基于SSR和ISSR標記對江蘇大竹蟶野生群體和人工增殖群體的聯合分析

曹 奕，陳愛華，吳楊平，張 雨，姚國興

（江蘇省海洋水產研究所，江蘇省海洋經濟貝類研究開發中心，南通 226007）

基于SSR和ISSR標記對江蘇大竹蟶野生群體和人工增殖群體的聯合分析

曹 奕，陳愛華，吳楊平，張 雨，姚國興

（江蘇省海洋水產研究所，江蘇省海洋經濟貝類研究開發中心，南通 226007）

為探索人工增殖活動對本地大竹蟶（Solen grandis）種質資源帶來的影響，采用SSR及ISSR分子標記手段對江蘇大竹蟶野生群體與人工增殖群體的遺傳多樣性及遺傳結構進行了聯合分析。篩選的14對SSR引物擴增獲得多態性位點150個（PPB＝93.16%），Nei′s基因多樣性指數和平均Shannon信息指數分別為0.134 2和0.253 5；篩選的10條ISSR引物獲得多態性位點85個（PPB＝91.93%），Nei′s基因多樣性指數和平均Shannon信息指數分別為0.131 0和0.230 2。兩種方法分析得到野生群體的遺傳多樣性參數均顯著高于人工增殖群體，但兩群體間并未產生明顯的遺傳分化。實驗結果表明，江蘇沿海大竹蟶群體的遺傳多樣性水平較高，人工增殖群體的遺傳多樣性雖有所下降，但并未導致該地區大竹蟶種質資源遺傳結構的顯著改變。因此人工增養殖活動仍然能夠作為補充大竹蟶資源的主要手段，但應探索采用高效生態的增養殖模式，對大竹蟶的種質資源進行合理的開發與利用。

大竹蟶；SSR；ISSR；增殖群體；遺傳多樣性

大竹蟶（Solen grandis）隸屬瓣鰓綱，簾蛤目，竹蟶科，竹蟶屬，在我國各海域均有分布。其個大殼薄，肉味鮮美，是我國重要的經濟貝類［1］。但由于自然資源量較少，而且主要通過采捕方式獲得，所以產量較低。開展大竹蟶人工增殖，既可以對野生資源進行保護，也可以提高產量，帶動貝類產業發展［2］。江蘇省文蛤良種場自2007年來持續進行人工增殖活動，主要地點為江蘇如東蔣家沙海域，使得大竹蟶資源量得到了部分恢復［3］。但增殖活動是否會改變江蘇海域大竹蟶的遺傳多樣性和遺傳結構，從而對生長、抗病、抗逆等生長性狀造成影響，是一個需要關注的問題。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）和簡單重復序列區間（inter-simple sequence reapeats，ISSR）標記技術都是目前廣泛應用于輔助遺傳育種的分子標記技術［4-6］，均具有多態性豐富、重復性好、穩定性高、操作簡單等優點［7-8］。本研究采用這兩種分子標記技術，對江蘇大竹蟶野生群體與增殖群體的遺傳多樣性進行分析，揭示增殖群體的遺傳分化狀況，以期評估出大竹蟶進行良種選育工作的可行性，也為保護原有種質資源提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年8月，野外采樣獲得江蘇如東蔣家沙增殖群體（JJ）、呂四野生群體（LS）大竹蟶（表1）。從兩個群體中各選取25 ind平均長度約10 cm、質量約35 g的三齡健康個體，取其斧足用于實驗。

表1 大竹蟶樣品采集地點、時間、數量Tab.1 Sampling coordinate，time，and number for different S.grandis populations

1.2 DNA提取

采用酚-氯仿法進行提取。紫外分光光度計測定樣品DNA質量，并進行瓊脂糖電泳驗證，提取所得的DNA-20℃保存。

1.3 引物序列

篩選得到大竹蟶SSR引物14對、ISSR引物10條［9-10］，由上海生工生物工程公司合成，引物序列及PCR反應條件見表2。

1.4 SSR-PCR及ISSR-PCR反應體系及程序

SSR-PCR反應體系為25μL，包括1x PCR Buffer，Mg2+濃度1.5 mM，0.2 mmol·L-1dNTPs，1.0μmol·L-1引物，Taq酶1.0 U，模板約100 ng。程序為：首先進行94℃變性5 min；然后94℃變性40 s，Tm復性30 s，72℃延伸1 min，反應進行35個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物用ABI3730進行毛細管電泳，確定個體的等位基因大小。

ISSR-PCR反應體系含50 ng·μL-1模板DNA 1.0μL，10×PCR buffer（含Mg2+）2.5μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0μL，10μmol·L-1引物1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2μL，加ddH2O至25 μL；反應條件如下：反應前94℃預變性4 min，94℃變性45 s，38～55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35個循環，反應后72℃延伸7min。產物進行2%瓊脂糖電泳電泳，染色后用Bio-Rad凝膠成像系統拍照。對所得電泳圖進行分析。

1.5 數據分析

獲得各微衛星位點上等位基因的條帶大小后，將所得結果進行歸類；ISSR電泳圖譜通過Quantity One軟件進行分析。采用Popgene 32軟件進行SSR和ISSR檢測所得結果遺傳參數分析［11-12］，并根據各群體遺傳多樣性參數計算各群體間的遺傳分化系數、遺傳距離?；谶z傳距離，用Mega 5.0軟件構建所有50個樣品的UPGMA聚類樹。

表2 篩選獲得引物序列Tab.2 Nucleotide sequences of selected primer

2 結果與分析

2.1 野生群體與增殖群體的遺傳多樣性

14對SSR引物在野生群體和增殖群體中分別檢測到多態性位點143、138個，總群體等位基因數為6～18個，共檢測到161個等位基因。各位點的多態信息含量PIC介于0.611～0.712之間，均表現出高度的多態性（表3）。表明野生群體和增殖群體均具有相對豐富的遺傳多樣性。

10條ISSR引物從野生群體及增殖群體中分別擴增得到多態性位點83、76個，共檢測得到93個等位基因。H值和I值分別為0.1311和0.2410（表4），兩種分子方法分析得到蔣家沙增殖群體的遺傳多樣性參數均低于呂四野生群體，但差異不顯著。

2.2 野生群體與增殖群體的遺傳變異

LS群體的大竹蟶樣品平均等位基因數、等位基因豐富度、觀察雜合度、期望雜合度均略高于JJ群體，分別為10.2、10.13、0.809、0.815。LS群體近交系數0.007＞0，而JJ增殖群體的近交系數則為0.008，兩者間無顯著差異（表5）。

2.3 遺傳分化狀況

分化系數可表示遺傳分化狀況。分化系數在0～0.05之間，群體間分化很弱；0.05～0.15之間表示中等分化；0.15～0.25之間表示分化大；大于0.25表示分化極大［13］。

14個位點在大竹蟶群體內的遺傳分化系數Fst為0.029～0.046，表明大竹蟶增殖群體與野生群體在這些位點上并無明顯的遺傳分化。各群體位點組合均符合Hardy-Weinberg平衡。

而通過10條ISSR引物分析得到JJ群體與LS群體的遺傳分化系數Gst＜0.05（表6），驗證了SSR分析得到的結果。

表3 14個微衛星位點在大竹蟶野生群體及增殖群體中擴增得到等位基因數、遺傳分化指數、多態信息含量Tab.3 Allelenumber，GlobalFst，PICfrom14microsatelliteloci withinwildandstockpopulationofSolengrandis

表4 ISSR分析得到的大竹蟶野生群體與增殖群體遺傳多樣性參數Tab.4 GeneticdiversityparametersofthewildandstockS.grandispopulationsbyISSR

表5 野生與增殖大竹蟶群體在14個微衛星位點的遺傳變異情況Tab.5 Geneticvariationat14microsatellitelociforthewildandstockSolengrandispopulations

表6 大竹蟶野生群體與增殖群體間遺傳距離和遺傳分化系數Tab.6 Genetic distance and genetic diversity coefficient of the 6 S.grandis populations

2.4 聚類分析

基于SSR得到的UPGMA聚類分析結果顯示（圖1），JJ4、JJ5、JJ9、JJ20號個體與大部分LS群體個體聚為一支，LS13、LS14、LS19、LS21號個體與大部分JJ個體聚為一支。而ISSR的結果則顯示（圖2），JJ3、JJ14、JJ17號個體與大部分LS群體個體聚為一支，LS4、LS9、LS20號個體聚在一起后，與大部分JJ個體聚為一支。

本研究的聚類結果顯示，SSR與ISSR分析所得結果基本一致，而野生群體與增殖群體中存在個體與對方群體中的個體聚為一支，證明了相互之間存在著一定的親緣關系。

3 討論

3.1 大竹蟶群體的遺傳多樣性

多態信息含量PIC＞0.5屬于高度多態性位點，0.25＜PIC＜0.5為中度多態位點，PIC＜0.25為低度多態位點［14］。而本研究所得的微衛星位點的PIC值均在0.5以上，說明野生群體和增殖群體均具有較高的遺傳多樣性水平。而兩種方法分析得到JJ群體Nei′s基因多樣性、Shannon′s信息指數和多態位點百分率均低于LS群體，但差異并不顯著。該結果說明：增殖群體仍然保持著較高的遺傳多樣性水平，多樣性較野生群體下降程度較緩，其下降原因主要可能是人工育苗進行增殖時，親本數量和品質帶來的影響。該情況可以通過育苗過程中增加親本數量等措施加以改善。

3.2 大竹蟶群體的遺傳分化狀況

Hardy-Weinberg平衡檢測結果表明，供試大竹蟶各群體位點組合均處于Hardy-Weinberg平衡狀態，等位基因分布頻率相對穩定，觀測雜合度和期望雜合度之間沒有顯著差異，說明大竹蟶野生群體及增殖群體尚未受到選擇、突變等外界自然環境因素影響。

圖1 基于微衛星標記的大竹蟶野生群體及增殖群體個體的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of individuals from the w ild and stock populations of S.grandis by SSR

圖2 基于ISSR分子標記的大竹蟶野生群體及增殖群體個體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGM A dendrogram of individuals from the w ild and stock population of S.grandis by ISSR

JJ群體與LS群體的Fst及Gst均小于0.05，表明增殖群體與野生群體并沒有產生明顯的遺傳分化。而二者的近交系數分別為0.007、0.008，并未出現顯著差異。說明數年來的增殖活動沒有使增殖群體相對野生群體產生明顯的遺傳變異，大竹蟶進行良種選育工作是可行的。

3.3 遺傳多樣性分析對大竹蟶增殖活動帶來的啟示

江蘇南通地區野生群體與增殖群體大竹蟶的遺傳多樣性和遺傳分化狀況分析結果表明，該地大竹蟶增殖群體在保持著高遺傳多樣性水平的同時，遺傳多樣性略有下降，但未產生明顯的遺傳變異。因此繼續開展大竹蟶人工育苗，進行增殖活動是十分必要且可行的，同時也可以探索大竹蟶的養殖技術與模式，為大竹蟶資源的恢復利用擴展渠道。但必須持續對增殖群體進行相關的監測工作，同時嚴格把關人工育苗的各個環節，防止出現種質退化情況。

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Joint analysis of w ild and proliferative Solen grandis populations from Jiangsu based on SSR and ISSR analysis

CAO Yi，CHEN Ai-hua，WU Yang-ping，ZHANG Yu，YAO Guo-xing
（Jiangsu Marine Economic Shellfish Research and Development Center，Jiangsu Marine Fisheries Research Institute，Nantong 226007，China）

To explore the impact of artificial proliferative activities to the local Solen grandis germplasm resources，a joint analysis including genetic diversity and genetic structure of wild and artificial proliferative Solen grandis populations from Jiangsu based on SSR and ISSR markers were carried out.150 polymorphic lociwere amplified from 14 pairs of SSR primers（PPB＝93.16%）.Nei′s genetic diversity index（He）and average Shannon information index（I）were 0.134 2 and 0.253 5，respectively.85 polymorphic loci were amplified from 10 ISSR primers（PPB＝91.93%），and Nei′s genetic diversity index and average Shannon information index were 0.131 0 and 0.230 2，respectively.Genetic diversity parameters of the wild populations obtained by the two methods were significantly higher than those of the artificial proliferative population（P＜0.05），but genetic differentiation was not significant between two populations（P＞0.05）.The results showed that a high genetic diversity of Solen grandis populations from the coastal area of Jiangsu，though the genetic diversity of the artificial proliferative population decreasing，were not leading to a significant change of the genetic structure of Solen grandis germplasm resources in this region.Therefore，vigorous artificial breeding activities could still serve as the primary measure for supplementing Solen grandis resources.But ecological aquaculture modes should be developed for conducting rational development and utilization for Solen grandis germplasm resources.

Solen grandis；SSR；ISSR；proliferative population；genetic diversity

S 917

A

1004-2490（2017）03-0249-07

2016-02-16

江蘇省農業科技自主創新資金項目〔CX（14）2083號〕；南通市農村科技創新及產業化項目（HL2014018號）；江蘇省屬公益類科研院所能力提升項目（BM2015017-2號）

曹 奕，研究實習員，主要從事分子生物學研究。E-mail：caoyi19881123＠126.com

陳愛華，研究員。E-mail：chenah540540＠aliyun.com