黃芪甲苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的研究

趙靜苗，胡繼宏，王秋萍

·論著·

·中醫·中西醫結合研究·

黃芪甲苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的研究

趙靜苗，胡繼宏*，王秋萍

目的 探討黃芪甲苷(AST)誘導SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向心肌樣細胞分化的作用。方法 對第2代BMSCs進行傳代培養，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測不同濃度AST在24、48、72 h時對BMSCs的增殖作用。取第4代BMSCs分為BMSCs組、5-氮雜胞苷組(5-AZA組)和AST組，5-AZA組和AST組分別加入濃度為10 μmol/L的5-AZA和濃度為100 μmol/L的AST誘導液進行誘導，采用熒光倒置相差顯微鏡觀察誘導后各組細胞的形態變化。通過Real-time qPCR法檢測誘導后各組結蛋白(Desmin)、α橫紋肌肌動蛋白(α-SCA)、肌鈣蛋白I(cTnI)mRNA表達水平；采用Western blotting法檢測各組肌鈣蛋白T(cTnT)表達水平。結果 100 μmol/L AST亞組孔72 h時BMSCs增殖情況好于24、48 h時及其他濃度AST亞組孔各時間點(P<0.05)。熒光倒置相差顯微鏡觀察顯示AST體外誘導SD大鼠BMSCs形態分化類似心肌樣細胞。5-AZA組、AST組Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達水平表達高于BMSCs組(P<0.05)，且AST組以上蛋白mRNA表達水平高于5-AZA組(P<0.05)。與BMSCs組組比較，5-AZA組和AST組cTnT表達水平升高(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組cTnT表達水平下降(P<0.05)。結論 濃度為100 μmol/L的AST作用72 h時能夠在體外誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，但分化效果弱于5-AZA。

肌細胞,心臟；細胞分化；骨髓間充質干細胞；黃芪甲苷

趙靜苗，胡繼宏，王秋萍.黃芪甲苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的研究[J].中國全科醫學，2017，20(21)：2635-2639.[www.chinagp.net]

ZHAO J M,HU J H,WANG Q P.Astragaloside effect on the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyogenic cells in vitro[J].Chinese General Practice，2017，20(21)：2635-2639.

急性心肌梗死(AMI)是目前全球范圍內嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病之一，我國AMI發病率呈明顯上升趨勢[1]。心肌梗死后心肌細胞缺血壞死導致細胞數量減少、心肌纖維化，進而導致心室重構，使得心力衰竭的發生率和病死率增高[2]。近年來許多研究者將骨髓間充質干細胞(BMSCs)誘導分化為心肌樣細胞以修復梗死區的心肌細胞從而改善心臟功能，重建心肌結構[3-6]。5-氮雜胞苷(5-AZA)為誘導BMSCs分化為心肌樣細胞的有效化學制劑,但其具有細胞毒性,所以尋找更加有效、安全的誘導劑成為重要問題[7]。黃芪是傳統的益氣類中藥，具有補氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌、補中益氣等功效；現代藥理學研究證實,黃芪甲苷(AST)具有強心、調節機體免疫力、保護組織器官、抗細胞凋亡和抗感染等藥理作用[8-9]。本研究探討了AST誘導BMSCs向心肌細胞分化的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 第2代SD大鼠BMSCs(購自北京醫科利昊生物科技有限公司)，DMEM培養基(500 ml，購自HyClone公司)，胎牛血清(500 ml，購自HyClone公司)，AST(購自南京森貝伽生物科技有限公司，中國食品藥品檢定研究院批號：110781-200613)，5-AZA、M-MLV(購自Promega公司)，Oligo(dT)纖維素〔購自生工生物工程(上海)股份有限公司〕，Bulge-LoopTMmiRNA qPCR Primer set(購自廣州銳博生物科技有限公司)，Rnase Inhibitor(購自Promega公司)，SYBR Master Mixture(購自TAKARA公司)、Primer(購自上海吉凱基因化學技術有限公司)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司)，RIPA強裂解液(購自上海碧云天生物技術有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，購自北京索萊寶科技有限公司)Prestained Protein Marker(購自美國Thermo公司)，4×蛋白上樣緩沖液(購自Solarbio公司)，ECL-PLUS/kit(購自美國Thermo公司)，兔單克隆抗體Nesprin1、小鼠單克隆抗體肌鈣蛋白T(cTnT)及肌鈣蛋白I(cTnI)(購自英國Abcam公司)。

1.2 實驗儀器 CO2恒溫培養箱(SANYO)、熒光倒置相差顯微鏡(Olympus)、Nanodrop 分光光度計(Thermo 2000/2000c)、穩壓電泳儀(上海天能EPS-600)、超細勻漿機(FLUKO公司F6/10)、Real-time PCR儀器(Agilent公司 MX3000p)、酶標分析儀(北京普朗公司DNM-9602A型)、低溫高速離心機(德國Kontront-42K)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs的培養與傳代 第2代BMSCs培養：常規滅菌，打開培養瓶，放入原代細胞，在培養瓶中加入完全培養基(含20%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，次日觀察細胞生長狀態，48 h后首次換液，以后每隔3 d更換1次培養液，2周后細胞長滿80%瓶底可傳代。BMSCs的傳代培養：將第2代BMSCs瓶內的培養液棄去，加入PBS沖洗2次，以除去培養液中的血清，加入2 ml胰酶蛋白消化細胞，采用熒光倒置相差顯微鏡進行觀察，控制消化時間(2～3 min)。細胞收縮變圓時，立即加入含少量血清的培養液終止消化,用彎頭吸管輕輕吹打細胞，收集細胞懸液，800 r/min離心5min(離心半徑12.5 cm)，棄上清液。加入完全培養液充分吹打成單細胞懸液，按1∶3傳代接種于75 cm2培養瓶內，待細胞鋪滿瓶底后依上法繼續傳代培養。

1.3.2 篩選AST對BMSCs增殖的最佳作用濃度及時間 采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測AST對BMSCs的增殖作用。將AST的濃度設為50、100、200、400 μmol/L及24、48、72 h時間段。取第4代BMSCs，調整濃度為1×106/100 μl，用含10%胎牛血清的培養液吹打混勻成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種量為100 μl，邊緣用無菌PBS填充，設置調零孔(無血清培養基)、對照孔(不加AST的完全培養液培養細胞)及50、100、200、400 μmol/L亞組孔，每孔每板設置5個復孔，分別培養24、48、72 h后，各孔加入無菌MTT溶液20 μl，放入孵箱繼續培養4 h，吸去上清液，加入150 μl的DMSO，置搖床低速震蕩10 min后，于酶標儀下490 nm處測量各孔的吸光度值(即BMSCs增殖情況)。

1.3.3 BMSCs的誘導分化 取第4代BMSCs進行分組：空白對照組(BMSCs組)、5-AZA組、AST組進行誘導。BMSCs組加入含10%胎牛血清的培養液培養；5-AZA組加入濃度為10 μmol/L的5-AZA，誘導24 h；AST組加入濃度為100 μmol/L的AST誘導液，誘導72 h。每3 d更換1次完全培養液繼續培養，4周后對分化的細胞進行細胞形態學觀察以及分子生物學檢測。

1.3.4 采用Real-time qPCR檢測結蛋白(Desmin)、α橫紋肌肌動蛋白(α-SCA)、cTnI mRNA表達水平 提取總蛋白，800 r/min離心5 min(離心半徑12.5 cm)，去上清液，細胞沉淀中加入1 ml Trizol，充分混勻后室溫靜止5 min，然后轉移至新的1.5 ml專用EP管中進行反轉錄。RNA反轉錄成cDNA：將2 μl反轉錄引物(0.5 μg/μl)和2.0 μg 總RNA加入到無酶管中，補充Rnase-free water至10 μl；混勻后800 r/min離心5 min (離心半徑12.5 cm)，70 ℃溫浴10 min；后立即置于冰水混合物中冰浴，使反轉錄引物和模板退火；在上述混合物中，按以下的比例配制反應體系(冰上進行)混勻，800 r/min離心5 min(離心半徑12.5 cm)；在42 ℃水浴反應1 h，然后再70 ℃水浴10 min使反轉錄酶失活；將得到的cDNA置于-80 ℃保存備用。引物設計見表1。

表1 PCR引物序列

注：-表示無此項目；Desmin=結蛋白，α-SCA=α橫紋肌肌動蛋白，cTnI=肌鈣蛋白I

1.3.5 采用Western blotting法檢測各組誘導分化后cTnT的表達 收集各組細胞，用預冷PBS洗滌3次后，將細胞重懸于裂解液中，冰浴30 min，使細胞充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min(離心半徑12.5 cm)，收集上清液，進行蛋白質定量。各組取等量蛋白質，經5%、12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉膜至PVDF膜上，封閉后，與一抗結合，4 ℃搖床過夜；TBST洗滌后與二抗結合反應，同上洗滌。用ECL發光顯色后，在凝膠成像系統上曝光檢測，采用Quantity One 4.6.2軟件對圖像進行光密度分析，以GAPDH作為內參照。實驗重復3次。

2 結果

2.1AST對BMSCs增殖的最佳作用濃度及時間分析 50μmol/LAST亞組孔與在24、48、72h時BMSCs增殖情況比較，差異有統計學意義(P<0.05)；100μmol/LAST亞組孔在24、48、72h時BMSCs增殖情況比較，差異有統計學意義(P<0.05)；且100μmol/LAST亞組孔72h時BMSCs增殖情況好于24、48h時及其他亞組孔各時間點，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.2 誘導分化后細胞形態學觀察 誘導分化4周后，BMSCs組細胞形態多呈長梭形，細胞數量較多、密集分布，培養液中有少量凋亡細胞懸浮(見圖1A)；5-AZA組細胞體積增大，性狀類似“肌島樣”結構，部分細胞出現首尾相接的情況(見圖1B)；AST組細胞數量較多，呈束狀排列，成簇生長(見圖1C)。

2.3 誘導后各組Desmin、α-SCA、cTnImRNA表達水平比較 3組Desmin、α-SCA、cTnImRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與BMSCs組比較，5-AZA組和AST

表2 對照孔和AST孔不同時間點BMSCs增殖情況比較

注：與50 μmol/L亞組孔比較，aP<0.05；與200 μmol/L亞組孔比較，bP<0.05；與400 μmol/L亞組孔比較，cP<0.05；與100 μmol/L亞組孔24 h比較，dP<0.05；與100 μmol/L亞組孔48 h比較，eP<0.05；AST=黃芪甲苷

注：A為骨髓間充質干細胞(BMSCs)組，B為5-氮雜胞苷(5-AZA)組，C為黃芪甲苷(AST)組

圖1 熒光倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態變化

Figure 1 Morphological changes in BMSCs in the BMSCs group,5-AZA group and AST group observed by phase contrast fluorescence inverted microscopy

組的Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組的Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4 誘導后各組cTnT表達水平比較 BMSCs組、5-AZA組、AST組cTnT表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與BMSCs組比較，5-AZA組和AST組cTnT表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組cTnT表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2、表4)。

Table 3 Expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA in BMSCs group,5-AZA group and AST group measured by Real-time qPCR

組別DesminmRNAα-SCAmRNAcTnImRNABMSCs組1.00±0.001.00±0.001.00±0.005-AZA組1.59±0.56a1.24±0.01a1.11±0.03aAST組1.77±0.38ab1.96±0.08ab1.37±0.20abF值41.6464.4918.52P值0.0320.0300.030

注：與骨髓間充質干細胞(BMSCs)組比較，aP<0.05；與5-氮雜胞苷(5-AZA)組比較，bP<0.05

注：cTnT=肌鈣蛋白T

圖2 誘導后各組cTnT蛋白水平表達

Figure 2 Expression levels of cTnI protein in the BMSCs group,5-AZA group and AST group detected by Western blotting

Table4ExpressionlevelsofcTnIintheBMSCsgroup,5-AZAgroupandASTgroupdetectedbyWesternblotting

組別cTnTBMSCs組0.09±0.055-AZA組0.67±0.10aAST組0.21±0.05abF值129.29P值<0.01

注：與BMSCs組比較，aP<0.05；與5-AZA組比較，bP<0.05；cTnT=肌鈣蛋白T

3 討論

心肌梗死之后修復壞死的心肌、改善心肌功能是心肌梗死治療的關鍵所在。BMSCs是存在于骨髓基質中的非造血系的成體干細胞，具備向多種細胞分化的能力[10-12]。體外實驗研究證實，加入適當的誘導劑，可以使BMSCs定向分化為心肌樣細胞[13-14]。5-AZA是目前最常用也是被公認的最有效的誘導劑，但對細胞有一定的毒性作用[15-17]。因此，如何提高誘導分化的效率或尋找新的誘導分化因子，建立更加完善的誘導分化體系是目前醫學研究的迫切需要。黃芪是傳統的益氣類中藥，具有補氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌等功效，黃芪主要活性成分AST具有良好的強心作用，對缺血心肌細胞具有保護作用，能有效保護缺氧的心肌細胞，降低損傷程度，且對心肌肥大具有抑制作用[18]。

既往研究表明，Desmin、α-SCA、cTnI及cTnT作為心肌細胞分化的早期標志物已得到了公認，是目前特異性檢測心肌細胞應用最普遍的指標[19]。本研究結果顯示，AST在100 μmol/L濃度下作用72 h時對BMSCs增殖的作用最佳；熒光倒置相差顯微鏡觀察顯示，AST組BMSCs呈束狀排列，成簇狀生長，說明AST體外誘導SD大鼠BMSCs形態分化類似心肌樣細胞；MTT法檢測結果顯示，AST組Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達水平高于5-AZA組和BMSCs組；BMSCs組cTnT表達水平最低，AST組cTnT表達水平低于5-AZA組，表明AST能夠誘導BMSCs向心肌細胞分化，但促分化效果弱于5-AZA，與相關文獻報道一致[20]。

綜上所述，AST能夠誘導BMSCs向心肌細胞分化，具有效果顯著、作用確切等特點，符心血管疾病防治要求，有良好的應用推廣價值。

作者貢獻：趙靜苗進行文章的構思與設計，文獻資料收集、整理文章的可行性分析、撰寫論文、對文章整體負責；趙靜苗、王秋萍進行實驗研究，趙靜苗、胡繼宏進行論文的修訂，英文的修訂，文章的質量控制及審校，監督管理。

本文無利益沖突。

[1]張璇,許海燕.國內外急性心肌梗死注冊登記研究進展[J].心血管病學進展,2014,35(3):286-290.DOI:10.3969/j.issn.1004-3934.2014.03.005. ZHANG X,XU H Y.Progress in the registration of acute myocardial infarction athome and abroad[J].Advances in Cardiovascular Diseases,2014,35(3):286-290.DOI:10.3969/j.issn.1004-3934.2014.03.005.

[2]胡馨,劉紅旭.國內外急性心肌梗死注冊登記研究概況[J].北京中醫藥,2015,34(3):192-195.DOI：10.16025/j.1674-1307.2015.03.009. HU X,LIU H X.An overview of domestic and international research on the registration of acute myocardial infarction[J].Beijing Traditional Chinese Medicine,2015,34(3):192-195.DOI：10.16025/j.1674-1307.2015.03.009.

[3]胡大一.冠心病診斷與治療研究進展[J].中華心血管病雜志,2003,31(11):806-811.DOI:10.3760/j:issn:0253-3758.2003.11.002. HU D Y.Advances in diagnosis and treatment of coronary heart disease[J].Chinese Journal of Cardiology,2003,31(11):806-811.DOI:10.3760/j:issn:0253-3758.2003.11.002.

[4]張海燕,李強.心肌梗死后心室重構病理過程的研究進展[J].實用老年學,2012,26(3):251-253.DOI:10.3969/j.issn.1003-9198.2012.03.027. ZHANG H Y,LI Q.Research progress on the pathological process of ventricular remodeling after myocardial infarction[J].2012,26(3):251-253.DOI:10.3969/j.issn.1003-9198.2012.03.027.

[5] WANG H,ZHOU J,LIU Z,et al.Injectable cardiac tissue engineering for the treatment of myocardial infarction[J].J Cell Mol Med，2010，14(5):1044-1055.DOI:10.1111/j.1582-4934.2010.01046.x.

[6] ZHU H,SONG X,JIN L J,et al.Comparison of intra-coronary cell transplantation after myocardial infarction:autologous skeletal myoblasts versus bone marrow mesenchymal stem cells[J].J Int Med Res，2009，37(2):298-307.DOI:10.1177/147323000903700 203.

[7] MAKINO S,FUKUDA K,MIYOSHI S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow storml cells in vitro[J].J Clin Invest,1999,103(5):697-705.DOI: 10.1172/JCI5298.

[8] 孫敬和,冼紹祥,黃習文，等.中醫藥干預骨髓間充質干細胞體外定向誘導分化為心肌細胞的研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(1):115-118.DOI:10.3969/j.issn.1003-9783.2012.01.033. SUN J H,XIAN S X，HUANG X W,et al.Research progress of traditional Chinese medicine intervention on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes in vitro[J].Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology，2012,23(1):115-118.DOI:10.3969/j.issn.1003-9783.2012.01. 033.

[9]趙瑞東,周二霞,韓霞,等.黃芪甲苷對間充質干細胞生物活性的影響[J].世界最新醫學信息文摘,2015,15(19):10-11.DOI:10.3969/j.issn.1671-3141.2015.19.006. ZHAO R D,ZHOU E X,HAN X,et al.Effects of astragaloside Ⅳ on the biological activity of mesenchymal stem cell[J].World Latest Medicine Information,2015,15(19):10-11.DOI:10.3969/j.issn.1671-3141.2015.19.006.

[10] ZINK M,GOMBOTZ H,WASLER A,et al.Intragraft interleukin 2 mRNA expression during acute cellular rejection and left ventricular total wall thickness afterheart transplantation[J].Heart，2002，87(4):363.

[11]董亮,薛松.間充質干細胞向心肌細胞分化的誘導研究[J].國際心血管病雜志,2012,39(1):32-35.DOI:10.3969/j.issn.1673-6583.2012.01.010. DONG L,XUE S.Induction of differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes[J].International Journal of Cardiovascular Diseases,2012,39(1):32-35.DOI:10.3969/j.issn.1673-6583.2012.01.010.

[12] LI X H,FU Y H,LIN Q X,et al.Induced bone marow mesenchymal stem cells improve cardiac performance of infaerted rat hearts[J].Mol Biol Rep,2012,39(2):1333-1342.DOI:10.1007/s11033-011-0867-2.

[13]LI W,LI G,ZHANG Y,et al.Role of P2×7 receptor in the differentiation of bone marrow stomal cells into osteblasts and adipocytes[J].Exp Cell Res，2015,339(2)：367-379.DOI: 10.1016/j.yexcr.

[14] BAXTER M A,WYNN R F,JOWITT S N,et al.Study of telomere lenght reveals rapid aging of huamn marrow stomal cells following in vitro expansion[J].Stem Cells,2004,22(5):657-682.DOI: 10.1634/stemcells.22-5-675.

[15] BURLACU A,ROSCA A M,MANIU H,et al.Promoting effect of 5-azacytidine on the myogenic differentiation of boen marrow stromal cells[J].Eur J Cell Biol，2008,87(3):173-184.DOI:10.1016/j.ejcb.2007.09.003.

[16]冼紹祥,楊忠奇,秦佳佳，等.5-氮胞苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化及黃芪甲苷的協同作用[J].中國組織工程研究,2012,16(10):1861-1865.DOI:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.033. XIAN S X,YANG Z Q,QIN J J,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells induced by 5-azacytidine and astragaloside Ⅳ[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2012,16(10):1861-1865.DOI:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.033.

[17] 曹京燕,程月新,姜敏輝,等.5-氮胞苷體外誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞的分化[J].心臟雜志,2009,20(6):801-804.DOI:10.13191/j.chj.2009.06.51.caojy.007. CAO J Y,CHENG Y X,JIANG M H,et al.Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte like cells induced by 5-azacytidine vitro[J].2009,20(6):801-804.DOI:10.13191/j.chj.2009.06.51.caojy.007.

[18] ZHAO P,WANG Y,ZENG S,et al.Protective effect of astragaloside Ⅳ on lipopolysaccharide-induced cardiacdysfunction via downregulation of inflammatory signaling in mice[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2015，37(5):428-433.

[19]胡丙杰,陳玉川,祝家鎮，等.結蛋白診斷早期心肌梗死的特異性研究[J].法律與醫學雜志,2000,7(4):145-148.DOI:10.3969/j.issn.1674-1226.2000.04.001. HU B J,CHEN Y C,ZHU J Z，et al.Study on the specificity of desmin in the diagnosisof early myocardial infarction[J].Journal of Law and Medicine,2000,7(4):145-148.DOI:10.3969/j.issn.1674-1226.2000.04.001.

[20]黃燦,冼紹祥,馬春濤,等.黃芪甲苷預處理對無血清及缺氧誘導的骨髓間充質干細胞 TNF-α、TGF-β1基因表達的影響[J].長春中醫藥大學學報,2016,32(1):25-27,36.DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.008. HUANG C,XIAN S X,MA C T,et al.Effects of astragaloside pretreatment on the expression of TNF- alpha and TGF- beta 1 in bone marrow mesenchymal stem cells induced by serum and hypoxia in vitro[J].Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,2016,32(1):25-27,36.DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.008.

(本文編輯：趙躍翠)

Astragaloside Effect on the Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Cardiomyogenic Cells in Vitro

ZHAOJing-miao,HUJi-hong*,WANGQiu-ping

GansuKeyLaboratoryforthePreventionandTreatmentofMajorDiseasesbyMolecularMedicineandChineseMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000，China

*Correspondingauthor:HUJi-hong,Associateprofessor；E-mail：hujihonghappy@163.com

Objective To investigate the astragaloside(AST) effect on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) into cardiomyogenic cells in SD rats.Methods BMSCs were subcultured on behalf of BMSCs.The proliferation of BMSCs was detected by MTT assay at 24,48,72 h after the inducing with different concentrations of AST.The 4th generation of BMSCs were divided into BMSCs group,5-azacytidine group(5-AZA group) and AST group,cultured with the culture medium with 10% fetal bovine serum,the culture medium with 10 μmol/L 5-AZA,and the culture medium with 100 μmol/L AST,respectively.Morphological changes of BMSCs were observed by phase contrast fluorescence inverted microscopy.The expression levels of Desmin mRNA,α-Sarcomeric actin(α-SCA) mRNA and troponin(cTnI) mRNA in the BMSCs group,5-AZA group and AST group were measured by Real-time qPCR,and the expression levels of cTnT in these three groups were detected by western blotting.Results The proliferation of BMSCs was the best when they were induced for 72 h by AST at the concentration of 100 μmol / L(P<0.05).Morphological differentiation of BMSCs induced by AST in vitro was similar to that of cardiomyogenic cells.The BMSCs group had lower expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA than 5-AZA group and AST group(P<0.05).Compared with 5-AZA group,the expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA in AST group were higher(P<0.05).5-AZA group and AST group had higher cTnT expression levels than the BMSCs group(P<0.05).Compared with 5-AZA group,AST group had lower expression levels of cTnT(P<0.05).Conclusion The differentiation of BMSCs into cardiomyogenic cells in vitro can be promoted after being induced by AST with a concentration of 100 μmol/L for 72 hours,but the induction effect of AST is weaker than 5-AZA.

Myocytes,cardiac；Cell differentiation；Bone marrow mesenchymal stem cells;Astragaloside

國家自然科學基金資助項目(81260597)

R 329.21

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.05.y11

2017-02-20；

2017-05-10)

730000甘肅省蘭州市，甘肅中醫藥大學甘肅重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室

*通信作者：胡繼宏，副教授；E-mail：hujihonghappy@163.com