一種新型的利用DSS交聯劑避免重鏈輕鏈干擾的免疫沉淀技術

張婉+陳健+陳恒玲

摘 要 抗體是含有4條多肽鏈的對稱結構，其中兩條較長的相對分子量較大的為重鏈，大小為55KDa，另外兩條較短的相對分子量較小的為輕鏈，大小25KDa。在免疫沉淀技術中如果目的條帶大小和重鏈輕鏈的大小一樣或接近將影響實驗結果的判斷。本文章通過DSS 使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯，即使高溫或還原劑作用下也不會破壞交聯的結構，而高溫或還原劑可以使抗體和抗原分開，從而達到SDS-PAGE 檢測到的條帶都是蛋白條帶而沒有重鏈輕鏈條帶的干擾的目的。

關鍵詞 DSS 重鏈 輕鏈 免疫沉淀

當抗原或抗原類似物侵入機體將誘導淋巴細胞尤其是漿細胞，分泌免疫球蛋白即抗體。本實驗用的是實驗室自制的多克隆抗體以及純化蛋白，并且把蛋白用針劑注射至兔子身體內部，兔子在出現免疫之后會產生抗體?？贵w的結構決定了抗體能夠與抗原的特異性相結合。通過觀察可以看出，抗體的結構圖形與“Y”字母相似，分子量大小為150KDa，重鏈和輕鏈結構是由抗體在高溫或還原劑作用下分解而來，在兩條比較長的相對分子量中較大的是重鏈即H鏈，其分子量的具體大小是55KDa，而兩條相對較短的中較小是輕鏈即L鏈，其分子量的具體大小是25KDa，“Y”兩個分支的頂端含抗原的特異性結合位點，由重鏈和輕鏈共同決定?？贵w具有較強而穩定的氨基酸結構，能夠特異結合到抗原上，被應用到免疫沉淀，免疫熒光，免疫組化等免疫學實驗技術中。

進行蛋白質與蛋白質亦或是蛋白質同遺傳物質之間互補作用的方法之一就是免疫沉淀?？贵w具有能夠同抗原進行特異性結合的特點，靈敏度高等優點，達到確定蛋白質機在體內的完整生理特性的效果?？贵w通過捕獲抗原達到富集，純化，目的蛋白或和目的蛋白相互作用的蛋白的目的。但傳統的實驗中如果目的蛋白與抗體的重鏈輕鏈的大小一致或接近時，將會影響實驗者對結果的判斷。因為傳統的實驗中，抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復合物在高溫或還原劑作用下分裂為抗原-抗體復合物和蛋白A/G磁珠，所以在后續的SDS-PAGE檢測中的上樣液含有抗體，結果中會出現抗體的重鏈和輕鏈有可能遮蔽目的蛋白條帶，影響實驗者對結果的判斷。本實驗中使用DSS交聯劑使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯，在高溫或還原劑作用下抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復合物分裂為抗原和抗體-蛋白A/G磁珠復合物，在后續的SDS-PAGE檢測中的上樣液將不含有抗體，凝膠結果中避免了抗體的重鏈和輕鏈的干擾，有利于實驗者對實驗結果進行精確分析。

1 實驗材料

1.1 主要儀器和試劑

DSS（Thermo scientific），抗體（實驗室自制），蛋白A/G磁珠（Roche），NP-40蛋白裂解液（Biosharp），苯甲基磺酰（PMSF）， SDS-PAGE凝膠試劑盒（博士德生物），4度超高速離心機（Thermo scientific），垂直混合儀（其林貝爾儀器公司），bio-rad蛋白電泳儀

1.2 動物材料

成熟昆明白小鼠（雄性）。

2 實驗方法

2.1 提總蛋白

實驗之前充分準備好各種實驗用品，包括手術器械、5ml玻璃軍均漿器、1.5mlEP管、1ml槍頭、200ul槍頭、10ul槍頭實行高壓滅菌，同時放在烘箱里面備用。4度離心機預冷，勻漿器放入冰盒中冰鎮，配蛋白裂解液（用120mM氯化鈉溶液配0.5%NP-40），1ml蛋白裂解液中加10ul，0.1mM的苯甲基磺酰，混勻，放入冰盒中。斷髓法處死小鼠，取小鼠睪丸組織100mg，稱量時用吸水紙盡量吸干組織表面的水分，之后轉存在冰鎮的里面，同時放入具有的蛋白裂解液來進行均漿，所有的操作過程都在冰上進行，把均漿全部轉移至管中1.5mlEP、4度、1000*g，離心10min。同時把清至轉移到新型的EP管里面，放在冰塊上面備用。

2.2 蛋白A/G磁珠與抗體結合

準備實驗試劑，配置溶液Ⅰ （0.01M中性磷酸鹽溶液）。對蛋白A/G進行震蕩，使得磁珠能夠完全混到液體內部，便于液體的吸取，并且吸取混勻的50ul液體至1.5mlEP里。1000*g、4度、離心1min，去除上清。使用200ul溶液進行磁珠的清洗，1000*g、4度、離心1min，之后進行磁珠兩次的重復清洗振蕩蛋白A/G磁珠瓶子，使磁珠充分混勻到。去除上清，往EP管內加入90ul溶液Ⅰ 和10ul一抗溶液。將EP管固定在垂直混合儀上，以合適的轉速使溶液混勻，在室溫狀態下孵育一個小時。在孵育之后，1000*g、4度、離心1min。棄去上清，EP管內加入200ul溶液Ⅰ清洗磁珠，此時抗體已和磁珠結合，1000*g、4度、離心1min。再次對磁珠進行兩次的清洗。

2.3 DSS交聯蛋白A/G磁珠和抗體

準備實驗試劑，配置2.5mM的DSS溶液，溶液Ⅱ0.1M，ph2.0。除去上述EP管內的上清，加入32ul溶液Ⅰ和18ul 2.5mM的DSS溶液，將EP管固定在垂直混合儀上以合適的轉速使溶液混勻，是室溫狀態下孵育一個小時。在結束相關交聯之后，1000*g、4度、離心1min。棄去上清，用50ul溶液清洗珠子，1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進行兩次清洗。除去上清，運用蛋白解液進行磁珠的清洗，1000*g、4度、離心1min。在結束清洗之后，除去上清，EP管放在冰上備用。

2.4 蛋白和一抗孵育

將2.1中提取的蛋白即上清加入到含有已經交聯一抗的蛋白A/G磁珠的EP管中即2.3的EP管中。將EP管固定于垂直混合儀上，以合適的速度旋轉，4度，過夜。

2.5 10%SDS-PAG凝膠檢測

實驗之前充分準備好實驗過程中需要的試劑，并進行電泳液的配置，tris-base 3.03g、18.77g氨基酸、1g sds，在充分溶解之后，使用蒸餾水對其。同時進行配置，0.25g的（R250）、50ml甲醇50ml，10ml的冰醋酸，在完全溶解之后，使用蒸餾水進行定容達到100ml。配置10%分離膠，蒸餾水2.7毫升，30%丙烯酰胺（29：1）3.3毫升，3.8ml的1MTris-hcl PH8.8、100微升的濃度為10%的SDS ，以及100微升的濃度為10%的過硫酸銨，在混勻之后添加4微升的TMEMD ，混勻，灌入已測漏的垂直玻璃板內，用蒸餾水液封。室溫聚合30分鐘。把上面運用在液封方面的蒸餾水倒去。同時配置濃度為5%的濃縮膠、2.7ml的、0.67ml濃度為30%的丙烯酰胺，0.5ml的1Mtris-hclPH6.8、40微升濃度為10%的SDS，在與40微升的濃度為10%的過硫酸銨攪勻之后，加入TMEMD 4微升，混勻，灌入垂直玻璃板內，在整個玻璃板被灌滿直至溢出的時候插入數字，室溫狀態下聚合半小時。

將上述樣品即2.4中蛋白抗體蛋白A/G磁珠復合物進行離心，1000*g、4度、離心1min。去上清液，加入200ul的蛋白裂解液往EP管中清洗磁珠，所進行的離心條件是1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進行兩次的重復清洗。去除上清，加入40ul溶液Ⅱ洗脫抗原，在室溫保持五分鐘。1000*g、4度、離心1min，收集上清，加入20ul溶液Ⅱ洗脫抗原，室溫5分鐘。將收集的洗脫液12000*g 4度 離心10min。將洗脫液轉移至新的EP管內（盡量不要吸到珠子）。往60ul洗脫液中加入15ul的5*loading buffer，混勻備用，往含有40ul磁珠的EP管中加入10ul的5*loading buffer混勻備用。將兩個EP管在沸水中煮8分鐘。含洗脫液的EP管12000*g，4度，離心2分鐘，收集上清備用。

把放電泳槽內部，同時倒進去電泳液，輕輕拔下梳子，進行點樣，點樣順序marker，煮沸的洗脫液即蛋白液，蛋白A/G磁珠。電泳條件，30v，60分鐘后電壓調至80v，保持2.5個小時。在結束電泳之后，把凝膠取出并放在玻璃皿里面，并把其倒入溶液里面進行染色，將玻璃皿轉移到搖床上，合適的轉速染色，時間40分鐘。在染色之后把染色液收回，運用凝膠脫色：將凝膠放在打的玻璃器皿中并加入自來水，之后放進微波爐里進行高溫加熱，七分鐘之后換水，再次依據上面的條件進行脫色，直到凝膠上面出現清晰的條帶。在結束脫色之后，對其進行拍照，實現實驗結果的保存（圖1）。切下的目的條帶可以進行后續質譜鑒定。

從圖1中可以看出抗體的重鏈輕鏈出現在蛋白A/G磁珠泳道，蛋白A/G磁珠和抗體在DSS作用下緊密交聯，蛋白液泳道是沒有重鏈和輕鏈的，說明DSS交聯劑成功避免了重鏈輕鏈對目的蛋白條帶的干擾。

3 結果與討論

從實驗結果中看出，抗體的重鏈和輕鏈出現在蛋白A/G磁珠泳道中而未出現在抗原液泳道中，說明DSS交聯劑可以有效避免抗體的重鏈輕鏈對實驗結果的干擾。免疫沉淀是以抗體與抗原特意性結合為基礎研究蛋白相互作用的經典方法。研究蛋白質間的相互作用對解釋疾病的機制如腫瘤異質性和藥物的研發如抗體藥具有重要意義。DSS交聯的免疫沉淀方法能夠避免重鏈輕鏈干擾，希望能為科研學者提供一個新思路。綜上所述，本實驗的優點可以分為以下三點：DSS交聯劑能夠成功避免免疫沉淀中抗體的重鏈輕鏈對實驗結果的干擾；DSS交聯劑與其他方功法如使用試劑盒（pierce）相比較，樣品可以進行后續的質譜鑒定，為開展功能試驗打下基礎；DSS交聯劑溶液配置方便，使用簡單，與使用實驗盒相比較極大地降低了實驗成本。

*通訊作者：陳恒玲

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