富馬酸二甲酯合成工藝中基因毒性雜質的質量控制研究

王珊珊，李 磊，王曉利，林云良，陳相峰＊

富馬酸二甲酯合成工藝中基因毒性雜質的質量控制研究

王珊珊，李 磊，王曉利，林云良，陳相峰＊

（山東省分析測試中心,山東 濟南 250014）

文章建立了氣相色譜-質譜聯用法測定富馬酸二甲酯中硫酸二甲酯的方法，采用選擇離子模式（SIM），內標法定量，方法檢出限為10 ng/mL，在20～150ng/mL的線性范圍內，線性相關系數達到0.996；方法精密度在1.5%～3.0%之間，精密度良好；8個小時內溶液響應的相對標準偏差僅4.22%，無明顯變化，穩定性良好，該方法穩定性及精密度能完全滿足富馬酸二甲酯中硫酸二甲酯的分析研究。

氣相色譜-質譜聯用；選擇離子模式；內標法定量；精密度

富馬酸二甲酯是一種用途廣泛且對微生物具有廣譜﹑高效抑菌和殺菌作用的化合物[1]；富馬酸二甲酯常用作食品防霉劑可以防止食品因霉菌微生物等引起的腐敗變質，在延長食品的保鮮期限﹑減少運輸和貯存過程所造成損失的方面起著越來越重要的作用。富馬酸二甲酯具有低毒性，根據臨床試驗，由于對人體有腐蝕性和致過敏性，可經食道吸入對人體腸道﹑內臟產生腐蝕性損害和引起過敏[2-4]；硫酸二甲酯是一種高毒性化學品，世界衛生組織（WHO）曾經報道硫酸二甲酯是一種致癌致畸危險品，它可對核酸鹽甲基化，被認為是強致癌劇毒物質[5]。硫酸二甲酯中毒特征主要是對眼﹑上呼吸道有強烈刺激作用，對皮膚有強腐蝕作用[6-7]。目前硫酸二甲酯的檢測主要有氣相色譜法[8-12]和液相色譜-質譜聯用法[13-14]等。本文建立了富馬酸二甲酯中硫酸二甲酯雜志的分析方法，利用氣相色譜法-質譜聯用法，選擇離子模式進行測定，內標法定量分析，與外標法相比，內標定量法可以減小樣品前處理及儀器不穩定造成的誤差。

1 實驗部分

1.1 檢測條件及樣品處理

儀器﹑色譜條件：氣相色譜-質譜聯用儀采用Agilent 7890A-5973N (GC-MS)；色譜柱采用AgilentHP-5（30m×0.25mm×0.25μm）；柱溫箱升溫程序：50℃保持3min以10℃/min升至130℃保持以30℃/min升至200℃保持3min以30℃/min升至280℃保持10min。進樣口溫度為200℃，采用脈沖不分流模式；載氣使用高純氦氣；流速為1.0 mL/min；進樣體積：1.0μL。

質譜條件：采集模式為選擇離子模式（SIM）；離子源溫度為230℃；四極桿溫度：150℃；硫酸二丁酯（內標）﹑硫酸二甲酯質譜定量/定性離子見表1。

表1 硫酸二甲酯及硫酸二丁酯（內標）的質譜參數Table1 Mass parameters of dimethyl sulfate and butyl sulfate (internal standard)

儲備溶液的配制：稀釋溶劑用丙酮（色譜級）；對照品溶液：精密稱定硫酸二甲酯標樣（瑞陽制藥有限公司提供）100.1mg，置于100mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得1.001mg/ mL標準溶液。精密量取上述儲備標準溶液0.1mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀釋至刻度，搖勻后得1.0g/mL標準儲備溶液A。

內標：精密稱定硫酸二丁酯（東京化成工業株式會社）100.2mg，于100mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得1.002mg/mL內標儲備溶液。精密量取上述儲備溶液1.0mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀釋至刻度，搖勻后得10.0μg/mL內標儲備溶液B。

供試品溶液：取富馬酸二甲酯試樣約400mg，精密稱量，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮稀釋定容，搖勻后超聲5分鐘，作為供試品溶液待測。

表3 線性范圍、回歸方程、檢出限及定量限Table3 Linear range, regression equation, limit of detection and limit of quantitation

2 結果與討論

2.1 專屬性實驗

空白溶劑：丙酮，待測。

空白樣品溶液：精密稱定空白樣品400.1 mg，置10mL量瓶中，稀釋定容，作為空白樣品溶液，精密量取1.0mL上述溶液置于1.5mL進樣瓶中，精密加入10μL內標儲備液B，混勻，待測。

量取1.0mg/mL標準儲備溶液﹑1.0mg/mL內標儲備液各0.5mL，置于1.5mL進樣瓶中，混勻，質譜全掃描模式上機檢測，掃描范圍29～300amu。采用NIST11譜庫檢索定性分析。

量取上述混合溶液0.1mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀釋定容，混勻，取1.0mL于進樣瓶中，氣相色譜質譜聯用儀（質譜選擇離子模式）上機檢測。分別精密量取上述溶液各1.0μL注入氣相色譜質譜聯用儀，記錄總離子流圖，結果見表2。從表2可見空白溶劑﹑空白樣品對雜質測定均無任何干擾，待測組分及內標分離度良好。

表2 專屬性試驗結果Table2 Result of specific test

2.2 線性范圍、定量限及檢出限

精密量取硫酸二甲酯對照品儲備溶液A1.5mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得150ng/mL標液；密量取硫酸二甲酯對照品儲備溶液A 1.2mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得120ng/mL標液；密量取硫酸二甲酯對照品儲備溶液A 0.9mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得90ng/ mL標液；密量取硫酸二甲酯對照品儲備溶液A 0.5mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得50ng/mL標液；密量取硫酸二甲酯對照品儲備溶液A 0.2mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得20ng/mL標液；

分別精密量取上述標液各1.0mL置于1.5mL進樣瓶中，分別準確加入10μL內標儲備液B，混勻，待測。精密量取上述標準溶液各1.0μL，準確注入氣相色譜-質譜聯用儀，記錄峰面積。以硫酸二甲酯濃度為橫坐標，以硫酸二甲酯峰面積與內標峰面積比值為縱坐標做回歸曲線，計算回歸方程及相應的線性回歸系數。稱取0.4g樣品置于10mL棕色容量瓶中，精密加入對照品儲備液（A）1.0mL，丙酮稀釋定容，得100ng/ mL儲備標液，逐級稀釋對照品儲備液，逐級精密量取稀釋后溶液1.0μL，上機分析，當對照品濃度稀釋至其信噪比（S/ N）約在10～15左右時即為儀器定量限，其信噪比(S/N)約在3～5時左右即為儀器檢出限。以稱取0.4g樣品，丙酮溶解定容至10mL計本方法檢出限，定量限。結果見表3。

2.3 方法精密度及溶液穩定性試驗

稱取富馬酸二甲酯樣品400mg，置于10mL量瓶中，精確加入對照品溶液（A）1.1mL，丙酮稀釋配制濃度為110ng/ mL供試品溶液，精密量取上述溶液1.0mL置于1.5mL進樣瓶中，準確加入10μL內標儲備液B,混勻，待測。平行測定5次，計算RSD%，結果見表4。通過計算可知方法精密度在1.5%～3.0%之間，精密度良好。稱取富馬酸二甲酯樣品400mg，置于10mL量瓶中，精確加入對照品溶液（A）1.1mL，丙酮稀釋配制濃度為110ng/mL供試品溶液，精密量取上述溶液1.0mL置于1.5mL進樣瓶中，置于室溫放置0小時﹑2小時﹑4小時﹑6小時和7小時﹑8小時，精密量取1.0μL注入氣相色譜-質譜聯用儀，記錄峰面積。結果見表5。對照品溶液在室溫放置下硫酸二甲酯6個小時內衰減不明顯，8小時后衰減9.5%。存在不穩定性，但8個小時內相對標準偏差僅4.22%，無明顯變化，完全可滿足供試品的測試需求，建議在實驗室環境干燥的情況下進行試驗，標樣盡量現用現配。

表4 方法精密度試驗Table4 Precision of the method

表5 溶液穩定性試驗Table5 Stability of the solution

2.4 實際樣品測定

取待測富馬酸二甲酯試樣8個批次，按上述方法檢測，測定結果見表5。樣品中硫酸二甲酯的含量均小于0.25ppm。樣品加標色譜圖見圖1。

表6 實際樣品檢測Table6 Detection of real samples

圖1 硫酸二甲酯及內標的色譜圖Fig.1.Chromatogram of dimethyl sulfate and butyl sulfate (internal standard)

3 結論

采用氣相色譜-串聯質譜法選擇離子模式測定富馬酸甲酯中的硫酸二甲酯，檢出限為10ng/mL，在20-150ng/mL的線性范圍內，線性關系良好，該方法精密度在1.5%～3.0%之間，溶液在8個小時內穩定性良好，完全滿足富馬酸甲酯中硫酸二甲酯的測定。

[1] Liu Xiaogeng(劉曉庚).Theresearch progress of the dimethyl fumarate[J]. J.Chin.Cereal Oil Ass.（中國糧油學報），2010，25(4):116-120.

[2] Xu Lihong(徐麗紅)，Wang Jianqing(王建清)，Ding Beijie(丁蓓茹)，等.Determination of dimethyl fumarate in three types of food by gas chromatography [J].Acta Agric.Zhejiangensis（浙江農業學報），2011，23(4):807-811.

[3] Wu Hui(吳暉)，Liu Lei(劉磊)，Li Xiaofeng(李曉鳳)，等.The research status and application of dimethyl fumarate[J].J.Chin.Cereal Oil Ass.（中國糧油學報），2007，22(6):160-163.

[4] Han Zhoumi(闞周密)，Lin Jianyang(林建陽)，Wang Xidan(王戲丹).Rapid Determination of Dimethyl Fumarate in Food Poisoning by Gas Chromatographic-MassSpectrometric Method[J].Food Sci.（食品科學），2007，28(1):247-249.

[5] Wu Jie(吳杰)，Yao Chenzhi(姚晨之).Determinationofdimethyl sulfateinquaternaryammonium saltsurfactantbyheadspacegaschroma tography[J].China Surfactant Deterg.Cosmet.（日用化學工業），2009，39(5):354-357.

[6] Deng Guifeng(鄧桂鳳)，Yao Tongwei(姚彤煒).Determination of dimethyl sulphate residual in granisetronhydrochloride by headspace gas chromatography[J].J.ZheJiang Univ.（浙江大學學報），2008，37(2):156-158.

[7] Qin Xuanfu(覃宣富)，Zou Xiaoli(鄒曉莉)，Li Yuanqian(黎源倩)，等.Determination of Ddimethyl Sulphate in Environmental Samples with GC-ECD[J].J.Sichuan Univ.（四川大學學報），2010，41(5):877-880.

[8] Li Xiaojuan(李小娟)，Ma Yongjian(馬永建).Rapiddetermin ationofdimethylsulfateinairofworkplacewithgaschromatography[J].J.Chin.Ind.Med.（中國工業醫學雜志），2010，23(4):301-302.[9] Fang Jinhong(方金紅).Determination of dimethyl sulphate in synthetic paeonol samples by highperformance liquid chromatography coupled with pre-column derivatization[J].Anhui Med.Pharm.J.（安徽醫藥），2014，18(9):1646-1649.

[10] C.Schafer, P.Zollner.Determination of trace levels of dimethyl sulfate in the presence ofmonomethyl sulfate by gas chromatography-mass spectrometry[J].J.Chrom.A， 2013，1289(10):139-144.

[11] Yuan Jiawei(阮佳威)，Yao Hongyan(姚洪燕)，WangWeiwei(王薇薇)，等.Determination of two methyl sulfate residues in medicine by GC-MS[J].J.ZheJiang Shuren Univ.（浙江樹人大學學報），2014，14(4):31-34.

[12] Pei Dejun(裴德君).Determination of two methyl sulfate and ethyl sulfate in textiles by gas chromatography mass spectrometry [J].J.Chin.Anal.Lab.（分析試驗室），2015，34(1):31-34.

[13] Shi Yan(施燕)，He Zhigao(何志高).Determination of residue of dimethyl sulfate in drug by LC-MS /MS[J].J.Chin.Clin.Phar.（中國臨床藥學雜志），2016，25(3):164-167.

[14] N.Grinberg,F.Alb, K.Fandrick, etc.Assay at low ppm level of dimethyl sulfatein starting materials for API synthesis using derivatization in ionic liquid media and LC-MS[J].J.Pharmaceut.Biomed.，2013，75(5):1-6.

Validationof GC-MS Method for Dimethyl Sulfate in Dimethyl Fumarate

Wang Shanshan, Li Lei, Wang Xiaoli, Lin Yunliang, Chen Xiangfeng*
(Shandong Analysis and Test Centre, Jinan Shandong China 250014 )

Objective In this paper, a gas chromatography-mass spectrometrymethod was developed to determine dimethyl sulfate in dimethyl fumarate.Selective ion mode (SIM) mode and internal standard method was used in the method.The limit of detection of dimethyl sulfate was 10 ng/mL.The linear correlation coefficient was 0.996 in concentration from 20 ng/mL to 150 ng/mL.The precision of the method (RSD%, n=6) ranged from 1.5% to 3.0%.The RSD% of response for sample solution was 4.22% in 8 hours which indicated the stability of the method was acceptable.This method can be used for dimethyl sulfateanalysis in dimethyl fumarate.

Gas chromatography-mass spectrography; Selected Ion Mode; Internal standard Method; Precision

Q81 [Document Code] A

10.11967/ 2017150209

Q81

A DOI：10.11967/ 2017150209

山東省自然科學基金（批準號：ZR2012BQ009）

王珊珊(1983-02)，女，副研究員，博士。聯系人：陳相峰，副研究員，電話：0531-82605340，E-mail：xiangfchensdas@163.com.