嵌合突變嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶結構域B對酶學性質及功能的影響

谷海濤，李松，陳阿娜

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)2(江蘇諾泰生物制藥股份有限公司，江蘇 連云港，222000)

嵌合突變嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶結構域B對酶學性質及功能的影響

谷海濤2，李松1*，陳阿娜1*

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)2(江蘇諾泰生物制藥股份有限公司，江蘇 連云港，222000)

為考察嗜酸普魯蘭芽孢桿菌(Bacillusacidopullulyticus)普魯蘭酶結構域B對熱穩定性及其他酶學特性和功能的影響，采用嵌合蛋白技術將B.acidopullulyticus普魯蘭酶的結構域B置換為Geobacillusthermoleovorans普魯蘭酶結構域B。嵌合突變體在60 ℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min，解折疊一半時的溫度由65 ℃提高至72 ℃，嵌合突變體較野生型具有更加優良的動力學穩定性和熱動力學穩定性。結構域B置換后，最適pH堿向偏移至pH6.5，最適溫度提高至70 ℃。比酶活及底物特異性實驗結果顯示，嵌合突變削弱了酶分子與普魯蘭多糖的結合，轉而有利于與糊精及可溶性淀粉的結合。淀粉糖化結果顯示，嵌合突變不影響突變體的實際應用性能。上述結果表明，B.acidopullulyticus普魯蘭酶結構域B對酶蛋白酶學性質影響顯著，可通過同源置換構建適合于不同淀粉糖化工藝的突變體。

嵌合蛋白；普魯蘭酶；結構域B；酶學特性；淀粉糖化

普魯蘭酶是一種雙向催化酶，能夠催化普魯蘭多糖、淀粉等多聚葡萄糖類底物分支部位的α-1,6-糖苷鍵的水解[1-3]，特定條件下也能催化α-1,6-糖苷鍵的反向合成[4-7]，因而可應用于糖苷化合物分子結構解析、淀粉原料糖化以及功能糖化合物合成等諸多領域[8]。當前該酶被廣泛地應用于淀粉糖工業中，成為高品質糖漿生產過程中的關鍵酶制劑[9-10]。淀粉糖化過程需要在高溫(60 ℃)下進行，糖化時間一般為48～60 h，普魯蘭酶必須具備在高溫下保持較高酶活性和穩定性的能力，篩選或通過分子改造構建耐高溫普魯蘭酶對于淀粉糖化過程中降低使用成本和改進工藝具有重要意義[11-12]。

嵌合型蛋白質(Chimeric protein)是利用基因工程技術，將一個蛋白質分子的部分序列插入或取代另一個蛋白質分子的序列所產生的、兼有兩種原來蛋白質序列和特點的新蛋白質[13-14]。近年來一些研究將嵌合蛋白技術應用于蛋白質功能改造上，取得了較好的效果[15-18]。普魯蘭酶隸屬于α-淀粉酶家族，該家族結構域B位于TIM-桶狀結構的第3個β-折疊和第3個α-螺旋之間，參與形成活性口袋和TIM-桶壁，在不同酶中的大小和結構差異較大。通過定點突變和隨機突變結果表明該部位在淀粉酶中可能相對比較脆弱，與酶的總體穩定性關聯密切，其中部分氨基酸的改變對酶的熱穩定性和pH穩定性影響較為顯著[19-20]。

來源于G.thermoleovorans的I型普魯蘭酶具有極好的耐熱性，在較低濃度的鈣離子(0.1 mmol/L)存在條件下，75 ℃下的半衰期為4 h[21]。G.thermoleovorans普魯蘭酶與B.acidopullulyticus普魯蘭酶(PulA)具有36%的氨基酸同源性，結構域B處的氨基酸同源性更是高達44.7%。本課題設計將PulA的結構域B替換成G.thermoleovorans普魯蘭酶的結構域B(GTPB)，構建嵌合型蛋白質(PulA-GTPB)，以提高PulA熱穩定性，并考察嵌合突變對其他酶學性質的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

E.coliBL21(DE3)和質粒pET28a(+)-PulA為本實驗室保存和構建，PulA為B.acidopullulyticus普魯蘭酶編碼基因(GeneBank Accession No. Ax203843.1)；G.thermoleovorans普魯蘭酶結構域B編碼基因(GeneBank Accession No. AJ315595.1)由Invitrogen(上海)貿易有限公司合成，并連接于pMD18-T simple vector上。嵌合型質粒命名為pET28a(+)-PulA-GTPB

1.2 嵌合型基因的構建

嵌合型基因的構建采用定點突變試劑盒Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent公司，美國)進行。為提高實驗成功概率，不進行單次結構域置換，并將該過程分2步進行：首先，刪除PulA結構域B基因(1672-1785)，引物采用P1和P2；經測序刪除無誤后，插入G.thermoleovorans普魯蘭酶結構域B基因(1039-1152)，采用引物P3和P4進行插入序列的擴增(表1)。所需分子操作及程序參數參照試劑盒說明進行。

表1 插入突變的引物序列

1.3 培養基和培養條件

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。改良型TB培養基(簡稱為M-TB，g/L)：胰蛋白胨12.0，酵母粉24.0，甘油10.0，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 12.55，pH 7.0。

種子培養條件：取-80℃保存的菌種按0.1%的接種量接入LB培養基中，置于搖床上37 ℃，230 r/min培養10 h。發酵培養條件：取種子培養液按1%的接種量接入M-TB培養基中，置于搖床上37 ℃，230 r/min培養5.5 h(此時的OD600約為5～6)；加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，并下調誘導溫度至20 ℃，誘導目標蛋白表達，誘導時間20 h[22]。

1.4 生物量的測定

菌濃(OD600)采用沒有接種的培養基作空白，將發酵液用培養基適當稀釋(OD600在0.2～0.8)，用可見分光光度計檢測發酵液在600 nm處的吸光度值。

1.5 粗酶液制備、酶蛋白純化及定量

取1.0 mL發酵終點的發酵液，4 000 r/min，4 ℃離心30 min。將離心所得菌體用10 mmol/L PBS(pH 7.4)稀釋至OD600= 4.0～5.0后，用超聲破碎方法破碎菌體。超聲條件為25%功率，超2 s停2 s，總超聲時間6 min。將超聲破碎液10 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心上清即為粗酶液。

目標蛋白C端連接His-tag，純化采用Ni+柱親和層析方法。純化及定量具體操作參見文獻[23-24]。

1.6 酶活分析

普魯蘭酶酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸方法(簡稱DNS方法)。取適當稀釋的酶液0.1 mL加入到1.9 mL 1%的普魯蘭溶液中，置于60 ℃水浴中溫浴10 min，迅速加入3 mL DNS試劑終止酶解反應，并于沸水浴中煮沸7 min進行顯色反應。將上述反應液置于冰水中冷卻，并加入20 mL蒸餾水，混勻后于540 nm測定吸光度值。采用pH5.0的醋酸-醋酸鈉配制1%的普魯蘭溶液。1個酶活力單位定義為上述測定條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量(還原糖以葡萄糖為標準計)。

1.7 動力學穩定性和熱動力學穩定性

動力學穩定性以半衰期(t1/2)表示，測定時將酶液在60 ℃溫浴，每隔一定時間取樣測定殘余酶活。以未經溫浴的酶液酶活作為100%，其余酶活以相對百分比表示。以ln (殘余酶活%) 對溫浴時間作圖，采用線性回歸方法求得一級反應速率常數kd，半衰期t1/2= ln2/kd。

熱動力學穩定性以蛋白質溶解溫度(Tm)表示，測定采用圓二色譜儀進行。解折疊曲線測定條件：222 nm，溫度變化范圍20～90 ℃，蛋白質溶解在5 mmol/L醋酸鈉緩沖液中(pH 5.0)，蛋白質質量濃度控制在50 μg/mL。

其余酶學特征參數(最適pH及最適溫度、動力學參數、底物特異性)及淀粉糖化水解效果測定方法參見文獻[25]。

2 結果與分析

2.1 嵌合突變對菌體生長和酶催化性能的影響

嵌合蛋白是一種雜合蛋白，有可能兼具兩親本特點，也有可能因蛋白序列發生變化引起蛋白質構象發生改變或不能正確折疊而失去原蛋白性能[26-28]。嵌合型質粒pET28a(+)-PulA-GTPB構建成功后，轉化E.coliBL21(DE3)。發酵終點時，菌體生物量(OD600)與野生型PulA無明顯差別，表明嵌合型蛋白對菌體生長沒有影響(相對于野生型)。

然而，酶活測定結果表明嵌合突變對總酶活力的影響顯著，誘導20 h后嵌合型普魯蘭酶的總酶活力僅為野生型普魯蘭酶的47%。比酶活測定結果顯示，嵌合型PulA-GTPB的比酶活力是野生型PulA的43%(表2)。SDS-PAGE結果顯示2者可溶性表達量相近(圖2)。嵌合型蛋白PulA-GTPB對普魯蘭多糖的催化性能下降，嵌合突變影響了酶蛋白對α-1,6糖苷鍵的水解功能。

表2 野生型普魯蘭酶及其嵌合突變體總酶活及比酶活

M-蛋白質分子量(kDa)標準；樣品為單位菌體細胞破碎上清；箭頭所指之處為目標蛋白所在位置；1-PulA-GTPB；2-PulA圖2 野生型及其嵌合突變體SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of PulA and PulA-GTPB

2.2 嵌合突變對熱穩定性的影響

半衰期實驗結果顯示60 ℃時嵌合突變體及野生型普魯蘭酶酶活損失一半所需的時間分別為34.9 min和168.4 min，嵌合突變體半衰期是野生型普魯蘭酶的4.8倍。60 ℃溫浴30 min后嵌合突變體能保留初始酶活的95%，而野生型在同等條件下的殘余酶活僅為55%(圖3-A)。

通過研究嵌合突變體及野生型普魯蘭酶的溶解溫度，進一步研究兩者在熱動力學穩定性(Thermodynamic stability)上的差異。Tm實驗結果顯示嵌合突變體及野生型普魯蘭酶解折疊一半時的溫度分別為72.0℃和65.0℃(圖3-B)。結果表明突嵌合變體具有比野生型更加優良的熱穩定性。

(A)t1/2；(B) Tm圖3 野生型及其嵌合突變體的半衰期及溶解溫度Fig.3 The t1/2 and Tm of PulA and PulA-GTPB

2.3 嵌合突變對最適pH及最適溫度的影響

野生型普魯蘭酶最適pH為pH5.0，嵌合突變體最適pH為pH6.5，G.thermoleovorans普魯蘭酶結構域B使得嵌合酶最適pH堿向偏移。表明結構域B與酶的最適pH及酸堿穩定性密切相關(圖4-A)。嵌合突變體的最適溫度為70 ℃，較野生型提高了10 ℃。反應溫度為60 ℃時，相對酶活為70 ℃時的85%。反應溫度高于60 ℃時，仍能保持較高的相對酶活。如在80 ℃時，嵌合突變體的相對酶活為78%，而野生型普魯蘭酶的相對酶活僅為34%。表明嵌合突變體比野生型具有較好的耐熱性(圖4-B)。

(A) 最適 pH；(B) 最適溫度圖4 野生型及其嵌合突變體的最適pH及最適溫度Fig.4 The optimal pH and optimal temperature of PulA and PulA-GTPB

2.4 嵌合突變對酶促動力學參數的影響

動力學參數的測定在60 ℃，pH 5.0下進行，以普魯蘭多糖為底物，測定純酶在不同底物質量濃度下的初始反應速率。通過非線性回歸方法求得Vmax和Km，kcat=Vmax/[E]，其中[E]是酶濃度[29]。與突變前相比，嵌合突變體的Km值上升明顯，嵌合酶對普魯蘭多糖底物的親和力(Km)下降，催化效率僅有野生型的51%(表3)。

表3 野生型普魯蘭酶及其突變體動力學參數

2.5 嵌合突變對底物特異性的影響

以普魯蘭多糖、糊精、可溶性淀粉和牡蠣糖原為底物，對比考察嵌合突變對底物特異性的影響。用于測定底物特異性的底物濃度為0.25%。以普魯蘭多糖為底物時的酶活計為100%，其余酶活以相對百分比表示。實驗結果顯示，PulA-GTPB和PulA的最適底物均是普魯蘭多糖，且對高度分支的糖原沒有水解活性。然而，PulA-GTPB對糊精和可溶性淀粉的水解活性較野生型PulA有明顯上升(表4)。結合比酶活測定結果(嵌合突變體對普魯蘭多糖的催化性能下降明顯)進一步證實GTPB削弱了酶分子與普魯蘭多糖的結合，轉而有利于酶分子與糊精、可溶性淀粉等底物結合。

表4 野生型普魯蘭酶及其嵌合突變體底物特異性

注：-表示酶活在檢測線以下。

2.6 嵌合突變對淀粉糖化應用性能的影響

為考察嵌合突變對淀粉糖化實際應用效果的影響，以干基濃度為30%的玉米淀粉乳(按15L配制)為底物，經高溫酸性α-淀粉酶液化后，再加入糖化酶(120 U/g干基)和普魯蘭酶進行糖化。由于嵌合突變體PulA-GTPB的比酶活只有野生型PulA的43%，當按照0.5 U/g干基添加普魯蘭酶時，突變體的添加量是野生型的2.3倍。以只添加糖化酶的實驗組作為對照，測定各組料液中DE值(還原性糖以葡萄糖計)。糖化終點時，對照、野生型PulA和嵌合突變體PulA-GTPB糖化值分別為92.1%、93.6%和95.2%，復合酶糖化效果比只添加糖化酶的糖化效果好，嵌合突變體比對照和野生型糖化效果好。

等量嵌合突變體對普魯蘭的催化活力雖只有野生型的43%，但是對糊精的催化能力較野生型有顯著提升(表5)，因而實驗采用固定添加普魯蘭酶酶活單位的方式添加嵌合突變體，最終突變體的糖化效果優于野生型。為進一步降低應用成本，采用固定添加量的方式添加普魯蘭酶：野生型仍按0.5 U/g干基添加，嵌合型的理論添加量為 (0.5×43%) U/g干基。糖化終點時嵌合突變體PulA-GTPB糖化值為93.3%，與野生型相比無本質差異。該結果表明，嵌合突變不影響淀粉糖化實際應用性能(表5)。

表5 野生型普魯蘭酶及其突變體糖化效果

注：DE1固定添加酶活；DE2固定添加重量

3 結論

采用嵌合蛋白技術將B.acidopullulyticus普魯蘭酶結構域B置換為G.thermoleovorans普魯蘭酶結構域B，研究嵌合突變對B.acidopullulyticus普魯蘭酶熱穩定性及其他酶學性質的影響。得出以下結論：與野生型相比，嵌合突變體的熱穩定性大幅提高，較好地彌補了比酶活下降的不足，因而不影響淀粉糖化應用性能。此外，嵌合突變對最適pH、最適溫度、酶促動力學參數及底物特異性亦有顯著影響。上述結果表明B.acidopullulyticus普魯蘭酶結構域B對酶蛋白酶學性質影響顯著，研究結果可為普魯蘭酶定向分子改造提供依據，相關機理有待進一步研究。

[1] SINGH R S,SAINI G K,KENNEDY J F.Continuous hydrolysis of pullulan using covalently immobilized pullulanase in a packed bed reactor[J].Carbohydrate Polymers,2011,83(2):672-675.

[2] ALAGOZ D,YILDIRIM D,GUVENMEZ H K,et al.Covalent immobilization and characterization of a novel pullulanase fromFontibacillussp. Strain DSHK 107 onto Florisil?and nano-silica for pullulan hydrolysis[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2016,179(7):1 262-1 274.

[3] LI Shi-fang, XU Jian-yong, BAO Yun-juanet al.Structure and sequence analysis-based engineering of pullulanase fromAnoxybacillussp. LM18-11 for improved thermostability[J].Journal of Biotechnology,2015,210: 8-14.

[4] KITAHATAA S,TANIMOTO T,IKUTA A,et al.Synthesis of novel heterobranched beta-cyclodextrins from 4(2)-O-beta-D-galactosyl- maltose and β-cyclodextrin by the reverse action of pullulanase, and isolation and characterization of the products[J].Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,2000,64:1 223-1 229.

[5] YIM D K,PARK Y H.Production of branched cyclodextrins by reverse reaction of microbial debranching enzymes[J].Starch-Starke, 1997,49:75-78.

[6] YU Bo,TIAN Yao-qi,YANG Na,et al.A study on the inhibition mechanism of β-cyclodextrin on pullulanase[J].Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry,2011,70(1):161-165.

[7] GOURLAY L J, SANTI I, PEZZICOLI A,et al.Group B streptococcus pullulanase crystal structures in the context of a novel strategy for vaccine development[J].Journal of Bacteriology,2009,191(11):3 544-3 552.

[8] TAKIZAWA N,MUROOKA Y.Cloning of the pullulanase gene and overproduction of pullulanase inEscherichiacoliandKlebsiellaaerogenes[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,49(2):294-298.

[9] NIE Yao,YAN Wei,XU Yan,et al.High-level expression ofBacillusnaganoensispullulanase from recombinantEscherichiacoliwith auto-induction: effect of lacoperator[J].PLoS One,2013,8(10): e78416.

[10] TALEKAR S,PANDHARBALE A,LADOLE M,et al.Carrier free co-immobilization of alpha amylase, glucoamylase and pullulanase as combined cross-linked enzyme aggregates (combi-CLEAs):a tri-enzyme biocatalyst with one pot starch hydrolytic activity[J]. Bioresource Technology,2013,147: 269-275.

[11] SVENDSEN A.Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties:7906306[P]. 2011-03-15.

[12] DUAN Xu-guo,CHEN Jian,WU Jing.Improving the thermostability and catalytic efficiency ofBacillusderamificansPullulanase by site-directed mutagenesis[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(13):4 072-4 077.

[13] PARASHAR D,SATYANARAYANA T.A chimeric α-amylase engineered fromBacillusacidicolaandGeobacillusthermoleovoranswith improved thermostability and catalytic efficiency[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2016,43(4):473-484.

[14] SEO D H,JUNG J H,JUNG D H,et al.An unusual chimeric amylosucrase generated by domain-swapping mutagenesis[J].Enzyme and Microbial Technology,2016, 86: 7-16.

[15] CHANG C J, LEE C C, CHAN Y T,et al.Exploring the mechanism responsible for cellulase thermostability by structure-guided recombination[J]. PLoS One,2016,11(3):e0147485.

[16] WEN Guo-yuan,HU Xiao,ZHAO Kang,et al.Molecular basis for the thermostability of Newcastle disease virus[J].Scientific Reports, 2016,6:22492.

[17] SWIFT S M,SEAL B S,GARRISH J K,et al.A thermophilic phage endolysin fusion to a clostridium perfringens-specific cell wall binding domain creates an anti-clostridium antimicrobial with improved thermostability[J].Viruses,2015,7(6):3 019-3 034.

[18] CRUM M A,PARK J M,SEWELL B T,et al.C-terminal hybrid mutant ofBacilluspumiluscyanide dihydratase dramatically enhances thermal stability and pH tolerance by reinforcing oligomerization[J].Journal of Applied Microbiology,2015,118(4):881-889.

[19] STEFAN J.α-Amylase family: molecular biology and evolution[J].Progress in Biophysics & Molecular Biology,1997,67(1):67-97.

[20] WOODLEY J M.Protein engineering of enzymes for process applications[J].Current Opinion in Chemical Biology,2013,17(2): 310-316.

[21] ZOUARI AYADI D,BEN ALI M,JEMLI S,et al.Heterologous expression, secretion and characterization of theGeobacillusthermoleovoransUS105 type I pullulanase[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78(3):473-481.

[22] CHEN A-na, SUN Yang, ZHANG Wei, et al. Downsizing a pullulanase to a small molecule with improved soluble expression and extracellular secretion efficiency inEscherichiacoli[J].Microbial Cell Factories, 2016, 15(1):9.

[23] CHEN A-na, LIYa-mei, LIUXiu-xia, et al. Soluble expression of pullulanase fromBacillusacidopullulyticusinEscherichiacoliby tightly controlling basal expression[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2014, 41(12): 1803-1810.

[24] CHEN A-na,LI Ya-mei,NIEJian-qi et al.Protein engineering ofBacillusacidopullulyticuspullulanase for enhanced thermostability using in silico data driven rational design methods[J].Enzyme and Microbial Technology,2015,78: 74-83.

[25] 陳阿娜,劉秀霞,戴曉峰,等.N端截短對嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶酶學特性及功能的影響[J].生物工程學報,2016,32(3): 355-364.

[26] TOSSAVAINEN H,KUKKURAINEN S,MAATTA J A,et al.Chimeric avidin——NMR structure and dynamics of a 56 kDa homotetrameric thermostable protein[J].PLoS One,2014,9(6): e100564.

[27] SASAJIMA Y,KOHAMA Y,KOJIMA-MISAIZU M,et al.Simultaneous retention of thermostability and specific activity in chimeric human alkaline phosphatases[J].Molecular Biotechnology,2014,56(10):953-961.

[28] HANRui-zi,LI Jiang-hua,SHIN H D,et al.Carbohydrate-binding module-cyclodextringlycosyl transferase fusion enables efficient synthesis of 2-O-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid with soluble starch as the glycosyl donor[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(10):3 234-3 240.

[29] MALLE D,ITOH T,HASHIMOTO W,et al.Overexpression, purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase fromBacillussubtilisstrain 168[J].Acta Crystallographica Section F-Structural Biologyand Crystallization Communications,2006,62(4): 381-384.

Effect of chimeric mutation ofBacillusacidopullulyticuspullulanase domain B on its enzymatic characteristics and functions

GU Hai-tao2,LI Song1*,CHEN A-na1*

1(School of Biochemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China)2(Sinopep Jiangsu Inc., Lianyungang 222000, China)

Chimeric protein technology was used to replace domain B ofBacillusacidopullulyticuspullulanase with domain B fromGeobacillusthermoleovoranspullulanase to investigate the effects of chimeric mutation on thermostability, enzymatic characteristics, and function. The results showed that the half-life of chimeric mutant at 60 ℃ was increased from 34.9 min to 168.4min, and its melting temperature increased from 65 ℃ to 72 ℃. Furthermore, chimeric mutant had more excellent kinetic stability and thermodynamic stability compared to wild-type enzyme. The optimal pH and optimal temperature were 6.5 and 70 ℃, respectively after domain B replacement. Specific activity and substrate specificity results showed that the chimeric mutation weakened the combination of enzyme with pullulan, increased the combination of enzyme with dextrin and soluble starch. Starch saccharification results showed that the chimeric mutation did not affect the practical application. These results demonstrated thatB.acidopullulyticuspullulanase domain B had significant impact on enzyme properties. The mutants suitable for different starch saccharification processes can be constructed by homologous replacement.

chimeric protein;pullulanase; domain B; enzyme properties; starch saccharification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705008

本科生(李松副教授、陳阿娜副教授為本文通訊作者，E-mail：lisong821123@126.com；chenanan@ahpu.edu.cn)。

安徽省自然科學基金青年基金項目(No. 1708085QC63；No. 1408085QC61)國家自然科學基金項目(No. 31401630)

2016-09-21，改回日期：2016-12-28