連翹乙酸乙酯提取物體外抗氧化活性研究

黃春陽， 鄭鴻娟， 零新嵐， 梁華益， 黃春佳， 黃鎖義

(1.右江民族醫學院 臨床醫學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院 檢驗學院，廣西 百色533000；3.右江民族醫學院 藥學院，廣西 百色 533000;4.右江流域特色民族藥研究廣西高校重點實驗室，廣西 百色 533000)

連翹乙酸乙酯提取物體外抗氧化活性研究

黃春陽1， 鄭鴻娟1， 零新嵐2， 梁華益1， 黃春佳1， 黃鎖義3，4*

(1.右江民族醫學院 臨床醫學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院 檢驗學院，廣西 百色533000；3.右江民族醫學院 藥學院，廣西 百色 533000;4.右江流域特色民族藥研究廣西高校重點實驗室，廣西 百色 533000)

目的：研究連翹乙酸乙酯提取物的體外抗氧化活性，為其充分開發利用提供理論依據。方法：以乙酸乙酯為溶劑制備連翹乙酸乙酯提取液，通過分光光度法測定其對DPPH自由基的清除能力、用普魯士藍法測定其還原Fe3+的能力，并以丁基羥基茴香醚(BHA)為對照品測定連翹乙酸乙酯提取物對金屬亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力。結果：連翹乙酸乙酯提取物具有較強的DPPH自由基的清除能力和還原Fe3+能力，對亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力強。結論：連翹乙酸乙酯提取物的抗氧化能力強，且隨樣品液的濃度升高而增強，呈現良好的線性關系。

連翹；乙酸乙酯提取物；體外；抗氧化

連翹[Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl]為木犀科(Oleaceae)連翹屬植物，又名黃花條、連殼等，系多年生落葉灌木，其性微寒，味苦，歸肺、心、膽經，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效，臨床常用于急性風熱感冒、癰腫瘡毒、淋巴結核、尿路感染等癥，中醫素有“瘡家圣藥”之稱[1]。其果實內含木脂素、黃酮、環己乙醇衍生物、三萜和神經酰胺等多種化合物[2]?，F代醫學已證實氧化性應激與多種疾病的發生有關, 其中包括自身免疫性疾病、糖尿病、白內障、癌癥等的產生與發展都可由自由基及其代謝產物誘發。因此具有抗氧化活性的藥物引起了廣泛關注。有研究曾以甲醇及乙醇為溶劑探究其提取物抗氧化活性[3-4]，而采用乙酸乙酯為溶劑研究其提取物的抗氧化活性未見報道。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器

植物粉碎機FZ102(上海銳豐儀器儀表有限公司)、電子分析天平JA2003(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)、電熱式恒溫水浴鍋HHS-21-4(江蘇金壇宏凱儀器廠)、旋轉蒸發器RE-5299(上海振捷實驗設備有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070A(上海精宏實驗設備有限公司)、SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、752型紫外可見分光光度計(上海精學科學儀器有限公司)、80-2離心沉淀器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)。

1.1.2 試劑與藥材

乙酸乙酯、DPPH、無水乙醇、硫酸亞鐵、BHA、菲啰嗪、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純，連翹果實采購自百色藥店。

1.2 方法與結果

1.2.1 連翹乙酸乙酯提取液的制備

稱取50 g連翹干粉，500 mL乙酸乙酯中浸泡1 h后于80 ℃恒溫水浴鍋冷凝回流提取2 h，抽濾，濾液于旋轉蒸發器中減壓濃縮制成浸膏，準確稱取1 g浸膏以乙酸乙酯溶解并定容至100 mL容量瓶，配成不同濃度樣品液以備用。

1.2.2 連翹乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力測定[5]

DPPH為1,1-二苯基-2-苦肼基自由基的簡稱，在有機溶劑中為一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，具有單一電子或氫離子，于波長517 nm下有最大吸收。自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降，且下降呈線性關系，因此可借紫外/可見分光光度計來檢測自由基被捕捉的情形，從而評價樣品的抗氧化能力。以50%清除率時樣品溶液濃度(IC50)衡量樣品清除自由基能力，IC50越小表明清除能力越強[6]。

實驗方法參照文獻[5]并稍加改動。取5支10 mL具塞比色管，各加0.5 mL濃度為0.6 mmol/L的DPPH溶液，再分別加濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL樣品液各1 mL，無水乙醇定容至10 mL，混勻后室溫暗光下反應30 min，以無水乙醇調零于波長為517 nm的分光光度計下測定其吸光度。平行測定3次。

清除率(%)=[(A1-A2)/A1]×100%

A1:空白吸光度(t=0 min)

A2:反應30 min后吸光度

圖1 連翹乙酸乙酯提取液對DPPH·的清除率

實驗結果如圖1，在一定濃度范圍內隨樣品濃度增大其清除率也隨之增強，濃度為1.0 mg/mL時清除率高達71.39%，已超過IC50，表明連翹乙酸乙酯提取物對DPPH自由基具有很強的清除能力。

1.2.3 連翹乙酸乙酯提取液還原能力測定[7]

溶液中存在還原劑時，Fe3+和鐵氰化物復合物會接受還原劑給出的電子轉化為Fe2+形式的化合物，進而兩者反應生成普魯士藍{Fe4[Fe(CN)6]3}，其在700 nm處有最強吸收峰，溶液顏色由原來的黃色變成不同程度的綠色-藍色，故測定700 nm處的吸光度值即可測定亞鐵離子濃度。吸光度值越大，還原力越強。

根據文獻[7]報道的實驗方法測定。取5支大試管，向各管加濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL樣品液1 mL、 pH=6.6磷酸緩沖溶液2.5 mL、無水乙醇2 mL以及2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻并于50 ℃恒溫水浴鍋水浴20 min，取出后分別加10%三氯乙酸2.5 mL，于4 000 r/min離心機離心10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，于波長700 nm分光光度計下測定吸光度。平行測定3次。

圖2 連翹乙酸乙酯提取液還原能力

實驗結果如圖2，在一定濃度范圍內，隨著樣品濃度的增大其還原能力也隨之增強，表明以乙酸乙酯為溶劑的連翹提取物具有很強的還原能力。

1.2.4 連翹乙酸乙酯提取物對金屬亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力測定[5]

分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL濃度為0.2 mg/mL的樣品液及對照品BHA于10 mL具塞比色管中，加0.2 mol/L硫酸亞鐵0.1 mL，混勻，再加入5 mmol/L菲啰嗪0.2 mL，無水乙醇定容至5 mL，劇烈震蕩后室溫靜置10 min，以無水乙醇調零于波長為562 nm分光光度計下測定吸光度。

螯合率(%)=[(A0-A1)/A0]×100%

A0:不加樣品(或對照品BHA)

A1:加入樣品(或對照品BHA)

圖3 連翹乙酸乙酯提取液和 BHA對金屬亞鐵離子(Fe2+)螯合能力

實驗結果如圖3，一定濃度下的樣品液及對照

品BHA隨著加入體積的增大其對金屬亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力也隨之增強，且同等濃度和體積下的樣品液對金屬亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力強于BHA，表明連翹乙酸乙酯提取物對金屬亞鐵離子(Fe2+)具有很強的螯合能力。

2 結 論

實驗研究表明連翹乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力、還原能力、對金屬亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力均具有較好的作用，且其螯合能力比對照品(BHA)強。實驗結果表明連翹乙酸乙酯提取物具有較強的抗氧化能力，且其抗氧化能力在一定的樣品濃度范圍內呈現良好的量效關系。連翹資源豐富，生物活性多樣，臨床用途廣泛，療效確切，毒副作用低，具有抗菌、抗病毒作用，對急性腎炎、肺結核、視網膜黃斑區出血、呃逆、便秘等都具 有一定的作用，此外還有鎮吐、解熱、抗炎以及肝臟保護等作用[8]，因此很有發展前途。本實驗研究連翹果實乙酸乙酯提取物的抗氧化活性，可充分提取其有效的化學成分，并利用無水乙醇作為中間介質，解決了實驗過程中出現的乙酸乙酯及其提起液不溶于水等其他溶液而分層的現象，為連翹的綜合開發利用提供理論依據。

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[2] 鄒瓊宇，鄧文龍，蔣舜媛，等.連翹果實中的化學成分研究[J].中國中藥雜志，2012，37(1)：57-60.

[3] 秦宇，張文麗，林媛媛，等.連翹化學成分與抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(10)：149-152.

[4] 吳艷芳，王新勝，陳蓉，等. 連翹藥材提取物體外清除自由基的作用[J].新鄉醫學院學報，2012，29(3)：172-173，176.

[5] 李遠輝，郭圣奇，黃挺章，等. 薏苡葉乙酸乙酯提取物的體外抗氧化活性研究[J].時珍國醫國藥，2015，26(5)：1051-1053.

[6] 柳愛蓮，劉繡華.天然產物抗DPPH自由基活性研究[J].周口師范學院學報，2007，24(5)：80-82.

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Study of Antioxidant Property of the Extract fromForsythiasuspenseEthyl Acetate

Huang Chunyang1，Zheng Hongjuan1，Ling Xinlan2，Liang Huayi1，Huang Chunjia1，Huang Suoyi3，4*

(1. School of Clinical Medicine, Youjiang Medicine University for Nationalities, Baise 533000,China;2. School of Clinical Laboratory Medicine, Youjiang Medicine University for Nationalities,Baise 533000,China; 3. School of Pharmacy, Youjiang Medicine University for Nationalities,Baise 533000,China; 4.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley, Baise 533000, China)

Objective：To study the antioxidant activityinvitroof extract fromForsythiasuspenseethyl acetate, so as to provide theoretical foundations for the full development and utilization. Methods：Ethyl acetate was used as the solvent to prepareForsythiasuspenseethyl acetate extracting solution. Spectrophotometry was employed to test its scavenging activity toward DPPH free radical, while Prussia was used to test its ability of restoring Fe3+. Also, butyl hydroxyl anisd (BHA) was used as reference substance to test the chelating ability ofForsythiasuspenseethyl acetate extract toward Fe2+. Results:Forsythiasuspenseethyl acetate extract has relatively strong ability of scavenging DPPH free radica and restoring Fe3+, as well as chelating Fe2+. Conclusion：Forsythiasuspenseethyl acetate extract has a strong antioxidant activity, which increases with the concentration of sample solution and appears favorable linear relations.

Forsythiasuspense; extracts of ethyl acetate;invitro;antioxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.005

2016-04-02

黃春陽(1991—)，女，本科在讀。研究方向：中藥有效成分提取。E-mail：huangchunyangy@163.com

國家中醫藥管理局"十二五"中醫藥重點學科中藥化學建設項目(國中醫藥人教發[2012]32號)；廣西重點學科藥物化學建設項目(桂教科研[2013]16號)；廣西高?？萍紕撔履芰μ嵘こ探ㄔO項目和右江流域特色民族藥研究廣西高校重點實驗室項目(桂教科研[2014]14號)；右江民族醫學院大學生創新研究團隊校級科研課題資助項目(右醫科字[2014]2號)；廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室開放課題(kfkt2016043)。

Q946

A

1006-9690(2017)01-0015-03

*通訊作者： 黃鎖義(1964—)，男，教授，碩士研究生導師。研究方向：天然產物化學、藥物化學、食品衛生、中草藥與植物化學。E-mail：huangsuoyi@163.com