RNA binding motif protein 6(RBM6) in colorectal cancer tissue.Methods The expression of RBM6 protein in 92 paired paraffin embedded CRC specimens and adjacent non-cancerous colorectal tissues were detected by Immunohistochemistry.Western blot and quantificational RT-PCR (qRT-PCR) were used to examine the expression of RBM6 mRNA and protein levels in 28 paired fresh CRC specimens and adjuvant non-cancerous tissues.The relationship between the protein expression and clinicopathological features was analyzed.Results RBM6 protein was overexpressed in CRC than that in paired adjacent normal colorectal tissues(P<0.01)．High RBM6 expression was positively correlated with TNM stage and distant metastasis,respectively(P=0.026,P=0.021)，but had no association with tumor size,differentiation,invasion depth and lymph metastasis(P>0.05)．CRC patients with RBM6 overexpression had a worse prognosis(P=0.024).Both protein and mRNA levels of RBM6 were higher in CRC than that in non-tumorous colorectal tissues detected by Western blot and qRT-PCR,respectively (P<0.01;P=0.009).Conclusion RBM6 is overexpressed in CRC and is positively associated with TNM stage,distant metastasis and poor prognosis of CRC patients.Aberrant expression of RBM6 might participate in the aggressive progression of CRC.

colorectal cancer;RBM6;prognosis

遼寧省教育廳特聘教授專項基金(遼財指數 2012-512)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0765-05

R735.3

A

2017-01-14)