不同季節的顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素和總黃酮的含量測定

雷華平， 馮紀南， 任名新， 張 輝

(湘南學院1．藥學院；2．化學生物與環境工程學院，湖南 郴州 423000)

不同季節的顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素和總黃酮的含量測定

雷華平1， 馮紀南2*， 任名新1， 張 輝1

(湘南學院1．藥學院；2．化學生物與環境工程學院，湖南 郴州 423000)

目的：測定不同季節和不同干燥方法的顯齒蛇葡萄中的二氫楊梅素和總黃酮的含量。方法：采用高效液相色譜法測定二氫楊梅素的含量。用三氯化鋁分光光度法測定總黃酮的含量；結果：五月的顯齒蛇葡萄中的二氫楊梅素含量最高；四月的顯齒蛇葡萄中的總黃酮含量最高。烘干法的樣品中總黃酮和二氫楊梅素最高。結論：4～5月為顯齒蛇葡萄的最佳采收期，采后烘干較好。研究結果為合理利用顯齒蛇葡萄資源提供了可靠依據。

顯齒蛇葡萄；二氫楊梅素；總黃酮；含量測定

顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)，又名藤茶,為葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物。分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省(自治區)。顯齒蛇葡萄全株藥用，味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、祛風濕、強筋骨等功效，用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎等癥狀[1]。從顯齒蛇葡萄莖葉中提取的總黃酮具有抗血栓、降脂、保肝、降血糖、抗炎、鎮痛和提高免疫功能的作用[1-2]。二氫楊梅素是其中最重要的黃酮類化合物，具有消炎、止咳、祛痰、鎮痛、抑菌、抗高血壓、消脂以及乙醇中毒等藥理作用[2-4],因而總黃酮和二氫楊梅素的測定是該藥材質量評價最為重要的依據。目前關于顯齒蛇葡萄總黃酮及其二氫楊梅素的測定已有報道[5-7]，但同時測定不同月份顯齒蛇葡萄中總黃酮及其二氫楊梅素的含量，還未見報道。

本文通過對不同季節的顯齒蛇葡萄中的總黃酮和二氫楊梅素的分析研究，了解其在不同生長期的動態積累規律，為適時采收顯齒蛇葡萄，合理開發利用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(泵L-7100，UV-Vis檢測器L-7420，柱溫箱L-7300，日本Hitachi公司)；色譜柱(Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，上海依利特分析儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(L-3010型，日本Hitachi公司)；數控超聲波清洗器(KQ2200E型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(AUY220，日本島津公司)；三重純水蒸餾器(SZ-97，上海勇規分析儀器有限公司)。

1.2 材料

乙醇(95%分析純，安徽安特食品股份有限公司)；石油醚(沸程：60～90 ℃，天津市光復科技發展有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；結晶氯化鋁(分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司)；二氫楊梅素對照品(西安開來生物工程有限公司)。

顯齒蛇葡萄于2014年的4月到12月的每個月的中旬采于湖南省郴州市湘南學院后山，經湘南學院彭名勇副教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬的顯齒蛇葡萄A.grossedentata,因1—3月顯齒蛇葡萄幾乎沒有葉子，故未采集樣品。

2 實驗方法與結果

2.1 不同季節的顯齒蛇葡萄的二氫楊梅素的含量測定

2.1.1 顯齒蛇葡萄的前處理

將采集的不同季節的顯齒蛇葡萄陰干，干燥后用粉碎機粉碎，放于干燥處。

2.1.2 樣品溶液的制備

取顯齒蛇葡萄約5 g(粉碎，過20目篩)，精密稱定，置索氏回流器中，加石油醚適量加熱回流2 h,揮干石油醚，得藥渣，精密稱定。精密稱取藥渣1 g，精密加入95%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取已知含量的二氫楊梅素對照品10 mg于10 mL容量瓶中, 用甲醇定容至刻度 , 充分搖勻備用。

2.1.4 二氫楊梅素標準曲線的測定

精密吸取2.1.3配制的二氫楊梅素對照品溶液0.2,0.4,0.8,1.2，2.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容，應用前經過0.45 μm微孔濾膜過濾。色譜柱: Hypersil BDS 不銹鋼柱(4.6 mm ×250 mm),流動相:甲醇-水-磷酸(27∶73∶0.1) ；流速: 1.0 mL/min；進樣量:25 μL；柱溫:30 ℃；檢測波長：294 nm。以濃度為X軸，以峰面積為Y軸，繪制標準曲線。得標準曲線回歸方程：Y=338 07X+492 88,線性范圍為20～200 μg/mL(R2=0.999 1)。

2.1.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液 25 μL，連續進樣 6 次，記錄峰面積， RSD值為0.8%，結果表明，精密度良好。

2.1.6 重復性試驗

精密稱取同一樣品6份，每份 5.000 g，分別按2.1.2項下操作制備供試品溶液，進樣 25 μL，記錄峰面積，RSD 值為 1.2%，結果表明本方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗

對同一供試品溶液在12 h內每隔2 h 進樣 1 次，記錄峰面積，RSD 值為 1.4%。結果表明，供試液在 12 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知量的樣品粗粉6份，每份 5.000 g，定量加入適量的對照品溶液，按供試品液制備法制備供試液，HPLC測定，記錄峰面積，計算平均回收率。平均回收率為 97.5%，RSD值為 2.0%。

2.1.9 樣品含量測定

精密量取樣品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，應用前經過0.45 μm微孔濾膜過濾。色譜條件見2.1.4。記錄不同季節顯齒蛇葡萄樣品溶液的峰面積，結果見表1。

2.2 不同季節的顯齒蛇葡萄的總黃酮的含量測定

2.2.1 樣品溶液的制備

同2.1.2處理。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取已知含量的二氫楊梅素對照品10 mg于10 mL容量瓶中, 用95%乙醇定容至刻度 , 充分搖勻備用。

2.2.3 最大波長的確定

精密量取二氫楊梅素對照品母液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1 mL蒸餾水，加入3 mL 5% AlCl3乙醇溶液，再加95 %已醇定容至刻度，顯色40 min，于紫外可見分光光度計掃描波長，確定最大吸收波長為312 nm。這與何桂霞等[7]測定瑤族藤茶總黃酮含量時選擇的λmax=314 nm相差不大，故選擇312 nm為最大吸收波長。

2.2.4 總黃酮標準曲線的測定

分別吸取對照品溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL于10 mL的容量瓶中，分別向各個容量瓶中加入1 mL蒸餾水和3 mL 5% AlCl3乙醇溶液，用95%乙醇稀釋至刻度，于最大波長處測得各吸光度A值。每組做兩次平行實驗，繪制標準曲線，以濃度為X軸，吸光度為Y軸。得標準曲線回歸方程：Y=0.057 4X+0.205 3,線性范圍為0～60 μg/mL(R2=0.9943).

2.2.5 總黃酮的含量測定

從樣品溶液中量取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容到刻度，充分搖勻，再在上述容量瓶中吸取0.5 mL的溶液置于10 mL容量瓶中，加水1 mL，加入5% AlCl3乙醇溶液3 mL，再加95%乙醇定容至刻度，顯色40 min，于最大波長處測得吸光度A值。為避免偶然誤差，再重復上述操作兩次，記錄數據。結果見表1。

表1 不同季節顯齒蛇葡萄總黃酮 和二氫楊梅素的含量(n=3)

由表1可以得出，在4月到12月的顯齒蛇葡萄中，不同月份顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量差異很大，其中四月的顯齒蛇葡萄中總黃酮的含量最高，5月的顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的含量最高。

2.3 不同干燥工藝的顯齒蛇葡萄的二氫楊梅素和總黃酮的含量測定

2.3.1 顯齒蛇葡萄的前處理

將4月在湘南學院后山采集的新鮮的顯齒蛇葡萄平均分成4份，分別用曬干、陰干以及置于50 ℃的烘箱中烘干6小時以及殺青后曬干的方法進行處理，處理完之后用粉碎機粉碎，放于干燥處保存。

2.3.2 樣品溶液的制備

分別取4種干燥工藝干燥的顯齒蛇葡萄約5 g(粉碎，過20目篩)，精密稱定，同2.1.2處理。

2.3.3 二氫楊梅素的含量測定

同2.1.9處理。

2.3.4 總黃酮的含量測定

同2.2.5處理。

表2 不同干燥工藝顯齒蛇葡萄總黃酮 和二氫楊梅素的含量(n=3)

由表2可見，50 ℃烘干處理的顯齒蛇葡萄中的總黃酮和二氫楊梅素的含量最高。

3 討 論

(1) 黃酮類化合物水溶性較差，醇溶性較好，故提取時需用乙醇作溶劑。乙醇作溶劑時，不可避免地將脂溶性色素一起提取出來，這將干擾比色測定，故樣品先以石油醚回流脫脂，以剔除其干擾。脫脂后的樣品進行超聲提取，比熊皓平等[8]的回流提取縮短了提取時間。

(2) 從實驗結果可以看出，在不同月份總黃酮的變化趨勢與二氫楊梅素的變化趨勢基本一致。4～5月的顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量最高，然后逐漸回落，在8月份有個小高峰，9月之后逐漸回升。因此，顯齒蛇葡萄的最佳采收季節是4～5月份，這與民間的采摘日期一致。

(3) 本文討論不同季節的同一產地的顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量，以及不同干燥方法對有效成分含量的影響，為合理栽培和采收顯齒蛇葡萄提供了科學依據。

[1] 陳曉明,倪峰.藤茶藥理作用研究進展[J].海峽藥學,2010，22(1)：16-17.

[2] 劉建新,周天達. 瑤族藤茶對兔腸平滑肌的影響和解酒實驗研究[J].中國民族醫藥雜志,1998，4(2)：43.

[3] 鐘正賢, 覃潔萍, 周桂芬,等. 廣西瑤族藤茶中雙氫楊梅樹皮素的藥理研究[J].中國民族醫藥雜志,1998, 4(3)：42-44.

[4] 周天達，周雪仙.藤茶中雙氫黃酮醇的分離結構鑒定及其藥理活性[J].中國藥學雜志, 1996，31(8)：458-461 .

[5] SHEN YI, LINDEMEYER A K, GONZALEZ C, et al. Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication[J] J Neurosci， 2012, 32(1)：390-401.

[6] 田森林，張友勝,楊英雄，等.反相高效液相色譜法測定顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的含量[J].湖南農業大學學報，2002，28(1)：33-34.

[7] 何桂霞,裴剛,周天達,等.顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測定[J].中國中藥雜志,2000，25(7)：424-425.

[7] 何桂霞，何群，裴剛，等.瑤族藤茶中總黃酮類成分的含量測定[J]. 湖南中醫藥導報，1998，5(12): 30-31.

[9] 熊皓平，楊偉麗，何國慶，等. 分光光度法測定顯齒蛇葡萄總黃酮含量[J]. 食品科學，2004，25(2)：144-145.

Determination of Dihydromyricetin and Total Flavones inAmpelopisgrossedentatain Different Seasons

Lei Huaping1, Feng Jinan2*, Ren Mingxin1, Zhang Hui1

(1.School of Pharmaceutical Sciences; 2. School of Chemistry, Biology and Environmental Engineering，Xiangnan University, Chenzhou 423000, China)

Objective: To determine the content of the total flavones and dihydromyricetin ofAmpelopisgrossedentatafrom different seasons with different drying methods. Methods: High performance liquid chromatography was employed to determine dihydromyricetin content. And total flavones were determined with AlCl3spetrophotometer method. Results:A.grossedentatain May had the highest content of dihydromyricetin. AndA.grossedentatain April had the highest content of total flavones. The sample with oven drying had the highest content of dihydromyricetin and total flavones. Conclusion: The optimum picking time forA.grossedentatawas between April and May. After picking the sample should be oven dry. The research provided a reliable gist for rational utilization ofA.grossedentata.

Ampelopisgrossedentata; dihydromyricetin; total flavones; content determination

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.011

2016-04-23

湖南省自然科學基金項目(20015JJ3111)；郴州市科技計劃項目(2012cj125)。

雷華平(1979—)，男，博士，副教授，主要從事中藥資源化學研究。E-mail: audenlei@163.com

*通訊作者： 馮紀南，E-mail: czffjjnn@163.com

R284.1

A

1006-9690(2017)01- 0037-03