連續色譜分級分離系統在金銀花活性成分提取中的應用

鄭乃仁 , 沈 杰, 楚占營, 張維冰, 鄧玉林

連續色譜分級分離系統在金銀花活性成分提取中的應用

鄭乃仁 , 沈 杰2, 楚占營2, 張維冰2, 鄧玉林1＊

（1.北京理工大學，北京，100081；2.華東理工大學，上海，200237）

采用連續色譜分級分離裝置對金銀花水提液中綠原酸和總黃酮實現連續分級分離，考察上樣液pH值﹑上樣體積﹑洗脫流速﹑洗脫中乙醇含量及pH值﹑洗脫流速﹑洗脫劑用量對分級效果的影響，最終采用717型陰離子交換樹脂柱﹑AB-8型大孔吸附樹脂柱和聚酰胺樹脂柱將金銀花水提液中的綠原酸和總黃酮進行分級分離，并對總黃酮進一步分離，最終綠原酸和總黃酮的得率分別為69.0%與64.5%，純度分別為63.0%與90.3%。

連續分級裝置；金銀花；活性天然成分

金銀花又名忍冬，是一種傳統的中藥材，具有較高的藥用價值，常用于如身熱﹑發疹等熱性病癥，效果顯著[1]?，F今，已有許多關于金銀花活性成分的研究報告，普遍認為金銀花中主要含有綠原酸等有機酸類﹑黃酮類等成分。這些成分是金銀花香味和藥用價值的主要的活性成分，具有抗菌殺毒和抗氧化的功效。

對金銀花中有效成分的分級分離是時下金銀花研究的重點和熱點。近年來，采用吸附-分離材料分離純化中草藥提取液已越來越受到人們的重視，并已逐漸成為中草藥活性成分分離純化的主流方法。離子交換樹脂[2]﹑大孔吸附樹脂是較為理想的綠原酸吸附劑[3-5]，而總黃酮的分離純化常用大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂[6-9]。

目前對于綠原酸和總黃酮的分離純化多是分步進行的，缺少對復雜天然產物中這兩種成分的一次性連續分級分離。本文采用一種新型的天然產物連續分級分離裝置，對金銀花水提液進行連續分級分離，以綠原酸和總黃酮吸附量﹑洗脫量為考察指標，考察了上樣液pH﹑上樣體積﹑洗脫流速﹑洗脫中乙醇含量及pH值﹑洗脫流速﹑洗脫劑用量等對整個分級分離過程的影響，并對各項參數進行優化，獲得了新型天然產物連續分級分離裝置對金銀花水提液分級分離的優化工藝參數。

1 試劑、儀器與實驗方法

1.1 試劑與儀器

金銀花（干燥），購自上海蔡同德大藥房；717型陰離子交換樹脂﹑AB-8型大孔吸附樹脂及聚酰胺樹脂，購自上海華震科技有限公司；蘆丁和綠原酸標準品均購自中國藥品生物制品鑒定所。

紫外分光光度計（Evolution 220型），美國 Thermo Fisher Scientific公司；pH計（PE20/EL20）及分析天平（ME104E/02），德國 Mettler Toledo公司；超純水儀（Arium 611DI），德國 Sartorius公司。

1.2 連續色譜分離裝置結構示意圖

本裝置的構建基于金銀花水提液中主要的成分為綠原酸﹑黃酮類的特點，采用三根樹脂柱進行分級分離：第一根樹脂柱裝填凝膠型的717型樹脂，用于吸附綠原酸；第二根樹脂柱裝填AB-8型樹脂，吸附分離黃酮類化合物；由于MAR對于非黃酮類化合物[10]也有吸附能力，故本裝置中第三樹脂柱裝填聚酰胺樹脂（PA），對第二樹脂柱的洗脫液進一步分級，實現黃酮的純化。裝置結構如圖1所示。

圖1 連續色譜分級系統的構建示意圖Fig.1 The schematic diagram of the device products

1.3 綠原酸及黃酮的含量測定

1.3.1 總黃酮的含量測定

配制綠原酸標準溶液0.005 mg/mL﹑0.008 mg/mL﹑0.011 mg/mL﹑0.014 mg/mL﹑0.017 mg/mL各一份（溶劑：30%的乙醇-水溶液）。在326 nm波長下測定綠原酸標準品吸光度標準曲線。按相同方法測定待測樣品吸光度，并根據線性回歸方程得到待測樣品中綠原酸含量。

1.3.2 總黃酮的含量測定

配制綠黃酮標準溶液0.004 mg/mL﹑0.008 mg/mL﹑0.012 mg/mL﹑0.016 mg/mL﹑0.020 mg/mL各一份（溶劑：乙醇）。按文獻方法[5]處理各標準樣品后測定吸光度，繪制線標準曲線如圖2所示并得到線性回歸方程，按相同方法測定待測樣品吸光度，并根據線性回歸方程得到待測樣品中黃酮含量。

圖2 綠原酸（a）及黃酮（b）的吸光度標準曲線（回歸方程：ya=0.04107x-0.00253，R2=0.9992；yb=0.0171x-0.0128，R2=0.9996）Figure 2 Standard curve of (a) chlorogenic acid and (b) total flavonoids ( Regression equation : ya=0.04107x-0.00253, R2=0.9992; yb=0.0171x-0.0128, R2=0.9996)

2 結果與討論

2.1 上樣pH對吸附的影響

如圖3所示，當上樣液的pH值為8時，717型樹脂的對綠原酸的吸附量較大。綠原酸是一種有機弱酸，酸性條件下會抑制其電離，使其更多得呈游離態，不利于離子交換的進行，而堿性條件會促使其電離，更利于離子交換過程的進行。但綠原酸在強堿性條件下不穩定，結構易變。因此，717型樹脂柱的上樣液pH調節至8為宜。

對于AB-8型樹脂，當上樣液的pH值為4時，其對總黃酮的吸附量較大。MAR在吸附過程中，目標組分需要以分子狀態才易于被樹脂吸附，故為盡可能提高吸附效果則必須使目標組分在溶液中保持分子狀態。酸性化合物在酸性介質中會被抑制其電離作用而保持分子狀態，便于被充分吸附。而金銀花總黃酮本身具有酚羥基結構，呈弱酸性，當溶液pH值為4時，酚羥基的離子化趨勢被抑制而讓總黃酮呈游離態，更容易被大孔吸附樹脂吸附；而隨著pH值的增加，總黃酮離子化的趨勢增強，增大了吸附難度。因此，在AB-8樹脂柱上樣液

的pH條件至4為宜。

圖3 上樣液pH值與717型樹脂（a）和AB-8型樹脂（b）吸附量的關系Fig.3 The relationship between the pH value of sample solution and the adsorption capacity of 717 resin (a) and AB-8 resin (b)

2.2 上樣體積的影響

2.2.1 717型樹脂對綠原酸的吸附容量測試

如圖4（a）所示，流分11 中綠原酸含量為0.57 g/L，大于原始上樣液中綠原酸含量4.32 g/L的10%，為穿透點，故717型樹脂的最佳上樣體積為10 BV，即每毫升717型樹脂的最適宜上樣量為10 mL生藥濃度為0.2 g/mL的上樣液。

2.2.2 AB-8型樹脂對黃酮的吸附容量測試

如圖4（b）所示，流分18中總黃酮的含量為0.88 g/L，大于原始上樣液中總黃酮含量5.06 g/L的10%，為穿透點，故AB-8型樹脂的最適宜上樣體積為17 BV，即每毫升AB-8樹脂的最適宜上樣量為17 mL生藥濃度為0.2 g/mL的上樣液。

圖4 (a) 717型樹脂對綠原酸的吸附穿透曲線；(b) AB-8型樹脂對總黃酮的吸附穿透曲線

Fig.4 (a) The leaked adsorption curve of the chlorogenic acid on 717 anion exchange resin; (b) The leaked adsorption curve of the total flavonoids on AB-8 resin

2.3 洗脫劑的影響

離子交換樹脂在洗脫過程中為了更利于目標物被洗脫，需要使目標物能夠在洗脫過程中趨向于游離態。因此在綠原酸的洗脫過程中，采用酸性的乙醇溶液來作為洗脫劑。

乙醇含量對綠原酸的洗脫的影響如表1所示。由表1知，隨著乙醇含量的增大，綠原酸的洗脫量隨之增加，說明綠原酸的洗脫率在逐漸的增加，洗脫效果越好；但當乙醇的含量達到90%時，綠原酸的洗脫率反而降低，因此最適宜的乙醇含量為乙醇含量為70%的乙醇溶液。

洗脫液pH值對綠原酸的洗脫的影響如表1所示。由表1知，當洗脫液的pH為3時，洗脫液中的綠原酸的洗脫量最大，這是由于綠原酸是一種多羥基的酚酸，在酸性的條件下便于綠原酸趨向于游離態，從而容易被洗脫下來，故隨著酸性的增強，對綠原酸的洗脫效果也越好。但是過強的酸性會使得綠原酸發生內酯化反應，從而降低洗脫液中綠原酸的含量，故選擇綠原酸的最佳洗脫pH為3。

結合洗脫劑的pH與乙醇含量對綠原酸洗脫效果的影響，確定最適宜的洗脫劑為pH為3的乙醇含量為70%的乙醇水溶液。

表1 乙醇含量與pH對綠原酸洗脫的影響Table1 Effect of different alcohol content and pH on the elution amount of chlorogenic acid

乙醇含量對總黃酮的洗脫的影響如圖5所示，結果表明，乙醇體積分數越高，對于總黃酮的洗脫效果越好。但由表1可知，體積分數為70%的乙醇溶液洗脫得到的總黃酮的量與體積分數為90%的乙醇溶液洗脫得到的總黃酮的量差別不大，考慮到實際生產過程中作為溶劑，乙醇的溶劑的成本高于水的成分，因此確定AB-8樹脂吸附總黃酮后最適宜的洗脫劑為乙醇體積分數為70%的乙醇溶液。

2.4 洗脫流速與體積的影響

洗脫流速與體積對綠原酸洗脫的影響如表2所示。表2表明，當洗脫液洗脫體積相同時進行洗脫，洗脫率隨著流速的降低而升高高，但當流速降低到一定程度時，由于流速的過慢會使洗脫時間增加而相應延長生產周期。故綜合考慮，717型樹脂的洗脫流速選擇2 BV/h為宜。當洗脫液體積達到2 BV時，綠原酸的洗脫率達到74.6%（共吸附得到綠原酸量為200 mg），在此之后基本無綠原酸洗脫出來，綜合考慮，717型樹脂的洗脫體積為2 BV。

洗脫流速對總黃酮的洗脫的影響如表3所示。表3表明用相同體積的洗脫液洗脫AB-8樹脂上吸附的總黃酮，流速越慢，洗脫液與樹脂接觸越充分，洗脫效果越好，但流速過慢不利于實際生產，因此對宜采用2 BV/h的洗脫流速。當洗脫液體積達到3 BV時，總黃酮的洗脫率達到85.5%（吸附得到的總黃酮量為416 mg），在此之后基本無總黃酮洗脫出來，綜合考慮，AB-型樹脂的洗脫也體積為3 BV。

表2 洗脫流速與體積對綠原酸洗脫的影響Table2 Effect of different alcohol flow speed and eluent volume on the elution amount of chlorogenic acid

表3 洗脫流速與體積對總黃酮洗脫的影響Table3 Effect of different alcohol flow speed and eluent volume on the elution amount of total flavonoids

2.5 裝置的分級方法驗證性實驗

收集柱1洗脫液和柱3洗脫液，測得柱1洗脫液中含有綠原酸149.1 mg，柱3洗脫液中含有總黃酮163.2 mg。按上述最佳條件重復操作，收集柱2洗脫液，測得洗脫液中含有的總黃酮量為216.4 mg。再將柱1洗脫液﹑柱2洗脫液和柱3洗脫液烘干得到干膏并稱重，得到柱1洗脫液﹑柱2洗脫液柱3洗脫液干膏重分別為236.5 mg﹑360.7 mg﹑180.6 mg。柱1洗脫后綠原酸的得率與純度分別為69.0%（水提液上樣體積50 mL﹑綠原酸含量4.32 g/L）與63.0%；柱2洗脫后總黃酮的得率和純度分別為85.5%（水提液上樣體積50 mL﹑總黃酮含量 5.06 g/L）與60.0%，經柱3處理洗脫后總黃酮的得率與純度變為64.5%與90.3%，說明PA有效將總黃酮與其他雜質分離開，純度明顯提高。

各取5 mL 717型樹脂和AB-8型樹脂裝柱并串聯，按最終確定的分級方法上樣﹑洗脫，測定，平行5次，測得綠原酸和總黃酮含量的RSD分別為2.9%和3.1%。取12 mL PA，將AB-8樹脂洗脫液按最終的分級方法上樣，洗脫，測定，平行5次，測得總黃酮的含量的RSD為2.1%。該結果說明本裝置分離方法的重復性較好。

同一根樹脂重復使用4次，每一次使用完畢后717型樹脂酸洗后水洗至中性，AB-8樹脂和PA每一次使用完畢后先用乙醇洗再水洗至無醇味。測定每次洗脫液中綠原酸和總黃酮的含量，結果RSD值分別為4.9%﹑4.2%和5.1%。說明樹脂重復使用4次，仍能達到要求，故將樹脂的使用周期定為4次，4次后需要按照樹脂活化方法重新再生樹脂方能投入使用。

3 總結

本文采用連續色譜分級分離裝置，對金銀花水提液中總黃酮和綠原酸實現連續分級分離。通過對裝置中不同樹脂對于目標組分的吸附洗脫實驗，獲得裝置的各項優化參數，并確定最適宜的分級條件：以2 BV/h的流速上樣流經717型樹脂和AB-8型樹脂，上樣液為生藥濃度0.2 g/ mL金銀花水提液（初始上樣pH為8，過717型樹脂后調節pH至4），上樣體積為10BV，并以2 BV/h的流速用3 BV的70%乙醇溶液（pH為3）﹑2 BV 70%乙醇溶液分別洗脫717型樹脂和AB-8樹脂；將AB-8樹脂洗脫液稀釋6.5倍，用5 BV./ h流速過PA柱全部上樣，再以3 BV/ h的流速將3 BV的70%乙醇溶液洗脫PA，將總黃酮和其他雜質的分離，得到純化后的總黃酮純度為90.3%。該裝置實現了金銀花水提液中綠原酸﹑總黃酮連續分級，且處理金銀花水提液總黃酮和綠原酸分離過程中同步實現了總黃酮的進一步純化，節約了后期精制的成本。

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Application of Continuous Grading System for Active Natural Products from Honeysuckle

Zheng Nairen, Shen Jie2, Chu Zhan Ying2, Zhang Weibing2, Deng Yulin1*
(1.Beijing Institute of Technology, Beijing, 100081; 2.East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

The natural product continuous grading chromatographic device was applied to the continuous fractionation of chlorogenic acid and total flavonoids in the aqueous extract of honeysuckle.The effects of the concentration of the sample, the pH of the sample solution and the eluent, the loading and the elution flow rate, loading volume, the ethanol content in the elution, the elution rate and the amount of the eluent on the grading efficiency were studied to obtain chlorogenic acid and total flavonoids in the extract of honeysuckle by the 717 type anion exchange resin, AB-8 macroporous adsorption resin and polyamide columns.The total flavonoids were further separated by polyamide column.The final yields of chlorogenic acid and total flavonoids were 71% and 64% with purities of 63.0% and 90.3%, respectively.

continuous grading device; honeysuckle; active natural product

TS244 [Document Code] A

10.11967/ 2017150211

TS244

A DOI：10.11967/ 2017150211

國家重大科學儀器設備開發專項課題（2012YQ04014005）

鄭乃仁，男，北京理工大學博士研究生，生物化工專業

鄧玉林，男，北京理工大學教授，研究方向：帕金森病的分子生物學病因﹑蛋白質組學﹑植物藥物活性成分分離制備與新藥研發﹑航天生物與醫學工程，Email：deng@bit.edu.cn.