聲脈沖輻射成像技術在早期非酒精性脂肪性肝炎診斷中的應用價值

何蒙娜，呂 珂，朱慶莉，張 青，李文波，唐鶴文，趙 婧，張 睿，姜玉新

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院超聲醫學科，北京 100730

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·論 著·

聲脈沖輻射成像技術在早期非酒精性脂肪性肝炎診斷中的應用價值

何蒙娜，呂 珂，朱慶莉，張 青，李文波，唐鶴文，趙 婧，張 睿，姜玉新

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院超聲醫學科，北京 100730

目的 評估聲脈沖輻射成像技術(ARFI)在早期非酒精性脂肪性肝炎(NASH)診斷中的應用價值。方法 采用隨機數字表法將32只SD大鼠隨機分為普通飼料組(n=8)和高脂飼料組(n=24)，分別于4、8、12、16周末從高脂飼料組及普通飼料組隨機抽取6只及2只行體質量、血生化、常規超聲及ARFI檢測，處死后取大鼠肝臟行HE染色，觀察病理。結果 32只大鼠均未出現肝纖維化，根據病理結果分為M1組[輕中度單純性脂肪肝(SS)]、M2組(重度SS)、M3組(重度SS合并早期NASH)和C組(正常對照)4組，早期NASH僅出現在重度脂肪肝組，其分布差異有統計學意義(P=0.006)。常規超聲診斷脂肪肝程度與病理檢查結果的符合率為34.4%(11/32)。M3組的ARFI值為(1.16±0.04)m/s，明顯低于M2組的(1.22±0.05)m/s(t=2.301，P=0.04)；M3組的LDL-C為(1.53±0.07)mmol/L，明顯高于M2組的(1.21±0.22)mmol/L(t=3.075，P=0.01)；兩組大鼠在三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和體質量方面差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 早期NASH的出現與脂肪肝程度相關。ARFI值可為重度SS患者是否合并早期NASH提供重要信息。

非酒精性脂肪性肝炎；聲脈沖輻射力成像技術；單純性脂肪肝

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：401-405

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是最常見的慢性肝臟疾病之一，在人群中的患病率為20%～30%[1]，其定義的關鍵是排除其他原因的肝臟脂肪變，為排他性診斷，排除的原因有酒精性，繼發性包括病毒性肝炎、藥物性及遺傳性肝炎等。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝(simple steatosis，SS)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化、肝癌等[2]。目前認為SS為NAFLD的良性狀態，而NASH則為NAFLD的進展狀態，有較高的風險進展為肝硬化甚至肝癌[3]。NASH的病理特征有肝細胞壞死、炎癥細胞浸潤，伴或不伴有肝纖維化，在NAFLD人群中發生率約為3%～5%。NASH的發生機制目前較認可的是 “二次打擊”學說，即首先肝細胞出現三酰甘油的堆積，繼而增加肝細胞的敏感性，使其更易受到第2次打擊，包括肝細胞損傷、炎癥細胞浸潤及纖維化等[4]。

對于NAFLD患者，診斷的關鍵是鑒別尚未出現纖維化的早期NASH，此期雖然已經為NAFLD疾病譜中的進展期，但仍可通過干預后恢復，因此是治療的關鍵時間。肝穿刺活檢是目前診斷慢性肝病的金標準，然而由于其有不可避免的并發癥與死亡率，NAFLD患者難以常規接受，無創診斷的方法層出不窮[2，5]。Di Marco 等[6]將聲脈沖輻射力成像技術(acoustic radiation force impulse，ARFI)應用于肝纖維化程度的分級，取得到了一些較好的相關性結果，并由此認為ARFI在肝臟慢性疾病的診斷中具有良好的應用前景。本研究建立了尚未出現纖維化的早期NASH大鼠模型，檢測了其臨床和超聲指標，分析了其與SS的差異，評估了ARFI在NASH早期診斷中的應用價值。

材料和方法

實驗動物分組及NASH模型建立 2月齡雄性SPF級SD大鼠32只，體質量(373.6±10.1)g(358～397 g)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物合格證號：SYXK(京)2015- 0025]。采用隨機數字表法將大鼠分為普通飼料組(n=8)和高脂飼料組(n=24)，分別于4、8、12、16周末從高脂飼料組及普通飼料組隨機抽取6只及2只測量體質量及用于實驗。高脂飼料及其配方：87%普通飼料，10%豬油，1.5%食鹽，0.5%糖，1%膽固醇。

ARFI的測量 對所需探查部位備皮，將大鼠固定于合適體位，采用西門子AcusonS2000超聲診斷儀，用9L4探頭，保持相同的探頭力度及時間補償增益，避開管道結構，固定深度于距肝臟包膜1～2 cm處[7]，測量該處的ARFI值10次[8]，數值經檢驗后符合正態分布取平均值，單位為m/s。

血生化及病理檢查 將禁食后大鼠麻醉固定于合適體位，超聲定位標記心臟部位后，用25G、1 ml注射器從心臟采血1 ml，分離血清，送至北京協和醫院檢驗科檢測谷草轉氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL-C)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)。采血完成后，處死大鼠并解剖分離肝臟，各肝葉各取2 cm×1 cm大小組織保存于10%中性甲醛溶液，24 h送至病理科。病理結果判斷根據肝細胞脂肪變性程度的病理診斷標準分為：(1)輕度：1/3～1/2；(2)中度：1/2～2/3；(3)重度：>2/3。根據肝細胞是否有壞死、氣球樣變及小葉內或匯管區炎癥細胞浸潤判斷是否合并NASH，同時觀察是否合并有纖維化的出現。

統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，分類變量比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

病理結果及分組 32只大鼠肝臟均未出現肝纖維化表現。普通飼料組8只大鼠均未出現NAFLD疾病譜的表現(C組)。高脂飼料組24只大鼠中，11只為單純性輕中度脂肪肝(M1組)；8只為單純性重度脂肪肝(M2組)，5只為重度脂肪肝合并早期NASH模型(M3組)；均為高脂飼料喂養16周后解剖所得；早期NASH在不同程度脂肪肝的分布中差異有統計學意義(P=0.006)(圖1)。

常規超聲結果 以病例結果為標準，常規超聲掃描結果顯示，C組8只大鼠中，4只診斷正確，4只診斷錯誤；M1組11只大鼠中，7只診斷正確，4只診斷錯誤；M2組8只大鼠均診斷錯誤；M3組5只大鼠也均診斷錯誤；診斷脂肪肝程度與病理檢查結果的符合率為34.4%(11/32)。

ARFI值及血生化結果 C組、M1組、M2組、M3組的ARFI值分別為(0.99±0.10)、(1.13±0.04)、(1.22±0.05)、(1.16±0.04)m/s，其中，M3組的ARFI值明顯低于M2組(t=2.301，P=0.04)。M3組的LDL-C為(1.53±0.07)mmol/L，明顯高于M2組的(1.21±0.22)mmol/L(t=3.075，P=0.01)，兩組大鼠在TG、TC、HDL-C、AST、ALT和體質量方面差異均無統計學意義(P均>0.05)(表1)。

SS：單純性脂肪肝；NASH：非酒精性脂肪性肝炎

SS：simple steatosis；NASH：non-alcoholic steatohepatitis

A. 重度SS大鼠肝臟大體表現；B. 重度SS大鼠肝臟鏡下病理表現(HE，×200)；C. 重度SS大鼠肝臟常規超聲表現；D.早期NASH組大鼠肝臟大體表現；E.早期NASH組大鼠肝臟鏡下病理表現(HE，×200)；F.早期NASH組大鼠肝臟常規超聲表現

A. morphological finding of rat’s liver with severe SS；B. microscopically histological finding(HE，×200)of rat’s liver with severe SS；C. conventional ultrasound finding of rat’s liver with severe SS；D. morphological finding of rat’s liver with early NASH；E. microscopically histological finding of rat’s liver with early NASH(HE，×200)；F. conventional ultrasound finding of rat’s liver with early NASH

圖 1 單純性重度脂肪肝組與合并早期NASH重度脂肪肝組的病理及超聲圖像比較

Fig 1 Comparison of pathological and ultrasound findings between simple severe hepatic steatosis group and the group of severe hepatic steatosis with early NASH

表 1 單純性重度脂肪肝與合并早期非酒精性脂肪性肝炎的重度脂肪肝大鼠的各項指標比較(x-±s)

ARFI：聲脈沖輻射成像；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白；AST：谷草轉氨酶；ALT：谷丙轉氨酶

ARFI：acoustic radiation force impulse；TC：total cholesterol；TG：triglyceride；LDL-C：low-density lipoprotein；HDL-C：high-density lipoprotein；AST：aspertate aminotransferase；ALT：alanine transaminase

討 論

本研究采用高脂飼料喂養制造NASH大鼠模型，較四氯化碳誘導而成的模型，與臨床NASH患者的病理生理形成過程有更好的相似性，且均未出現大鼠死亡。病理結果顯示，高脂飼料誘導的NASH模型也均未出現肝纖維化或者更嚴重的肝硬化、肝癌。已知大鼠的壽命為2～3年，本研究高脂誘導16周即出現早期NASH，相當于人類壽命的1/7～1/8，一定程度說明即使對NAFLD不干預，并且持續高脂飲食，其出現早期NASH的病理表現也需較長時間。因此，對于NAFLD患者，雖然疾病不會快速向NASH進展，但正由于其較長的“潛伏期”及相對溫和的發展速度，早期NASH的出現在臨床工作中容易忽視，從而錯過早期干預的恰當時間。本研究結果顯示，早期NASH在不同程度脂肪肝NAFLD大鼠中的分布有明顯差異，僅出現在重度脂肪肝組，提示重度脂肪肝為出現早期NASH的高危信號，對脂肪肝程度已經達到重度的NAFLD患者，需要警惕合并早期NASH的可能。

早期NASH有潛在的風險進展為伴有肝纖維化的NASH，肝硬化、肝功能衰竭及肝癌，肝穿活檢作為診斷的金標準，由于其有費用高、存在取樣誤差及操作相關的并發癥及死亡率，較難被臨床及患者接受與推廣。學者們致力于探索一種無創的臨床生化或者影像學診斷指標來鑒別NASH，但均未得出有效的提示指標。早期NASH患者的肝功能、血脂都有可能在正常范圍，所以它們沒有足夠的敏感性來鑒別NASH[2]；也有學者希望通過NASH形成的分子機制及遺傳學特征來鑒別診斷及治療NASH，但均處于基礎研究階段；超聲檢查一直作為肝臟疾病的首選影像學檢查方法，但常規超聲對脂肪肝程度的診斷效力較低，對早期NASH所能提供的信息有限；隨著定量超聲檢測方法的不斷出現，使得一部分超聲檢查項目有機會從完全主觀判斷向定量化發展，為臨床提供更多有價值的信息。其中ARFI技術于2008年首次應用于無創評估肝纖維化的嚴重程度，其值與肝硬度密切相關[9]。該技術簡單易行，無創傷，為臨床工作從視覺經驗檢查到數字量化檢查提供了新的方法。但尚無研究將ARFI技術聚焦于早期NASH的鑒別診斷。本研究希望通過檢測常用臨床生化及影像指標分析尚未出現纖維化的早期NASH大鼠與單純性脂肪肝的差異，從而為鑒別早期NASH提供無創診斷信息。

本研究結果還發現，M3組的ARFI值為(1.16±0.03)m/s，明顯低于M2組的(1.22±0.05)m/s，推測其原因可能為炎癥細胞浸潤增加了肝臟脂肪變細胞之間的距離，再加上炎癥的出現使肝細胞水腫，從而降低了脂肪變細胞的分布密度。所測得臨床生化指標則顯示M3組除LDL-C值明顯高于M2組外，其余的TG、TC、HDL-C、AST、ALT及體質量等指標與M2組無統計學差異，這說明隨著早期NASH的出現，反映肝功能的指標AST、ALT改變不明顯，仍處于正常范圍，意味著肝功能處于完全代償期，臨床無法僅通過其來提示早期NASH的出現；而血脂指標除LDL-C繼續升高，其余大部分指標TG、TC、HDL-C也無明顯變化，能為鑒別早期NASH提供的信息有限；回顧所測得的臨床及超聲影像學指標，發現如果將ARFI值的變化聯合血脂、肝功等，可為鑒別早期NASH提供重要信息：即當肝功能指標AST、ALT處于正常范圍內，LDL-C繼續升高，而TC、TG、HDL-C等指標變化不明顯時，若重度脂肪肝患者的ARFI值由高到低轉變，則需要排除出現早期NASH的可能。

以大鼠為模型的最大優勢是可以取到實時病理標本，為研究提供對照的金標準，但大鼠模型卻不能完全替代人體肝臟研究，其原因有以下幾點：(1)大鼠肝臟的前后徑線遠小于人類肝臟，這將影響ARFI測量時感興趣區域(region of interest，ROI)的選擇深度，曾有學者研究發現，在測量兒童肝臟ARFI值時，隨著ROI選擇深度的增加，其值也增加[10]；(2)大鼠的心率大于300次/min，而大鼠的肝臟緊鄰心臟，不可避免會影響ARFI測值的穩定性；(3)本研究所用的為9L4線陣探頭，而人體肝臟測量常規選擇4C1凸陣探頭，Goertz等[11]報道9L4探頭所測ARFI值高于4C1探頭。本研究另一個局限性為由于相對較少的樣本量，病理結果顯示僅在重度脂肪肝組出現早期NASH，但無法排除輕中度脂肪肝是否也會合并早期NASH，同時本研究將未出現纖維化的NASH統一歸為早期NASH，由于數量有限，并未對早期NASH進行活動度評分而進一步分類，今后仍需通過擴大樣本量及增加喂養時間來進一步研究。

總之，本研究成功建造了早期NASH的大鼠模型，并通過研究早期NASH的發生發展過程得出早期NASH的出現與脂肪肝程度相關，ARFI值在早期NASH發生發展中的變化可為重度脂肪肝是否合并早期NASH提供重要信息。

[1]Yoon HJ，Cha BS. Pathogenesis and therapeutic approaches for non-alcoholic fatty liver disease[J]. World J Hepatol，2014，6(11)：800- 811.

[2]Chalasani N，Younossi Z，Lavine JE，et al. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease：practice guideline by the American Gastroenterological Association，American Association for the Study of Liver Diseases，and American College of Gastroenterology[J]. Gastroenterology，2012，142(7)：1592- 1609.

[3]Than NN，Newsome PN. A concise review of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Atherosclerosis，2015，239(1)：192- 202.

[4]Day CP，James OF. Steatohepatitis：a tale of two “hits” [J]. Gastroenterology，1998，114(4)：842- 845.

[5]Musso G，Gambino R，Cassader M，et al. Meta-analysis：natural history of non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity[J]. Ann Med，2011，43(8)：617- 649.

[6]Di Marco V，Calvaruso V，Iaco A，et al. Liver stiffness measurement by transient elastography predicts early recovery from acute hepatitis[J]. Gut，2011，60(7)：1023.

[7]金曄，陳亞青，李曉明，等. 聲脈沖輻射力成像技術評價大鼠脂肪性肝炎的研究[J].臨床超聲醫學雜志，2014，16(1)：5- 8.

[8]王亮，呂珂，陳麗萌，等. 聲觸診組織定量技術在慢性腎病應用的影響因素：腎脾對比研究[J]. 協和醫學雜志，2013，4(3)：294- 298.

[9]Palmeri ML，Wang MH，Dahl JJ，et al. Quantifying hepatic shear modulusinvivousing acoustic radiation force[J]. Ultrasound Med Biol，2008，34(4)：546- 558.

[10]Hanquinet S，Courvoisier D，Kanavaki A，et al. Acoustic radiation force impulse imaging-normal values of liver stiffness in healthy children[J]. Pediatr Radiol，2013，43(5)：539- 544.

[11]Goertz RS，Egger C，Neurath MF，et al. Impact of food intake，ultrasound transducer，breathing maneuvers and body position on acoustic radiation force impulse(ARFI)elastometry of the liver[J]. Ultraschall Med，2012，33(4)：380- 385.

Value of Acoustic Radiation Force Impulse Imaging in the Diagnosis ofEarly Non-alcoholic Steatohepatitis

HE Mengna，Lü Ke，ZHU Qingli，ZHANG Qing，LI Wenbo，TANG Hewen，ZHAO Jing，ZHANG Rui，JIANG Yuxin

Department of Ultrasound，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，ChinaCorresponding author：JIANG Yuxin Tel：010- 69155491，E-mail：yuxinjiangxh@163.com

Objective To evaluate the value of acoustic radiation force impulse(ARFI)imaging in the diagnosis of early non-alcoholic steatohepatitis(NASH).Methods Totally 32 SD rats were randomly divided into high-fat diet group(n=24)and normal-diet group(n=8)by using the random number table. At the end of the 4th，8th，12th，and 16thweek，six rats from the high-diet group and two rats from the normal-diet group were selected blindly for weighting，blood biochemical test，conventional ultrasound，and ARFI imaing. HE staining was used for pathological observation. Results None of the 32 rats developed liver fibrosis. Based on the pathological results，these rats were divided into M1 [mild-to-moderate simple fatty liver(SS)]，M2(severe SS)，M3(severe SS with early NASH)，and C groups(normal control). Early NASH was seen only in the severe hepatic steatosis groups，and its distribution had a significant difference(P=0.006). The diagnostic accuracy of conventional ultrasound based on histological results was 34.4%(11/32). The ARFI value of M3 group was significantly lower than that of M2 group [(1.16±0.04)m/svs.(1.22±0.05)m/s；t=2.301，P=0.04)，and the low-density lipoprotein of M3 group was significantly higher than M2 group [(1.53±0.07)mmol/Lvs.(1.21±0.22)mmol/L；t=3.075，P=0.01)，while other clinical indicators had no statistical difference between these two groups. Conclusions The development of early NASH is associated with the severity of hepatic steatosis. ARFI value can provide important information to identify early NASH in patients with severe hepatic steatosis.

non-alcoholic steatohepatitis；acoustic radiation force impulse；simple steatosis

中國醫學科學院北京協和醫學院研究生創新基金(2014- 10023- 1002- 3008)Supported by the Innovation Fund for Graduate Students of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College(2014- 10023- 1002- 3008)

姜玉新 電話：010- 69155491，電子郵件：yuxinjiangxh@163.com

R445.1；R657.3

A

1000- 503X(2017)03- 0401- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.017

2016- 07- 29)