人類免疫缺陷病毒合并結核桿菌感染者外周血差異表達基因的生物信息學分析

張榮強，劉啟玲，孫 娜，康武林，袁普衛

陜西中醫藥大學 1公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室 2第一臨床醫學院骨科，陜西咸陽 712046

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·論 著·

人類免疫缺陷病毒合并結核桿菌感染者外周血差異表達基因的生物信息學分析

張榮強1，劉啟玲1，孫 娜1，康武林2，袁普衛2

陜西中醫藥大學1公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室2第一臨床醫學院骨科，陜西咸陽 712046

目的 分析人類免疫缺陷病毒(HIV)/結核桿菌(TB)感染者外周血基因的生物學網絡調控機制及關鍵蛋白，為HIV/TB感染者的早期診斷和臨床治療提供新依據。方法 從基因芯片公共數據庫GEO中下載了22例南非HIV感染者和22例HIV/TB感染者的外周血基因芯片數據，將數據導入分析軟件QOE、STRING、PANTHER、GenClip等，分析兩組患者的基因表達譜、蛋白相互作用網絡、分子生物學過程、基因功能等，尋找區別兩類患者的關鍵節點基因。結果 兩組患者15 529個基因的表達譜相似，44名受試者的基因表達譜具有高度關聯性；251個(1.62%)差異表達基因對診斷HIV/TB感染具有良好的診斷能力；RPLP1是蛋白-蛋白相互作用圖譜子網絡的核心節點；差異表達基因與正向調節外界刺激、細胞內信號通路的轉導、中性粒細胞的遷移、人體免疫等有關，主要參與自由基相關凋亡、炎性反應等通路的活化。結論 共發現251個差異表達的基因可將單純HIV感染和HIV/TB感染進行區別，其中差異表達的前40個基因的蛋白-蛋白相互作用網絡中所包含的RPLP1基因可能與HIV/TB感染密切關聯，主要涉及正向調節外界刺激、細胞內信號通路的轉導、中性粒細胞的遷移、人體免疫等生物學功能，為HIV/TB感染的診斷和治療提供了一定的參考依據。

人類免疫缺陷病毒；結核桿菌；差異表達基因；生物信息學

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：336-344

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的一種傳染病，可嚴重破壞人體免疫系統，病死率較高[1]。結核病是由結核桿菌(tubercle bacilli，TB)感染引起的一種慢性傳染病，主要侵犯肺臟，病死率較高。這兩種傳染病的早期診斷對積極采取合理的治療方案具有重要意義[2]。然而，在現階段醫療技術的條件下，HIV感染者感染TB的早期診斷具有極大挑戰性。近年來，基因組學技術取得了巨大進展，為TB感染尤其是HIV合并TB感染(HIV/TB)的診斷提供了重要參考依據[3- 7]。酸性核糖體磷酸蛋白P1基因(acidic ribosomal phosphoprotein P1，RPLP1)是酸性核糖體磷酸化蛋白基因家族成員之一，在生物體內如果發生了磷酸化，酸性核糖體磷酸化蛋白才能夠發揮相應的生物學活性，如：參與蛋白質合成、細胞凋亡等過程，且與腫瘤、免疫疾病(系統性紅斑狼瘡等)有一定關聯[8]。本研究對基因芯片公共數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)收錄的一組HIV和HIV/TB感染者外周血差異表達的基因芯片數據資料進行生物信息學分析，深入探討了HIV/TB感染者外周血分子網絡改變情況及其可能涉及的分子生物學功能，以期進一步了解RPLP1與HIV可能存在的生物學關聯，幫助臨床預防、早期診斷和治療HIV/TB感染。

資料和方法

資料來源 以“HIV”為檢索詞在PubMed的GEO數據庫中進行檢索，獲得Dawany N和 Showe LC等于2014年6月提交的GSE50834基因芯片數據。GSE50834數據是采用Illumina公司提供的人類HumanHT- 12 V4.0基因表達芯片平臺GPL10558檢測獲得?；蛐酒瑪祿碜杂谀戏且粋€人群隊列(HIV感染者22例，HIV/TB感染者22例)的外周血單核細胞RNA標本。GSE50834數據集共包含了15 529個基因的表達資料。

兩組患者基因表達譜系分析 Qlucore Omics Explorer 3.1(QOE)是一種新型的生物信息分析軟件系統，能夠實現全面、迅速地針對基因表達、高通量基因芯片、實時定量PCR(RT-PCR)及DNA甲基化等多種原始生物學數據庫進行分析。本研究將數據集GSE50834導入到QOE軟件，對數據集GSE50834中的基因芯片數據進行(均數=0，標準差=1)標準化處理；通過(P<0.01，q<0.01)過濾后行兩獨立樣本t檢驗，篩選出單純HIV感染者與HIV/TB感染者的差異表達基因，然后對數據集GSE50834中的基因芯片數據行主成分分析及分層聚類分析。

差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用圖譜分析 將HIV感染者和HIV/TB感染者差異表達的前40個基因相應的蛋白名稱上傳至STRING 9.05蛋白-蛋白相互作用在線分析軟件，根據具體分析結果適當調節可信度和附加節點參數，繪制兩組差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用圖譜。

差異表達基因的GO功能富集、信號通路分析和文獻挖掘 將前40個明顯差異基因列表上傳至人類基因功能和網絡分析軟件GenCliP 2.0，根據需要調節各類分析的主要參數，分析兩組患者差異表達基因的GO功能富集狀況與涉及的信號通路，并檢索“艾滋病”和“肺結核”進行文獻挖掘。

結 果

HIV/TB感染者與單純HIV感染者基因表達譜分析 兩組患者基因表達狀況如圖1所示，兩組患者的基因表達譜基本相似；將44名受試者的基因表達數據導入QOE軟件行相關性分析，結果表明HIV感染者與HIV/TB感染者的基因表達譜高度關聯，提示本研究所采用的數據集數據穩定(圖2)。

HIV：人類免疫缺陷病毒；TB：結核桿菌

HIV：human immunodeficiency virus；TB：tubercle bacilli

圖 1 HIV/TB感染者與單純HIV感染者基因表達狀況

Fig 1 Gene expression profiles in HIV/TB co-infected patients and HIV-infected patients

圖 2 受試個體基因表達圖譜相關性分析

Fig 2 Correlation analysis of gene expression profiles of subjects

兩組患者基因表達模式比較 對兩組患者基因表達主成分的分析結果顯示，根據兩組患者的基因表達模式可以將單純HIV感染和HIV/TB感染的患者很好的區別開，X軸、Y軸、Z軸的數據方差貢獻率分別為10%、7%、30%(圖3A)，在Z軸方向上單純HIV感染和HIV/TB感染的患者表達差異最明顯。兩組患者15 529個基因表達PCA圖顯示：單純HIV感染與HIV/TB感染狀況可能會影響患者外周血基因組的表達模式(圖3B)。

差異表達基因對HIV/TB感染者的診斷能力 QOE軟件對原始數據進行標準化處理后，采用兩獨立樣本的t檢驗，共發現251個(1.62%)差異表達基因(P<0.05)；差異表達基因的聚類熱圖顯示，251個差異表達基因對診斷HIV/TB感染具有良好的診斷能力(圖4)。

A.各受試對象的基因表達主成分分析圖；B.各受試基因的表達主成分分析圖

A. principal components analysis pattern of gene expression from tested subjects；B. principal components analysis pattern of gene expression from tested genes

圖 3 HIV/TB感染者與單純HIV感染者基因表達模式比較

Fig 3 Comparison of gene expression patterns between HIV/TB co-infected patients and HIV-infected patients

圖 4 251個差異表達基因的聚類熱圖

Fig 4 Clustering heat maps of 251 differentially expressed genes

差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用結果 本研究選擇差異表達的前40個基因進行蛋白-蛋白相互作用圖譜分析，其中HIV/TB感染者表達下調的基因有19個(45.00%)，表達上調的有21個(55.00%)。將前40個基因相對應的蛋白名稱導入STRING 9.05軟件分析蛋白-蛋白相互作用網絡，結果顯示拓撲網絡中包含1個最典型的子網絡，主要與蛋白質的合成等生物學功能有關。其中，RPLP1與網絡中的其他≥10個蛋白存在相互作用關系，刪除該節點后，網絡結構渙散，可以認為RPLP1是子網絡的核心節點，同時提示RPLP1可能對區別兩類患者具有一定的價值(圖5)。

差異表達基因涉及的GO功能富集分析 采用GenClip在線軟件分析兩組患者前40個差異表達基因的GO功能富集狀況，結果顯示17個基因(42.50%)(CST3、GPX1、GRN、DBNL、LCP1、LGALS1、MYL6、ATP6AP1、CPVL、PSAP、PTMA、RPLP1、S100A9、S100A10、TALDO1、WARS、GSTO1)與外細胞器、細胞囊的形成等有關；12個基因(30.00%)(CCBE1、GPR183、FCER1G、GPX1、DBNL、CXCL8、LGALS1、ATP6AP1、PPBP、PSAP、S100A9、GSTO1)與正向調節外界刺激有關；5個基因(12.50%)(GPR183、FCER1G、LCP1、LGALS1、PPBP)主要與細胞內信號通路的轉導有關；4個基因(10.00%)(FCER1G、CXCL8、PPBP、S100A9)主要與中性粒細胞的遷移有關；3個基因(7.50%)(FCER1G、CXCL8、PPBP)主要與白細胞介導的人體免疫有關?！?個基因具有相同生物學功能的聚類分析見圖6。

圖 5 差異表達基因的蛋白—蛋白相互作用網絡圖

Fig 5 Network of protein-protein interactions for differentially expressed genes

圖 6 差異表達基因涉及的生物學功能的GO功能富集分析

Fig 6 GO function enrichment analysis of the biological functions of differentially expressed genes

差異表達基因涉及的通路分析 兩組患者前40個差異表達基因主要涉及自由基相關凋亡通路、炎性反應通路、哮喘通路、胱甘肽代謝通路、幽門螺桿菌感染上皮細胞信號通路、血小板活化狀態通路、血小板栓子形成通路、血小板脫粒通路、趨化因子受體通路、肽配體結合受體通路、溶酶體通路、止血通路等12條通路，≥3個基因涉及相同信號通路的聚類分析見圖7。

圖 7 差異表達基因涉及的信號通路分析

Fig 7 Analysis of signaling pathways of differentially expressed genes

差異表達基因的文獻挖掘 利用GenClip檢索包含指定的40個基因及“艾滋病”和“結核病”的文獻，并進行聚類分析，結果顯示，指定的40個基因中，CEBPP、DBNL、CST3、CXCL8、PPBP、S100A9、WARS、GPx1、GRN、HLA-DRA等基因與“艾滋病”和“結核病”的陽性報道較多，提示這幾個基因可能與兩種疾病關聯較密切，其主要涉及DNA合成、細胞凋亡與激活、免疫功能、炎性反應等生物學過程；而RPLP1基因主要參與免疫應答與細胞死亡等通路，(圖8)。

討 論

結核病是HIV感染者(含艾滋病患者)最常見的合并感染的傳染病，也是該類患者常見的死亡原因。HIV和TB可以在患者機體內發生交互作用，對患者產生重要影響，表現為：患者可以迅速發展為活動性結核患者；由于患者的免疫系統破壞，再次感染TB的機會增多；明確診斷越來越難。流行病學研究結果表明，HIV是促進TB流行的動力因子，TB是艾滋病患者最常見的機會性感染[9- 12]。目前，艾滋病在全球流行，HIV/TB感染成為日益突出的問題，特別是在非洲地區，HIV/TB的預防、診斷和治療已引起越來越多的醫務人員關注。

臨床上，HIV/TB感染的診斷主要依靠臨床綜合診斷，但存在很大困難。細菌培養是包括HIV/TB感染在內的結核病診斷的“金標準”，但檢測時間長，陽性率偏低。近年來，分子生物學診斷技術有了很大發展，但在實際臨床工作中，該類診斷所需要的儀器設備、技術能力、試劑耗材等要求較高，無法在實際工作中廣泛推廣。因此，HIV/TB感染的明確診斷還需要進一步深入研究，尋找診斷可靠、可在各類醫院廣泛推廣的診斷技術是廣大醫務工作者的共同心愿。伴隨著基因組學研究方法的發展，在HIV/TB感染研究領域也有了許多研究結果和數據資料。采用生物信息學技術對這些數據資料進行深入挖掘，可能對HIV/TB感染的早期診斷具有重要的臨床價值[13- 15]。

本研究采用分子生物學技術對一組來自非洲隊列的HIV感染(n=22)和HIV/TB感染(n=22)的患者基因芯片檢測數據進行了細致挖掘?；蜃V結果提示：兩組患者15 529個基因表達模式具有高度的一致性，這可能是HIV/TB感染者較難確診的遺傳基礎，同時提示對兩組基因的表達資料進行更深層次的挖掘是有必要的。采用QOE在線分析軟件進行兩組患者基因表達模式的主成分分析結果顯示：兩組患者的基因表達模式實際上有明顯差別，共發現251個差異表達的基因，且可以將單純HIV感染和HIV/TB感染者很好地區別開，究其原因可能是HIV合并感染TB病菌后，患者的免疫系統呈抑制狀態，從而影響某些重要基因的合成或蛋白質降解的關鍵環節，進而影響DNA的表達水平[16- 18]。兩組差異表達的前40個基因的蛋白-蛋白相互作用網絡中包含1個最典型的子網絡，主要參與蛋白質的合成，RPLP1是子網絡的核心節點，提示RPLP1可能對區別兩類患者具有一定的臨床價值。Zampieri等[19]研究發現，RPLP1蛋白依賴Caspase完成脫磷酸化，然后暴露于自身免疫系統之下從而導致自身免疫反應，這可能是系統紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)發病的始動因子。艾滋病的發病機制目前尚不清楚，但其與SLE患者的免疫功能會發生相似改變，如T細胞異常等。目前已有證據表明HIV病毒可以誘發艾滋病和SLE等自身免疫性疾病。上述研究結果表明：RPLP1基因完成脫磷酸化后可能在HIV逆轉錄病毒誘發SLE、艾滋病等自身免疫性疾病的過程中發揮著一定的作用，但需進一步深入探討[20]；RPLP1基因與肺結核的關系目前尚未見報道，綜合本研究的分析結果提示：RPLP1基因可能與HIV合并感染TB病菌有密切關聯。

圖 8 差異表達基因與文獻報道結果相關性分析

Fig 8 Correlation analysis between differentially expressed genes and reported results

基因的生物學功能分析結果顯示：兩組差異表達的前40個基因主要參與細胞器的形成、信號通路的轉導、免疫系統的保護等生物學過程；主要涉及自由基相關凋亡通路、炎性反應通路等信號通路。提示HIV合并感染TB病菌后，機體的遺傳調控網絡中的關鍵因子激活了凋亡相關信號通路、炎癥相關信號通路等，影響了機體的信號轉導能力、免疫系統狀態等，呈現出不同的臨床癥狀同時影響預后[20- 21]。通過文獻挖掘，本研究的分析結果大部分可以在目前已發表的文獻中找到相似的證據。

綜上，本研究采用生物信息學研究方法對南非22例HIV感染者和22例HIV/TB感染者外周血單核細胞的15 529個基因表達的基因芯片數據分析結果顯示，共發現251個差異表達的基因可將單純HIV感染和HIV/TB感染者進行區別，其中差異表達的前40個基因的蛋白-蛋白相互作用網絡中所包含的RPLP1基因可能與HIV合并感染TB有密切關聯；兩組差異基因主要參與細胞凋亡和炎癥相關信號轉導通路，這為HIV合并TB感染的早期診斷提供了一定的科學依據。在進一步研究時，應加入正常人群的外周血細胞基因表達譜數據，再進行細致的生物信息學分析，可能會得到更為全面詳盡的分析結果。

[1]Apidechkul T. A 20-year retrospective cohort study of TB infection among the Hill-tribe HIV/AIDS populations，Thailand[J]. BMC Infect Dis，2016，16：72.doi:10.1186/s12879-016-1407- 4.

[2]Kassa D，de Jager W，Gebremichael G，et al. The effect of HIV coinfection，HAART and TB treatment on cytokine/chemokine responses to mycobacterium tuberculosis(Mtb)antigens in active TB patients and latently Mtb infected individuals[J]. Tuberculosis(Edinb)，2016，96：131- 140.

[3]Lawn SD，Kerkhoff AD. Rapid diagnosis of TB in HIV-positive in-patients with M. tuberculosis bacteraemia in sub-Saharan Africa[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2015，19(12)：1557- 1559.

[4]Anwar MN. Childhood TB in HIV ERA-in sub saharan africa[J]. Intensive Care Med Exp，2015，3(Suppl 1)：A346.

[5]Montales MT，Chaudhury A，Beebe A，et al. HIV-associated TB syndemic：a growing clinical challenge worldwide[J]. Front Public Health，2015，3：281.

[6]Efsen AM，Schultze A，Post F A，et al. Major challenges in clinical management of TB/HIV coinfected patients in Eastern Europe compared with Western Europe and Latin America[J]. PLoS One，2015，10(12)：e145380. doi：10.1371/journal. pone.0145380.eCollection 2015.

[7]Ndagijimana A，Rugigana E，Uwizeye CB，et al. One-stop TB-HIV services evaluation in Rwanda：comparison of the 2001- 2005 and 2006- 2010 cohorts[J]. Public Health Action，2015，5(4)：209- 213.

[8]吳海燕，唐圣松. 酸性核糖體磷酸化蛋白P(0- 2)的研究進展[J]. 南華大學學報：醫學版，2006，34(5)：634- 636.

[9]Skogmar S，Schon T，Balcha TT，et al. Plasma levels of neopterin and C-reactive protein(CRP)in tuberculosis(TB)with and without HIV coinfection in relation to CD4 cell count[J]. PLoS One，2015，10(12)：e144292. doi：10.1371/journal.pone. 0144292.eCollection 2015.

[10]D’Elia A，Evans D，McNamara L，et al. Predictive and prognostic properties of TB-LAM among HIV-positive patients initiating ART in Johannesburg，South Africa[J]. Pan Afr Med J，2015，22：4. doi：10.11604/pamj.2015.22.4.6075.

[11]Barnett B，Gokhale RH，Krysiak R，et al. Prevalence of drug resistant TB among outpatients at an HIV/TB clinic in Lilongwe，Malawi[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg，2015，109(12)：763- 768.

[12]Belay M，Bjune G，Abebe F. Prevalence of tuberculosis，HIV，and TB-HIV co-infection among pulmonary tuberculosis suspects in a predominantly pastoralist area，northeast Ethiopia[J]. Glob Health Action，2015，8(1)：27949.

[13]Ford N，Getahun H. Service integration to reduce HIV-associated TB mortality[J]. Public Health Action，2015，5(4)：204.

[14]Mekonnen D，Derbie A，Desalegn E. TB/HIV co-infections and associated factors among patients on directly observed treatment short course in Northeastern Ethiopia：a 4 years retrospective study[J]. BMC Res Notes，2015，8：666.doi:10.1186/s13104-015-1664- 0.

[15]Nglazi MD，Bekker LG，Wood R，et al. The impact of HIV status and antiretroviral treatment on TB treatment outcomes of new tuberculosis patients attending co- located TB and ART services in South Africa：a retrospective cohort study[J]. BMC Infect Dis，2015，15：536.doi:10.1186/s12879- 015-1275-3.

[16]Thi AM，Shewade HD，Kyaw NT，et al. Timing of antiretroviral therapy and TB treatment outcomes in patients with TB-HIV in Myanmar[J]. Public Health Action，2016，6(2)：111- 117.

[17]Gray JM，Cohn DL. Tuberculosis and HIV coinfection[J]. Semin Respir Crit Care Med，2013，34(1)：32- 43.

[18]Ford N，Matteelli A，Shubber Z，et al. TB as a cause of hospitalization and in-hospital mortality among people living with HIV worldwide：a systematic review and meta-analysis[J]. J Int AIDS Soc，2016，19(1)：20714.

[19]Zampieri S，Degen W，Ghirardello A，et al. Dephosphorylation of auto antigenic ribosomal P proteins during Fas-L induced apoptosis：a possible trigger for the development of the autoimmune response in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Ann Rheum Dis，2001，60：72- 76.

[20]尹婧，葉冬青. HIV誘發系統性紅斑狼瘡的作用及對療效的影響[J]. 國外醫學：流行病學傳染病學分冊，2003，30(2)：70- 72.

[21]Deshmukh R，Shah A，Sachdeva KS，et al. Scaling up of HIV-TB collaborative activities：Achievements and challenges in India[J]. Indian J Tuberc，2016，63(1)：4- 7.

[22]Glaziou P，Floyd K，Weil D，et al. TB deaths rank alongside HIV deaths as top infectious killer[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2016，20(2)：143- 144.

Bioinformatic Analysis of Differentially Expressed Genes in Peripheral Blood ofHuman Immunodeficiency Virus/Tubercle Bacilli Co-infected Patients

ZHANG Rongqiang1，LIU Qiling1，SUN Na1，KANG Wulin2，YUAN Puwei2

1Department of Epidemiology and Health Statistics，School of Public Health，2Department of Orthopedics，the First ClinicalMedical College，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712046，ChinaCorresponding author：ZHANG Rongqiang Tel：029- 38185219，E-mail：zhangrqxianyang@163.com

Objective To analyze the differentially expressed genes in peripheral blood of human immunodeficiency(HIV)/tubercle bacilli co-infected patients and explore the biological regulatory mechanism and network of key proteins，so as to provide new evidence for early diagnosis and clinical treatment of HIV/TB co-infected patients. Methods Microarray gene chip data of HIV/TB co-infected patients were downloaded from public databases GEO and imported into the analysis software GEO，STRING，PANTHER，and GenClip. The gene expression profiles，protein interaction networks，processes of molecular biology，and gene functions were analyzed. Results The expression profiles of 15 529 genes between the two groups of patients were similar，and gene expression profiles from 44 subjects were highly correlated. The 251 differentially expressed genes had good diagnostic capabilities in the differential diagnosis of HIV/TB infection. RPLP1 might be a key gene in the diagnosis of HIV/TB infection. The differentially expressed genes and positive regulators showed certain functions such as external stimuli，signal transduction pathways in cells，migration of neutrophils，and immunological and other relevant functionalities. Meanwhile，they may also be involved in free radical-related apoptosis，inflammation，and activation pathways. Conclusions A total of 251 differentially expressed genes are found to be able to distinguish simple HIV infection from HIV/TB infection. Protein-protein interaction network of top 40 differential expression genes includes RPLP1 gene，which is possibly associated with HIV/TB co-infection and may be involved in and the positive regulation of external stimuli，signal transduction pathways in cells，migration of neutrophils，and immunological functions. These findings may provide certain evidence for the diagnosis and treatment of HIV/TB infection.

human immunodeficiency virus；tubercle bacilli；differentially expressed genes；bioinformatics

咸陽市科技局重點項目(2013K12- 01)和陜西中醫藥大學青年基金項目(2015QN05)Supported by the Key Project of Science and Technology Bureau of Xianyang(2013K12- 01)and the Youth Project of Shaanxi University of Chinese Medicine(2015QN05)

張榮強 電話：029- 38185219，電子郵件：zhangrqxianyang@163.com

R183.9

A

1000- 503X(2017)03- 0336- 09

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.007

2016- 09- 06)