高效液相色譜法測定山楂葉中的9種酚類成分

楊曉博,王榮芳,賈亞楠,畢振良,陸鳳琴,崔 同,*

(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000;2.興隆縣林業局,河北承德 067000)

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高效液相色譜法測定山楂葉中的9種酚類成分

楊曉博1,王榮芳1,賈亞楠1,畢振良2,陸鳳琴2,崔 同1,*

(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000;2.興隆縣林業局,河北承德 067000)

利用反相高效液相色譜法同時測定山楂葉中的9種酚類成分。結果表明,9種酚類成分在2～500 μg/mL之間呈良好的線性關系,r介于0.9995～0.9999。加標回收率為93.7%～110.2%,相對標準偏差在0.69%～4.58%之間。對29個品種的山楂葉進行測定,9種酚類成分的平均含量由低到高依次為:異槲皮苷、金絲桃苷、原花青素C1、原花青素D1、表兒茶素、原花青素B2、綠原酸、紅果酸、牡荊素鼠李糖苷。其中黃酮和酚酸含量較高,達15 mg/g D.W左右,原花青素類成分含量達6 mg/g D.W。該方法具有簡便、準確的優點。

高效液相色譜法,山楂葉,原花青素,紅果酸,黃酮

山楂(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E. Br.)為薔薇科山楂屬植物。山楂及山楂葉作為中藥材早在《本草經集注》和東晉葛洪的《肘后備急方》[1]中便有記載。山楂葉的現代藥學研究起源于上世紀80年代前后聯邦德國開展的系統研究,并開發出一種用于NYHA Ⅰ～Ⅱ級心臟病治療的標準化山楂提取物[2]。上世紀末中國學者也曾以同屬的中國山楂葉為原料,開發出山楂葉黃酮藥物,并被《中國藥典》所收錄[3]。目前,還有多名學者利用山楂提取物做NYHA I～II級心臟病的臨床研究[4]。山楂葉中不僅含有黃酮類成分,而且還含有原花青素和酚酸等酚類成分[5-7]。

近年來,部分學者曾采用HPLC法分別對山楂葉中的綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷和槲皮素等成分進行了分析[8-10],但未涉及原花青素等成分。歐洲學者曾開發出山楂葉中原花青素分析方法[11],但卻不能同時分析黃酮。許文[12]等采用UPLC-MS/MS對三葉青中黃酮、原花青素成分進行同時檢測,但該方法對儀器要求較高,不利于廣泛應用。本研究擬在前期學者研究[13-14]的基礎上開發一種用于同時測定山楂葉中的原花青素、黃酮和酚酸等9種主要酚類成分的檢測方法,并對29個不同品種的山楂葉樣品進行了測定,為山楂葉及相關產品的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂葉 共29個品種(大旺、豫北紅、集安紫肉、大貨、窄口、小糖球、伏里紅、大糖球、豐收紅、敞口、秋金星、大黃綿楂、遼紅、大綿球、甜水、安澤大果、西豐紅、淶水大金星、錦紅、自根系、磨盤、9039、綿紅、興隆二號、興隆三號、興隆紫肉、小金星、霧靈紅、燕瓤紅),均采自河北省興隆縣山楂資源圃,采樣時間為2015年5月27日,采樣后冷凍干燥,保存于真空干燥器中備用;標準對照品:表兒茶素、綠原酸 購于美國Sigma公司;金絲桃苷、異槲皮苷、牡荊素鼠李糖苷 購于上海源葉生物科技有限公司;原花青素B2、原花青素C1、原花青素D1以及紅果酸 均由本實驗室從山楂果實中分離提純[14],采用電噴霧質譜、NMR法以及硫解-HPLC法對上述化合物進行結構鑒定,與相關參考文獻對比得到證實[13],通過峰面積歸一化法測得其純度均在95%以上;純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;乙腈、甲醇 Honeywell Burdick & Jackson公司,色譜純;其余試劑 為分析純。

Agilent-1200型高效液相色譜儀 由在線脫氣機,低壓四元梯度泵,光電二極管陣列檢測器以及Agilent Chemstation色譜工作站組成,Agilent公司;CO-3010柱恒溫控制箱 天津美瑞泰克科技有限公司;KQ-5200E型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 稱取山楂葉樣品0.5 g于研缽中,滴入3滴80%磷酸并分次加入15 mL純凈水研磨均勻,用95%乙醇轉移至50 mL容量瓶中,超聲波提取11 min,用95%乙醇定容,靜置,取上清液離心(4000 r/min,5 min),經0.45 μm微孔濾膜過濾后,待HPLC分析。

1.2.2 HPLC分析條件的選擇 分別選用3種色譜柱:Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm id,5 μm)、Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm id,5 μm)和Sino Chrom ODS C18(200 mm×4.6 mm id,5 μm),3種流動相(甲醇-0.05%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、甲醇-乙腈-0.05%甲酸)及不同的梯度洗脫程序進行實驗。

1.2.3 HPLC分析條件 色譜柱Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm id,5 μm);流動相A:甲醇/乙腈=1∶2含500 μL/L甲酸;流動相B:500 μL/L甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0～26 min,8%～20% A;26～30 min,20%～50% A;30～35 min,50% A;35～37 min,50% A;37 min～47 min,8% A;流速:0.8 mL/min;柱溫45 ℃;進樣量10 μL;DAD檢測器,檢測波長:原花青素B2、原花青素C1、原花青素D1、紅果酸為280 nm,綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷為350 nm,外標峰面積法進行定量分析。

1.2.4 標準曲線的繪制 將綠原酸、紅果酸、表兒茶素、原花青素B2、原花青素C1、原花青素D1、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷及異槲皮苷標準對照品溶于甲醇中,配制成0.5 mg/mL的混合標準對照品儲備液,用甲醇稀釋成不同濃度的標準液,進樣分析后繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的比較

對于同樣規格的ODS和BDS柱,BDS柱分離的色譜峰型和分離度較ODS柱好;較長的色譜柱塔板數高,使原花青素B2、原花青素C1、原花青素D1與其他雜峰分離良好,故確定Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm id,5 μm)為本實驗的色譜柱。

2.2 流動相的選擇

用甲醇-0.05%甲酸為流動相時,采用40%的甲醇,10種多酚成分不能很好的分開,當甲醇降到25%時,原花青素B5的保留時間較長。采用乙腈-0.05%甲酸為流動相,當乙腈溶液為20%時,原花青素B5出峰時間較早,但其余的成分不能很好分開,當降低乙腈為12%時,其余成分能夠很好分開。當采用甲醇-乙腈-0.05%甲酸作為流動相時,為了節約時間,采用梯度洗脫的方式,以甲醇和乙腈1∶2(v/v)作A液,水為B液。當樣品采用1.2.3的HPLC分析條件時,目標化合物之間分離效果較好,且基線平穩。9種酚類成分對照品和山楂葉樣品的色譜圖見圖1。由圖1看出,在選定的分析條件下,樣品中的9種多酚與其他雜峰在47 min內實現了良好分離。

圖1 9種山楂酚類成分對照品(A)和山楂葉樣品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC profile of nine phenolic references(A)and Chinese hawthorn leaves sample(B)注:1-紅果酸,2-綠原酸,3-原花青素B2,4-表兒茶素,5-原花青素C1,6-原花青素D1,7-牡荊素鼠李糖苷,8-金絲桃苷,9-異槲皮苷。

表1 方法精密度的評價Table 1 Evaluation of the precision

表2 對照品的回歸方程、相關系數、線性范圍及最低檢出限Table 2 The regression equation,correlation coefficient,linear range and the minimum detection limit

2.3 HPLC方法評價

2.3.1 精密度實驗 準確吸取0.5 mg/mL混合對照品,按1.2.3中的色譜條件連續進樣5次,對各個色譜峰的峰面積進行統計,結果見表1,相對標準偏差(RSD)在0.80%～1.96%之間,表明該方法精密度良好。

2.3.2 方法的回歸方程、線性范圍和最低檢出限 按1.2.4步驟配制混合標準對照品溶液,對各個標準對照品的峰面積進行統計,經過計算得到回歸方程、相關系數和線性范圍。

表4 不同山楂葉中9種酚類成分的含量測定結果(mg/g D.W)Table 4 Determination results of 9 phenolic compounds in hawthorn leaves among different cultivars(mg/g D.W)

以3倍信噪比得到最低檢出限。結果列于表2。結果表明,響應值與進樣量之間具有良好線性相關性,相關系數介于0.9995～0.9999之間,最低檢出限范圍為1.0～1.5 μg/mL,可以滿足常規樣品的定量分析。

2.3.3 加標回收率 在山楂葉樣品中加入準確稱取的9種酚類物質的標準品,按1.2.1所述對樣品進行處理,平行5份,用1.2.3所述的色譜條件對未加標樣品和已加標樣品進行測定,通過統計峰面積,計算出各組成分的加標回收率,結果見表3。結果表明,9種酚類的加標回收率介于93.7%～110.2%,RSD為0.69%～4.58%,回收率均較高,可滿足常規定量分析需要。

表3 九種酚類的加標回收率Table 3 Recoveries of nine phenolic compounds

2.4 不同品種山楂葉中9種酚類成分的含量測定

采用1.2.3所述方法對5月采集并凍干后的29種山楂葉中9種酚類成分的含量進行分析檢測,結果見表4。

續表

注:a.含量低于檢測限。

由表4可以看出,在29個不同品種的山楂葉中均檢出了紅果酸、原花青素B2、表兒茶素、原花青素C1、原花青素D1、綠原酸、牡荊素鼠李糖苷7種酚類成分。金絲桃苷和異槲皮苷等氧苷黃酮的含量較低,平均值為0.53 mg/g D.W和0.13 mg/g D.W,其中大綿球中金絲桃苷和異槲皮苷的含量均低于檢出限。根據檢測的結果得出碳苷黃酮(牡荊素鼠李糖苷)/氧苷黃酮(C/O)比為22.6,山楂葉中紅果酸的含量高于綠原酸,與文獻報道[5]的結果相似。山楂葉中表兒茶素的含量較高,平均為1.61 mg/g D.W,這些結果與文獻報道[15]一致。山楂葉中的9種酚類成分的含量由低到高依次為:異槲皮苷、金絲桃苷、原花青素C1、原花青素D1、表兒茶素、原花青素B2、綠原酸、紅果酸、牡荊素鼠李糖苷。山楂葉中的黃酮類即金絲桃苷、異槲皮苷、牡荊素鼠李糖苷的平均總含量達15 mg/g D.W左右和酚酸類即綠原酸、紅果酸的平均總含量達15 mg/g D.W左右，原花青素類成分原花青素B2、原花青素C1、原花青素D1平均總含量達6 mg/g D.W。

3 結論

建立了一種用于檢測山楂葉中9種酚類成分的反相高效液相色譜法,在優化的色譜條件下,9種酚類成分在47 min內實現了良好分離,且該方法靈敏度高、準確性好及重復性較好,可用于山楂葉中酚類成分定量分析。采用建立的方法對29種不同品種山楂葉中9種酚類成分的含量進行了分析,結果表明,山楂葉中的多酚類成分以黃酮和酚酸類成分為主,不同品種中的9種酚類成分含量有所不同。

[1]宋立人,洪恂,丁緒亮,等. 現代中藥學大辭典[M]. 上冊. 北京:人民衛生出版社,2001:165-168.

[2]Wagner H. Phytomedicine research in Germany[J]. Environ Health Perspect,1999,107(10):779-781.

[3]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部[S]. 北京:化學工業出版社,2005:575-576.

[4]李挺,張莉,齊剛. 350山楂鮮果標準提取物治療NYHAⅡ期充血性心力衰竭的臨床研[J]. 現代藥物與臨床,2004,19(6):264-265.

[5]Gao Z,Jia YN,Cui TY,et al. Quantification of ten polyphenols in the leaves of Chinese hawthorn(CrataeguspinnatifidaBge. var. major N.E. Br.)by high performance liquid chromatography[J]. Asian Journal of Chemistry,2013,25(18):10344-10348.

[6]李保利,趙凌,申艷紅,等. 超聲波法提取山楂葉中原花青素的條件優化[J]. 廣州化工,2016,11(10):138-140.

[7]許紅蕾. 山楂葉中化學成分的HPLC-DAD-ESI-MS/MS鑒識及其3個高純度黃酮苷的制備色譜研究[D]. 上海:第二軍醫大學,2008.

[8]杜義龍,潘海峰. HPLC法同時測定承德山里紅葉中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的含量[J]. 山西職工醫學院學報,2016,26(1):4-7.

[9]潘偉東,杜義龍,趙勝男,等. HPLC法同時測定承德產山楂葉4種成分的含量[J]. 承德醫學院學報,2015,32(4):279-281.

[10]王領弟,李艷榮,張曉峰,等. 山楂葉指紋圖譜研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2011,17(19):74-78.

[11]Gabriela ER,Beat OS. Quantitative reversed-phase high-performance liquid chromatography of procyanidins in Crataegus leaves and flowers[J]. Journal of Chromatography A,1999,835(1-2):59-65.

[12]許文,傅志勤,林婧,等. UPLC-MS/MS法同時測定三葉青中10種黃酮類成分[J]. 藥學學報,2014,49(12):1711-1717.

[13]Cui T,Li JZ,Kayahara H,et al. Quantification of the polyphenols and triterpene acids in Chinese hawthorn fruit by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(13):4574-4581.

[14]康小虎. 山楂原花青素色譜行為及其硫解轉換系數研究[D]. 保定:河北農業大學,2014.

[15]Liu P,Kallio H,Yang B. Phenolic compounds in hawthorn(Crataegusgrayana)fruits and leaves and changes during fruit ripening[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2011,59(20):11141-11149.

Determination of nine phenolic components in the leaves of Chinese hawthorn by HPLC

YANG Xiao-bo1,WANG Rong-fang1,JIA Ya-nan1,BI Zhen-liang2,LU Feng-qin2,CUI Tong1,*

(1.College of Food Science and Technology,Agriculture University of Heibei,Baoding 071000,China;2.Forestry Bureau of Xinglong County,Chengde 067000,China)

Nine phenolic components in the leaves of Chinese hawthorn were determined by RP-HPLC simultaneously. The results indicated that the linearity ranges of nine compounds were between 2～500 μg/mL and the correlation coefficient(r)were between 0.9995～0.9999. The recovery was 93.7%～110.2%. The relative standard deviations were between 0.69%～4.58%. The average content of nine phenolic components from low to high were isoquercitrin,hyperoside,procyanidin C1,procyanidins D1,epicatechin,proanthocyanidin B2,chlorogenic acid,eucomic acids,vitexin-2″-O-rhamnoside. Among them,the content of flavonoids and phenolic acids was higher than 15 mg/g D.W and the content of proanthocyanidins was up to 6 mg/g D.W. The method of HPLC was simple and accurate.

high performance liquid chromatography;Chinese hawthorn leaves;procyanidins;eucomic acids;flavonoids

2016-11-28

楊曉博(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail:15031258295@163.com。

*通訊作者:崔同(1956-)，男，博士，教授，研究方向：天然產物活性成分分析，E-mail:cuitong98@aliyun.com。

河北省自然科學基金(C2015204187)。

TS255.7

A

1002-0306(2017)10-0062-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.004