真空冷凍干燥微藻DHA油納米乳工藝研究

劉維維, 吳 鵬, 王昭凱, 林祥志

(1. 福建農林大學 食品科學學院, 福建 福州 350000; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

真空冷凍干燥微藻DHA油納米乳工藝研究

劉維維1,2, 吳 鵬2, 王昭凱2, 林祥志2

(1. 福建農林大學 食品科學學院, 福建 福州 350000; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

采用超聲波法制備微藻DHA油納米乳, 研究了微藻DHA油納米乳真空冷凍干燥工藝, 并對其粉末進行了表征。研究結果表明, 當凍干曲線為: 預凍: –40℃維持2 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持12 h, 真空度為0.2 mbar, –20℃維持2.5 h, 真空度為0.15 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar,且油相與凍干保護劑的質量比為1︰4, 凍干保護劑選擇葡萄糖︰甘露醇質量比為1︰3時, 制備的納米乳粉末顆粒外觀呈乳白色、均勻細膩, 復溶速度在10s內, 凍干前粒徑為(175.6±22.1)nm, 多分散系數(PDI)為(0.15±0.62), 凍干后粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 差異不大, 依舊在納米范圍內, 不僅保證了DHA的長期穩定性, 還擴大了DHA的應用范圍, 有望成為DHA的新型納米載藥系統。

微藻DHA油; 納米乳; 真空冷凍干燥

DHA是二十二碳六烯酸ω-3系多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid, ω-3 PUFA)[1], 由于其含有6個不飽和雙鍵, 因此對人類健康具有多種特殊生理功能[2]。納米乳是一種平均粒徑在納米級, 半透明狀的乳液[3]。作為一種新型給藥傳輸系統, 由于其制備方法簡單, 穩定性高和生物利用率高而受到廣泛關注[4]。DHA是脂溶性物質, 不溶于水, 易氧化, 應用困難, 采用納米技術將微藻DHA油制備成水包油型納米乳, 可大幅度緩解氧化速度, 并提高DHA的生物利用率[5]。

納米乳是熱力學不穩定體系[6], 長期放置可能會發生破裂、分層、絮凝或合并等理化現象, 影響納米乳的穩定性。當前較為普遍的解決辦法是采用真空冷凍干燥法(簡稱凍干法)[7]將納米乳凍干成為干乳劑, 從生產實際上解決了納米乳劑保存不穩定的問題, 如前列地爾干乳劑、紫杉醇干乳劑。常見的脂肪乳配方并不適用于制成凍干產品, 普通的凍干工藝也無法有效保證乳劑在凍干過程中的穩定性和完整性, 因此, 良好的納米凍干制劑需要對乳劑的配方、干乳劑制備工藝參數和凍干工藝參數進行全面系統的研究。本文采用真空冷凍干燥法制備微藻DHA油納米乳粉末, 考察凍干過程中重要的影響因素, 優化凍干工藝, 擴大DHA的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

微藻DHA油(武漢嘉必優生物工程有限公司);聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)(德國巴斯夫公司); 甘露醇; 海藻糖; 葡萄糖, 以上試劑均為分析純, 水為蒸餾水。

KQ-300DE超聲波細胞破碎儀(成都一科儀器設備有限公司); Zetasizer Nano ZS電位粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司); TECNAI F30場發射透射電鏡(荷蘭FEI公司); Telstar ly-25真空冷凍干燥機(西班牙泰事達公司)。渦旋振蕩器(德國IKA公司)。

1.2 實驗方法1.2.1 微藻DHA油納米乳的制備

以微藻DHA油作油相, 聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)作表面活性劑, 蒸餾水作水相制備微藻DHA油納米乳。制備納米乳溶液25 mL, 其中油相含量為7.5%, 表面活性劑含量為1.5%, 其余為水相, 放入超聲波探頭儀中超聲處理。得到均一穩定、流動性良好的乳白色微藻DHA油水包油型納米乳。為了防止超聲探頭產生的熱量對混合溶液的物化性能的影響, 整個實驗操作在低溫下進行。將微藻DHA油納米乳稀釋300倍, 在常溫下, 置于電位粒度儀樣品池中, 檢測納米乳粒徑及多分散系數。所得微藻DHA油納米乳平均粒徑為(175.6±22.1)nm, 多分散系數(PDI)為(0.15±0.62)。

1.2.2 微藻DHA油納米乳凍干制品的制備

取1mL 1.2.1制備的納米乳液于10 mL西林瓶中,按照一定的油相和凍干保護劑的質量比添加凍干保護劑, 充分溶解。將此混合液置于真空冷凍干燥機中,尋找合適的凍干曲線, 進行真空冷凍干燥。

1.2.3 凍干曲線的繪制

凍干曲線是真空冷凍干燥過程中溫度、壓力與時間之間的關系曲線[8]。在真空冷凍干燥的過程中,全面掌握凍干產品和凍干機每一階段的各項參數是得到優質凍干產品的基礎。凍干曲線不僅是手工操作真空冷凍干機的依據, 同時也是自動控制凍干機操作的保障。整個凍干過程包括三個階段, 分別是預凍、升華干燥、解析干燥。在納米乳液放入凍干機時, 將電極浸入到乳劑中, 通過觀察乳劑和凍干機各項參數的實時動態來繪制微藻DHA油納米乳的凍干曲線。

凍干曲線的繪制包括很多因素, 主要有預凍溫度、最低共晶點、升華干燥和解析干燥階段的溫度及時間等。

最低共晶點溫度是指整個納米乳制品中所有水分完全凍結成冰晶時的溫度。在升華干燥階段, 凍干制品應該保證其完全處于冰晶狀態, 凍干制品的溫度應始終低于最低共晶點, 所以, 需對微藻DHA油納米乳劑與凍干保護劑的最低共晶點進行測定[9]。采用電阻法測定乳劑最低共晶點, 將電極浸入乳劑中,將乳劑凍結成固體, 液態電阻低, 固態電阻高, 樣品的電阻會由最低點急劇升至最高點。電極可以實時監測樣品的溫度和電阻, 從而找到最低共晶點。凍干制品電阻和凍干制品溫度的交點即為最低共晶點。

升華干燥的時間關乎整個凍干過程的成敗, 影響因素較多, 但主要影響因素為制品的分裝厚度。當冰晶體簡單且厚度小于10 mm時, 標準干燥時間一般在10～30 h之間, 可按照下面公式(1)計算:

式中, T為時間, 單位為h; K為凍干制品厚度, 單位為mm。

精密量取1 mL微藻DHA油納米乳裝入10 mL西林瓶中, 添加適量凍干保護劑, 渦旋振蕩至凍干保護劑完全溶解, 放入真空冷凍干燥機進行凍干。先根據微藻DHA油納米乳凍干樣品的具體情況預設一條凍干曲線, 其程序為: 預凍: –50℃維持3 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持11 h, 真空度為0.2 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar,即為真空冷凍干燥過程的理論曲線。凍干結束后觀察樣品的凍干曲線, 分析找到最適合的凍干曲線,最終優化凍干工藝。

1.2.4 凍干保護劑配方的篩選

納米乳液在冷凍干燥過程中需要加入一定量的凍干保護劑(支撐劑), 當連續相的水分子被升華除去后, 凍干保護劑起著骨架作用, 使得納米顆粒不會塌陷, 皺縮。當加入水相時, 支撐劑迅速溶解于連續相,使乳劑恢復原有的狀態。冷凍干燥的凍干保護劑可分為結晶型和非結晶型[10]。本文對甘露醇、葡萄糖和海藻糖等常用的凍干保護劑進行比較研究, 以納米顆粒的外觀、重分散性和復溶后乳劑的平均粒徑為指標, 考察不同凍干保護劑對納米乳物理性能的影響。

將凍干保護劑分成三組配方: (1)葡萄糖; (2)葡萄糖和甘露醇; (3)海藻糖和甘露醇, 按照油相: 凍干保護劑=1︰4、1︰10、1︰15、1︰20的質量比分別添加凍干保護劑, 并以不添加任何凍干保護劑的納米乳液作為空白對照組。將添加了凍干保護劑的納米乳液渦旋振蕩至凍干保護劑完全溶解, 待其凍干后進行效果評價, 主要是形貌和復溶后平均粒徑的變化。在此基礎上明確凍干保護劑的最佳組合, 優化凍干保護劑配方。

2 結果與分析

2.1 凍干曲線的優化

如圖1所示, 在預凍階段, 凍干制品的溫度處于直線下降狀態, 直至降到–40℃時, 制品溫度基本保持不變。由此說明微藻DHA油納米乳在–40℃時已經完全從液態變成固態, 即預凍溫度設為–40℃。一般來說, 預凍溫度如果過高, 不能將制品完全凍住,在真空冷凍干燥時會有部分液體沸騰, 造成制品表面參差不齊, 粗糙雜亂, 這主要是由于機械效應和溶質效應[11]。代表凍干制品電阻的線條和代表凍干制品溫度的線條有一交點, 即為最低共晶點, 此時的溫度在–18℃左右, 即最低共晶點為–18℃。

升華干燥為了將樣品中游離水直接由固態變為氣態, 冷凝器收集這些氣態, 將它們變為液態除去。這個過程需要吸收熱量, 故要升高溫度, 但不能高于最低共熔點, 此過程可除去90%水分, 溫度大概低于最低共晶點10℃, 而從圖1可以得出最低共晶點在–18℃左右, 故升華階段溫度選擇–30℃是合理的。由公式(1)和樣品分裝厚度估算得知, 升華干燥階段的時間在10～20 h內比較合理。

解析干燥為了除去樣品中結合水及吸附于干燥層中的水[12], 需要足夠的熱量, 溫度可大幅升高至允許的最高溫度以下, 其值一般為室溫至40℃之間, 解析干燥階段溫度設為25℃比較合理, 時間不宜過長。

圖1 微藻DHA油納米乳凍干曲線初篩圖Fig.1 The freeze-drying curve of the first selectionof microalgae DHA oil nanoemulsion

此外, 從圖1可以看出, 樣品在進入解析干燥時發生了熔融現象, 造成樣品電阻大幅下降。微藻DHA油納米乳液是混合物, 沒有固定熔點, 在凍干的過程中隨著凍干制品內部結構狀態的改變, 熔點也在不斷發生變化。故升華干燥階段需要有一個升溫的過程, 這使升華干燥和解析干燥之間有一個過渡的過程, 不會使樣品中某些未凍住的部分在進入解析干燥時由于溫度升高幅度很大而造成樣品沸騰。故改變凍干曲線為: 預凍: –40℃維持2 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持12 h, 真空度為0.2 mbar, –20℃維持2.5 h, 真空度為0.15 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar, 即為真空冷凍干燥過程的理論曲線, 待凍干結束后, 觀察凍干曲線。如圖2所示, 擱板溫度、制品溫度和理論曲線基本重合在一起, 符合凍干規律。

圖2 微藻DHA油納米乳凍干曲線Fig.2 The freeze-drying curve of microalgae DHA oilnanoemulsion

2.2 凍干保護劑配方篩選結果

如表1所示, 從外觀效果來看, 凍干保護劑對凍干產品有明顯的保護作用。在試驗條件下, 當油相與凍干保護劑質量比為1︰4時, 凍干微藻DHA油納米乳外觀特征最好; 當油相與凍干保護劑質量比為1︰15和1︰20時, 凍干微藻DHA油納米乳的外觀特征較差, 造成這種現象的原因可能是凍干保護劑含量過多, 乳劑會過飽和, 從而影響凍干后的外觀特征。結合表1和圖3可知, 當油相與凍干保護劑的比例為1︰4時, 可得到外觀及平均粒徑都較為理想的微藻DHA油納米乳干顆粒, 且選用甘露醇和海藻糖、甘露醇和葡萄糖的混合物作為凍干保護劑比單獨使用葡萄糖作為凍干保護劑更能保障微藻DHA油納米乳的凍干效果。因此, 選擇油相與凍干保護劑的比例為1︰4, 以甘露醇和海藻糖的混合物或甘露醇和葡萄糖的混合物作為凍干保護劑。

表1 油相和凍干保護劑的比例對凍干微藻DHA油納米乳外觀的影響Tab.1 The impact of the oil and freeze-drying protectant ratio on the appearance of DHA oil nanoemulsion after lyophilization

圖3 不同含量凍干保護劑對凍干后微藻DHA油納米乳平均粒徑的影響Fig.3 The impact of different contents of freeze-drying protective additives on the average particle size of microalgae DHA oil nanoemulsion after lyophilization1︰15和1︰20兩組只加葡萄糖組凍干后無法復溶, 無檢測結果。The 1︰15 and 1︰20 groups with glucose cannot be dissolved after freeze-drying, no results

圖4 凍干保護劑之間不同比例對微藻DHA油納米乳粒徑的影響Fig.4 The impact of different ratios of freeze-drying protective additives on the average particle size of microalgae DHA oil nanoemulsion

由于葡萄糖不易凍干, 故不單獨使用葡萄糖作為凍干保護劑或者添加較多葡萄糖。不同凍干保護劑比例對凍干微藻DHA油納米乳粒徑的影響如圖4所示, 從圖中可知, 當葡萄糖︰甘露醇質量比為1︰3時, 凍干微藻DHA油納米乳的粒徑與凍干前的粒徑基本沒有變化; 而在其他凍干保護劑比例時, 凍干微藻DHA油納米乳的粒徑較凍干前則有明顯的增大。因此, 在試驗條件下, 最佳的凍干保護劑及比例為: ︰

葡萄糖甘露醇為1︰3。

綜上所述, 凍干微藻DHA油納米乳的最佳條件為: 油相與凍干保護劑的比例為1︰4, 凍干保護劑選擇葡萄糖甘露醇為1︰3。

︰

2.3 微藻DHA油納米乳凍干粉表征

凍干后的微藻DHA油納米乳呈乳白色干顆粒,無微藻DHA油的腥味, 復溶速度快。將其加水復溶后用透射電鏡(TEM)觀察其內部形態, 發現納米顆粒凍干后平均粒徑及形態均沒有明顯變化, 用電位粒度儀檢測其平均粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 均勻的分散在水相中, 見圖5。

3 討論

本實驗通過高能乳化法中的超聲波法制得微藻DHA油納米乳。為了提高其穩定性, 根據微藻DHA油納米乳的配方及其性質, 添加凍干保護劑, 設計凍干曲線, 最終可以得到不坍塌, 不結塊, 不皺縮,表面平滑, 均勻乳白色的納米粉體。凍干后粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 仍維持在納米范圍內, 不僅提高了DHA的消化吸收率, 還保障了其長期穩定性。

納米乳在冷凍干燥階段其濃度逐漸增大, 會引起納米粒子的聚合, 甚至是不可逆的合并。此外, 逐漸增大的冰晶對納米乳產生機械壓力, 破壞其穩定性。所以, 在冷凍干燥之前添加凍干保護劑可以提高納米乳的穩定性[13-14]。海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇等由于其在玻璃化轉變溫度時具有玻璃化狀態, 因而常用作凍干保護劑[15]。

圖5 微藻DHA油納米乳凍干粉外觀圖(a)及TEM圖(b)Fig.5 The appearance (a) and TEM image (b) of microalgae DHA oil nanoemulsion lyophilized powder

升華干燥是真空冷凍干燥的關鍵, 本實驗將升華干燥階段分為兩部分, 可以有效的避免由于制品不均一或者濃度過大而引起的制品上下有溫差, 制品下部的結晶不是從固體升華成為氣體, 而是從固體轉變為液體再到氣體蒸發, 形成表面凹凸不平的現象[16]。在升華干燥的結束階段, 會形成均勻致密的小孔, 這些小孔就是在預凍階段形成的冰晶體升華所留下的[17]。

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Study on the vacuum freeze-drying process on microalgae oil nanoemulsion powder

LIU Wei-wei1,2, WU Peng2, WANG Zhao-kai2, LIN Xiang-zhi2

(1. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350000, China; 2. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China)

Mar. 11, 2016

microalgae DHA oil; nanoemulsion; vacuum freeze-drying

This study explores the vacuum freeze-drying process and characterizes microalgae DHA oil nanoemulsion nanopowder, which is synthesized via ultrasonic. Result shows that the nanopowder is milky white and delicate with a constant dissolution rate of 10 s under the following conditions of the freeze-drying curve with oil phase to freeze-drying protective additive ratio of 1︰4 and glucose to mannitol ratio of 1︰3: (1) Pre-freezing at ?40°C for 2 h under 0.2 mbar pressure; (2) Sublimation drying at –30℃ for 12 h under 0.2 mbar pressure followed by drying at–20℃ under 0.15 mbar pressure for 2.5 h; (3) Analytical drying at 25℃ for 3 h under 0.15 mbar pressure. Before freeze-drying, the particle size and polydispersity coefficient were (175.6±22.1) and (0.15±0.62) nm, respectively, and these values changed to (211.1±23.5) and (0.152±0.116), respectively, after freeze-drying, indicating that the difference between these values is small and in the range of nanometers. The vacuum freeze-drying technology not only ensures the long-term stability of DHA but also expands the scope of its application. DHA is therefore expected to become a new nano-loaded drug system.

TS22

A

1000-3096(2017)04-0051-06

10.11759/hykx20160311001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-03-11;

2016-09-10

廈門南方海洋研究中心項目 (No. 14CZP028HJ02); 國家自然科學基金項目(No. 41476148); 海洋經濟創新發展區域示范項目(12PYY001SF08)

[Foundation: Xiamen Southern Oceaographic Center, No.14CZP028HJ02; National Natural Science Foundation of China, No.41476148; Marine economy innovation development area demonstration project, No.12PYY001SF08]作者簡介: 劉維維(1989-), 女, 新疆庫爾勒人, 碩士研究生, 研究方向: 農產品加工及貯藏工程, 電話: 15606928959, E-mail: 1394022216@qq.com; 林祥志, 通信作者, 研究員, 博士生導師E-mial: xzlin@tio.org.cn