穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株的構建及鑒定

許淑文，李艷，李繼強，戴雯

（1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北武漢430060；2.武漢市第一醫院神經外科，湖北武漢430022）

·論著·

穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株的構建及鑒定

許淑文1，李艷1，李繼強2，戴雯1

（1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北武漢430060；2.武漢市第一醫院神經外科，湖北武漢430022）

目的構建及鑒定穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株。方法利用RNA干擾技術提取pEGFP-TGF-β1質粒后采用ABI3130基因測序儀進行測序鑒定，將鑒定后的質粒轉染到大鼠心肌細胞H9c2細胞株，利用G418篩選轉染的H9c2細胞，通過RT-PCR和Western blot技術對轉染后的H9c2細胞進行鑒定，本實驗將轉染了pEGFP-TGF-β1質粒和pEGFP對照質粒的細胞株分為pEGFP-TGF-β1質粒組和pEGFP對照質粒組。結果pEGFP-TGF-β1質粒測序結果包含TGF-β1序列，篩選后的pEGFP-TGF-β1質粒組和pEGFP對照質粒組細胞轉染效率分別為85%和93%。RT-PCR結果顯示，pEGFP-TGF-β1質粒轉染組的TGF-β1mRNA相對表達量為(2.563±0.198)，與對照組(1.037±0.022)比較差異具有統計學意義(t=3.056，P=0.028)；Western blot結果顯示，pEGFP-TGF-β1質粒轉染組的TGF-β1蛋白相對表達量為(3.275±0.234)，顯著高于對照組的(1.011±0.015)，差異具有統計學意義(t=4.372，P=0.015)。結論本研究所構建的大鼠心肌細胞H9c2細胞株能穩定高表達TGF-β1，可用于后續TGF-β1在大鼠心肌細胞的生物學作用及相關信號通路的研究。

大鼠心肌細胞；H9c2細胞株；轉化生長因子-β1；質粒

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是在心衰過程中急劇增加的重要細胞因子，它是一種調控細胞生長的關鍵細胞因子，參與調節免疫、細胞增殖與凋亡、創傷修復、胚胎發生和造血調控[1]。研究顯示，TGF-β1可促進組織纖維化和成纖維細胞轉化，同時使巨噬細胞失活并抑制炎癥趨化因子的表達。而壓力負荷增加的心力衰竭動物學模型表明，在胸主動脈縮窄后進行TGF-β1抑制可減少纖維化，且可以在不造成心肌肥厚的情況下改善心臟收縮功能[2]。因此，TGF-β1將可能成為治療心衰的新靶點。本研究將利用pEGFP-TGF-β1質粒構建穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株，為后續研究TGF-β1在大鼠心肌細胞中的生物學作用及相關信號通路提供細胞水平實驗材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器DMEM高糖培養基、胎牛血清、鏈霉素-青霉素雙抗、G418、β-actin一抗、TGF-β1一抗、Licor熒光二抗、Lipofectamine?2000轉染試劑、逆轉錄試劑盒、GAPDH引物、TGF-β1引物、奧德賽掃膜儀(購自美國LICOR公司)、正置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、倒置熒光顯微鏡(購自日本OLYMPUS公司)。

1.2 細菌、質粒和細胞株大腸桿菌DH5α及pEGFP-TGF-β1質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，載體為GV143質粒，表達卡那霉素原核抗性、新霉素真核抗性及綠色熒光蛋白EGFP。大鼠心肌細胞H9c2細胞株購自中科院細胞庫，H9c2細胞采用含10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM高糖培養基培養。

1.3 pEGFP-TGF-β1質粒的提取及鑒定分別將含有pEGFP-TGF-β1的高表達質粒和陰性對照質粒的感受態大腸桿菌DH5α接種在具有卡那霉素抗性的LB平板上培養并挑選單菌落克隆，將挑選出來的單克隆菌落接種到含新霉素的150 mL LB培養基，置于37℃、300 r/min搖床過夜。本實驗將轉染了pEGFP-TGF-β1質粒和pEGFP對照質粒的細胞株分為pEGFP-TGF-β1質粒組和pEGFP對照質粒組。采用QIAGEN公司的中量質粒抽提試劑盒提取pEGFP-TGF-β1質粒100μL。利用ABI3130基因測序儀對提取的質粒進行測序，測序引物序列為5'-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCACTTCAGACACAGAAATCAAC-3'。

1.4 pEGFP-TGF-β1質粒的轉染及篩選將大鼠心肌細胞H9c2細胞株接種于六孔板，采用含10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM高糖培養基培養，當細胞增殖到覆蓋培養基底部90%以上面積時進行轉染。取兩支無菌EP管，加入100μL不含血清及雙抗的DMEM高糖培養基，分別向培養基中加入1.2μL高表達TGF-β1質粒和陰性對照鏈大鼠心肌細胞H9c2細胞株質粒，混勻后分別加入5μL Lipofectamine?2000轉染試劑，輕輕混勻后室溫下靜置10～15 min以便轉染復合體的形成，將轉染體系分別加入含有2 mL的培養基的H9c2細胞孔中，置于37℃含5%CO2的培養箱中培養。24 h后給細胞換液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察質粒轉染情況(見圖1)。利用G418篩選轉染細胞，當細胞增殖到95%以上時，向培養基中加入G418 1μL，每日觀察細胞生長情況及綠色熒光表達情況，當存活細胞剩余10%～20%時給細胞換液，重復篩選步驟4～5次。

1.5 穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株的鑒定采用RT-PCR和Western blot對構建的穩定高表達TGF-β1的大鼠心肌細胞H9c2細胞株進行鑒定。RT-PCR引物：GAPDH(上游引物：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'；下游引物：5'-GTCCACC ACCCTGTTGCTGTAG-3')，TGF-β1(上游引物：5'-GGA CTACTACGCCAAAGAAG-3'；下游引物5'-TCAAAA GACAGCCACTCAGG-3')。

1.6 TGF-β1mRNA和蛋白表達定量對轉染pEGFP-TGF-β1質粒后的心肌細胞H9c2進行總RNA提取，對提取RNA進行逆轉錄、基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳，利用PCR條帶分析軟件分析條帶灰度值并計算TGF-β1相對于內參GAPDH的mRNA表達量(TGF-β1/GAPDH)。并對轉染pEGFP-TGF-β1質粒后的心肌細胞H9c2進行總蛋白提取，將提取的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白印跡分析。

1.7 統計學方法利用Odyssey軟件分析蛋白印跡灰度值并分別計算相對于內參GAPDH的蛋白表達量(TGF-β1/GAPDH)。經三次以上實驗，條帶灰度值采用均數±標準差(x-±s)表示，采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，以P?0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 pEGFP-TGF-β1質粒鑒定ABI3130基因測序儀測序結果顯示質粒序列中包含以下堿基序列，與NCBI數據庫TGF-β1基因序列比對完全一致，表明質粒構建成功[3]。

2.2 pEGFP-TGF-β1質粒的轉染和篩選結果比較pEGFP-TGF-β1質粒和pEGFP陰性對照質粒轉染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。通過細胞熒光顯微鏡下細胞計數，pEGFP-TGF-β1質粒組轉染效率為22%，pEGFP對照組為29%。利用G418篩選4個周期后，pEGFP-TGF-β1質粒轉染效率為85%，pEGFP對照組為93%，見圖1。

圖1pEGFP-TGF-β1質粒轉染及篩選結果注：A，轉染前；B，轉染48 h；C，G418篩選4個周期。

2.3 穩定高表達TGF-β1的大鼠心室肌細胞H9c2細胞株的鑒定結果

2.3.1 RT-PCRpEGFP-TGF-β1質粒轉染組的TGF-β1mRNA相對表達量為(2.563±0.198)，與對照組的(1.037±0.022)比較顯著升高，差異具有統計學意義(t=3.056，P=0.028)，表明染pEGFP-TGF-β1質粒明顯增強BAG3基因的轉錄，見圖2。

圖2RT-PCR結果注：A，瓊脂糖凝膠電泳；B，TGF-β1mRNA相對表達量；與對照組比較，aP?0.05。

2.3.2 Western blotpEGFP-TGF-β1質粒轉染組的TGF-β1蛋白相對表達量為(3.275±0.234)，顯著高于對照組的(1.011±0.015)，差異具有統計學意義(t= 4.372，P=0.015)，表明pEGFP-TGF-β1質粒明顯增加TGF-β1蛋白表達量，見圖3。

圖3Western blot結果注：A，瓊脂糖凝膠電泳；B，TGF-β1蛋白相對表達量；與對照組比較，aP?0.05。

3 討論

心力衰竭是由于心臟結構和功能的改變造成心臟回流和射血功能受損的一種復雜臨床綜合征。心力衰竭已成為日益嚴重的公共衛生問題，目前全球約有3 800萬HF患者，近15年來HF發病率以每年50%的速率增加[4]。TGF-β是在HF過程中急劇增加的重要細胞因子，它是一種調控細胞生長的關鍵細胞因子，參與調節免疫、細胞增殖與凋亡、創傷修復、胚胎發生和造血調控。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三種亞型中以TGF-β1為主，廣泛存在于人體多種細胞，如上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞等，TGF-β1是心血管系統中最主要的亞型[5]。低水平TGF-β1是維持人體正常生理功能所必需，當心臟損傷、壓力超負荷、氧化應激、炎癥刺激等多種因素存在時，TGF-β1明顯上調，此時TGF-β1將主要發揮促炎、促纖維化和促凋亡的作用[1，6]。TGF-β1可刺激CFs增生、膠原合成、心肌細胞肥大，在心室重構中起著極其重要的作用[7]。TGF-β1作為最重要的促MF細胞因子，其表達的負調控可能對抑制MF發揮重要的作用，可作為心力衰竭的治療靶點[8]。對TGF-β1表達的研究將為心力衰竭的防治提供更多依據，而本研究通過質粒轉染技術構建穩定高表達TGF-β1的心肌細胞H9c2細胞株，有利于心力衰竭的基礎研究。

GV143載體是由海吉凱基因化學技術有限公司開發的高效真核表達載體，在其載體序列中，含有TGF-β1基因，被整合進真核細胞基因組后，通過轉錄、翻譯，能夠獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達，使獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長，未整合目的質粒的細胞在長期G418的壓力下會發生死亡，這樣就可以使用G418篩選出穩定表達TGF-β1的心肌細胞H9c2細胞系[9-10]，在本實驗中，我們篩選出的心肌細胞H9c2細胞系經過多次傳代，仍然能夠穩定表達TGF-β1基因，表達效率近90%，達到預期的實驗目的。

本研究采用質粒轉染技術，在基因測序證實質粒包含特定序列后將pEGFP-TGF-β1質粒及其對照質粒pEGFP轉染到心肌細胞H9c2細胞株，并用G418進行轉染細胞篩選，利用熒光顯微鏡觀察熒光表達情況從而確定pEGFP-TGF-β1質粒轉染組和pEGFP對照組轉染效率分別為86%和89%，通過采用RT-PCR、Western blot及免疫熒光分析等手段鑒定構建的心肌細胞H9c2細胞株能穩定高表達TGF-β1。實驗結果表明，通過構建穩定高表達TGF-β1質粒，心肌細胞H9c2細胞系TGF-β1mRNA和蛋白表達量均顯著升高。構建穩定高表達TGF-β1質?？梢杂糜诤罄mTGF-β1在心肌細胞中的生物學作用及相關信號通路的研究。

[1]Khan S,Joyce J,Margulies KB,et al.Enhanced bioactive myocardial transforming growth factor-β in advanced human heart failure[J]. Circulation,2014,78(11)：2711-2718.

[2]Villar AV,Garcia R,Llano M,et al.BAMBI(BMP and activin membrane-bound inhibitor)protects the murine heart from pressure-overload biomechanical stress by restraining TGF-beta signaling[J].Biochim BiophysActa,2013,1832(2)：323-335.

[3]Fan DM,Feng XS,Qi PW,et al.Forkhead factor FOXQ1 promotes TGF-β1expression and induces epithelial-mesenchymal transition[J]. Mol Cell Biochem,2014,397(1)：179-186.

[4]Braunwald E.The war against heart failure：the Lancet lecture[J]. Lancet,2015,385(9970)：812-824.

[5]Edgley AJ,Krum H,Kelly DJ.Targeting fbrosis for the treatment of heart failure：a role for transforming growth factor-β[J].Cardiovascular Therapeutics,2012,30(1)：e30-e40.

[6]Dobaczewski M,Chen W,Frangogiannis NG.Transforming growth factor(TGF)-beta signaling in cardiac remodeling[J].J Mol Cell Cardiol,2011,51(4)：600-606.

[7]Bujak M,Frangogiannis NG.The role of TGF-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling[J].Cardiovasc Res,2007, 74(2)：184-195.

[8]Kapur NK,wilson S,Yunis AA,et al.Reduced endoglin activity limits cardiac firosis and improves survival in heart failure[J].Circulation,2012,125(22)：2728-2738.

[9]李繼強,楊吉安,陳謙學,等.穩定低表達BAG3的膠質母細胞瘤U87細胞株的構建及鑒定[J].中國臨床神經外科雜志,2015,20(6)：353-356.

[10]任杰,高江平,閻瑾琦,等.人PSCA真核表達質粒的構建及穩定轉染B16細胞系的建立[J].中國免疫學雜志,2010,26(10)：867-870.

Construction and identification of rat cardiomyocyte H9c2 cell line with stable and high expression of TGF-β1.

XU Shu-wenLI Yan,LI Ji-qiang,DAI Wen.
1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Neurosurgery,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430022, Hubei,CHINA

ObjectiveTo construct and identify rat cardiomyocyte H9c2 cell line with stable and high expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1).MethodsPlasmid pEGFP-TGF-β1was extracted by RNA interference,and sequenced by ABI3130 Genetic Analyzer for identification.The identified pEGFP-TGF-β1were then transfected into rat cardiomyocyte H9c2 cell line(pEGFP-TGF-β1group).After screening culture by G418,the expression of TGF-β1was verified by RT-PCR and Western blot.The cells transfected withempty control plasmid pEGFP were used as the control group.ResultsThe sequencing results confirmed that pEGFP-TGF-β1extracted contained TGF-β1sequence.The transfection efficiency of pEGFP-TGF-β1group and control group were 85%and 93%,respectively. RT-PCR showed that TGF-β1mRNA expression level was(2.563±0.198)in pEGFP-TGF-β1group,which was significantly higher than(1.037±0.022)in control group(t=3.056,P=0.028).Western blot revealed that TGF-β1protein expression level was(3.275±0.234)in pEGFP-TGF-β1group,which was significantly higher than(1.011±0.015)in control group(t=4.372,P=0.015).ConclusionThe constructed rat cardiomyocyte H9c2 cell line could stably express TGF-β1at high level,which could be used for our further research regarding the role of TGF-β1in rat cardiomyocyte and the related signaling pathway.

Rat cardiomyocyte;H9c2 cell line;Transforming growth factor-β1(TGF-β1);Plasmid

R-332

A

1003—6350（2017）11—1721—041,121

2017-02-22)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.001

國家自然科學基金（編號：81572069、81501815）

李艷。E-mail：yanlitf1120@163.com