成年遼寧絨山羊皮膚毛囊周期性發育不同時期FGF5mRNA的表達分析

王龍濤，葛晨霞，谷 博，孫麗敏，姜懷志

（吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118）

成年遼寧絨山羊皮膚毛囊周期性發育不同時期FGF5mRNA的表達分析

王龍濤，葛晨霞，谷 博，孫麗敏，姜懷志

（吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118）

成纖維細胞生長因子（FGF5）基因在次級毛囊的周期性發育過程中具有重要的調控作用。利用RT-PCR技術檢測了FGF5基因mRNA在成年遼寧絨山羊皮膚毛囊不同時期（興盛前期、興盛期、退行期和休止期）的表達規律。結果表明：FGF5基因mRNA在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達，表達量由高到低順序依次為休止期、興盛期、退行期和興盛前期；在休止期表達量最高，興盛前期表達量最低；其中休止期表達量與興盛前期和退行期間差異均顯著（P<0.05），興盛前期與其余3個時期間也差異顯著（P<0.05），但休止期與興盛期、興盛期與退行期間差異均不顯著（P>0.05）。因此，FGF5基因表達可能控制著絨山羊的毛囊從興盛期向退行期轉換。

遼寧絨山羊；皮膚毛囊；FGF5基因；RT-PCR

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）作為一種能夠誘導成纖維細胞生長的活性物質，在脊椎動物體內和無脊椎動物體內廣泛存在。迄今為止，FGF家族一共被鑒定出23種［1］，FGF5是FGF家族的第5個成員。研究表明，FGF5是毛囊周期性活動的一種重要的生長因子，與毛囊的發育以及被毛生長有著密切關系［2－3］，是所有已知成纖維因子中控制毛囊從興盛期向休眠期轉換的最強有力因子。Suzuki等［4］、高愛琴等［5］、韓薩茹拉［6］研究認為，絨山羊被毛的長度與FGF5因子息息相關，FGF5可能是通過控制毛囊生長期的長短影響被毛的長度，從而達到抑制毛囊細胞的生長和分化的目的。目前，有關FGF5基因對遼寧絨山羊皮膚毛囊發育調控作用的研究報道還不夠深入。本研究從處于不同周期性發育時期的成年遼寧絨山羊中采取皮膚組織，采用實時熒光定量PCR技術，對FGF5基因mRNA的相對表達量進行分析，旨在為揭示遼寧絨山羊皮膚絨毛發生的分子調節機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物的選擇及皮膚樣品采集

遼寧絨山羊來自吉林亞亨農牧科技發展有限公司。分別于毛囊年度周期性發育的不同時期，即3—5月（休止期）、6—8月（興盛前期）、9—11月（興盛期）以及12—翌年2月（退行期），選擇年齡相同、體況相近的周歲遼寧絨山羊5只，在羊體右側肩胛骨后沿背中線與腹中線的1/3體側位置取1 cm2大小皮膚樣本，放入液氮中快速冷凍保存。

1.2 主要儀器設備與試劑

總RNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自TOYOBO公司；PCR Master Mix購自康為世紀公司；DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、反轉錄試劑盒、純化試劑盒、6×DNA loading buffer購自Takala寶生物（大連）有限公司；低溫離心機購自Sigma公司，電泳儀購自北京六一儀器公司，核算蛋白測定儀、PCR儀、凝膠成像系統購自Bio-rad公司，熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 引物的設計與合成

根據GenBank上公布的羊FGF5（HQ678172.1）和βactin mRNA（GQ372826.1）序列，用Premier 5.0軟件分別設計VEGF和β-actin的引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 表達基因的引物序列信息

1.4 方法

根據試劑盒說明書進行總RNA提取以及反轉錄操作。以反轉錄所得 cDNA為模板，對 FGF5和 β-actin基因進行PCR擴增。PCR擴增反應條件：FGF5基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環，72℃ 5 min；β-actin基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環，72℃ 5 min，4℃保存。對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以純化后的cDNA為模版，以β-actin基因作為內參基因，采用SYBR熒光染料方法，對目的基因FGF5進行相對定量PCR反應。PCR反應體系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，cDNA模版 2 μL，RNase Free H2O 6.4 μL，總體積 20 μL。PCR反應條件：95℃ 60 s；95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，40個循環。

1.5 統計分析

應用SPSS 18.0軟件計算實時熒光定量PCR重復樣品間Ct值及標準偏差；采用2－ΔΔCt法處理數據，分析基因相對表達差異量。所有數據均進行單因子方差分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 遼寧絨山羊皮膚組織總RNA提取

由圖1中可見，所提取的總RNA電泳條帶清晰，并沒有基因組DNA污染，完整性良好。用核酸蛋白測定儀對其純度進行測定，所有樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，符合后續試驗對RNA質量的要求。

圖1 總RNA電泳結果

2.2 PCR擴增目的片段

瓊脂糖凝膠電泳（1%）檢測FGF5基因目的片段的擴增情況，發現擴增得到的片段與目的基因基本相符，沒有二聚體產生（圖2）。

2.3 熒光定量PCR分析

2.3.1 標準曲線及擴增曲線 反應結束完成后，根據各擴增曲線得到的Ct值，制作標準曲線。由圖3可見，標準曲線上的4個標準點都在一條直線上，擬合度高；PCR溶解曲線形成單峰，說明擴增特異性較好，可信度較高。

圖2 FGF5和β-actin基因的PCR產物

2.3.2 qPCR檢測 采用qPCR方法，檢測不同時期的成年遼寧絨山羊皮膚毛囊組織中FGF5基因的表達量，并通過Ct值與標準曲線計算每個樣品基因與相應內參基因的表達相對值（表2）。結果表明，FGF5基因mRNA在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達，在休止期表達量達到最高峰，在興盛前期表達量達到最低峰：其中表達量在休止期與興盛前期和退行期間差異顯著（P<0.05），興盛前期與其余3個時期間也差異顯著（P<0.05），休止期與興盛期、興盛期與退行期間差異均不顯著（P>0.05）。

表2 FGF5熒光定量PCR定量結果

圖3 FGF5基因的標準曲線及溶解曲線

3 討論

FGF5與毛囊的發育有著密切的關系，是影響被毛生長最重要的生長因子。Hebert等［2］和Sundberg等［7］分別采用基因敲除等方法研究證實，FGF5與毛囊發育有著密切關系，是毛囊周期性活動以及被毛生長的一個極其重要的生長因子，是已知的調控毛囊發育的各種因子中控制毛囊從興盛期向休眠期轉換最強有力的因子。隨后Housley等［8］、Dr?gemüller等［9］、李春笑等［10］在犬、貓和兔等動物的研究中證實，FGF5基因外顯子突變與動物的產毛量相關聯。劉海英等［11］和韓薩茹拉等［6］通過對FGF5基因在內蒙古絨山羊不同時期皮膚的表達證實，該基因可以在絨山羊皮膚毛囊發育周期中的各個時期表達，并且該基因突變位點僅與絨山羊的纖維長度和含絨率相關，而與絨纖維直徑不相關。高愛琴等［5］研究表明，在內蒙古絨山羊毛囊的生長旺盛期和退行期FGF5基因均有表達。而何永新等［12］在太行黑山羊的研究中發現，興盛期的FGF5基因mRNA表達量顯著高于退行期。本研究發現，FGF5基因在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達，并以興盛期為最高。與上述相關研究報道相一致，說明FGF5主要控制著絨山羊的毛囊從興盛期向退行期轉換。

［1］ Souletl，Chevete，Lemaitreg，et al.FGFs and their receptors，in vitroand in vivo studies：newFGF receptor in the brain，FGF-1 in muscle，and the use of functional analogues of low-affinity heparin-binding growth factor receptors in tissue repair［J］.Mol Reprod Dev，1994，39-49.

［2］ Hebert J M，Rosenquist T，Martin G R.FGF5as a regulator of the hair growth cycle：Evidence from targeted and spontaneous mutations［J］. Cell，1994，78：1017-1025.

［3］ Petho-Schramm A，Muller H J，Paus R.FGF5and the murine hair cycle［J］.Arch Dermatol Res，1996，288（5/6）：264-266.

［4］ Suzuki S，Ota Y，Ozawa K，et al.Dual-mode regulation of hair growth cycle bytwoFGF5gene products［J］.J Invest Dermatol，2000，114（3）：456-463.

［5］ 高愛琴，李寧，李金泉，等.不同發育階段絨山羊皮膚中FGF5基因mRNA表達的RT-PCR檢測［J］.華北農學報，2008，23（1）：36-37.

［6］ 韓薩茹拉.成纖維生長因子5（FGF5）在絨山羊皮膚中表達及多態性分析［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2009.

［7］ Sundberg J P，Rourk M H，Boggess D，et al.Angora mouse mutation： altered hair cycle，follicular dystrophy，phenotypic maintenance of skin grafts，and changes in keratin expression［J］.Veterinary Pathology，1997，34（3）：171-179.

［8］ Housley D J，Venta P J.The long and the short of it：evidence that FGF5is a major determinant of canine‘hair’-itability［J］.Animal Genetics，2006，37（4）：309-315.

［9］ Dr?gemüller C，Rüfenacht S，Wichert B，et al.Mutations within the FGF5gene are associated with hair length in cats［J］.Animal Genetics，2007，38（3）：218-221.

［10］李春笑，蔣美山，陳仕毅，等.兔成纖維細胞生長因子（FGF5）基因SNP及其與產毛量的相關分析［J］.遺傳，2008，30（7）：893-899.

［11］劉海英，楊桂芹，張薇，等.FGF5基因對內蒙古絨山羊絨毛性狀的影響［J］.遺傳，2009，31（2）：175-179.

［12］何永新，陳玉林，姜維，等.太行黑山羊FGF5基因CDs區的序列特征及其表達規律研究［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2010，39（12）：45-50.

Expression of FGF5mRNA in Hair Follicles of Adult Liaoning Cashmere Goats in Different Periods

WangLongtao，Ge Chenxia，JiangHuaizhi，et al
（College ofScience and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

FGF5plays an important role in the developmental processes of secondary follicle.Using RT-PCR technology,this study was conducted to detect the expression pattern of FGF5mRNA of adult Liaoning cashmere goats in different periods.The result showed that FGF5gene mRNA were expressed in skin tissue of Liaoning cashmere goats in different periods，while the expression levels，from high to low，were telogen，anagen，catagen and proanagen，respectively.The expression level reached a peak in telogen and reached minimum peak in proanagen.The expression level between telogen and proanagen，catagen had significantdifferences（P＜0.05），andthedifferencebetweenproanagenandtheanagenwas significant（P＜0.05）.

Liaoningcashmeregoat；hair follicle；skin；FGF5gene；RT-PCR

S827.2

A

2095-3887（2017）02-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.002

2017-03-28

國家“十一五”科技支撐計劃項目（2009BADA5B03）；吉林省科技發展計劃項目（20080212）

王龍濤（1975-），男，博士。

姜懷志（1968-），男，教授，博士，博士生導師，主要從事綿山羊遺傳育種與種質資源創新研究工作。