黃芪甲苷通過調控Keap1-Nrf2-ARE信號通路減輕PM2.5誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷

趙穎丹，張天嵩，馬 駿，張偉偉，易 揚，顧 波，王漢清，宣 怡

(上海市靜安區中心醫院 復旦大學附屬華山醫院靜安分院腎內科，上海 200040)

在大氣顆粒物中，細顆粒物2.5(particulate matter 2.5，PM2.5)占有較大比例，由于PM2.5具有較大的比表面積，其更易吸附重金屬和有機物，進而損傷人體健康[1-2]，因而具有更高的毒性。最近的研究表明，PM2.5很容易通過肺泡上皮細胞進入循環系統，最終破壞心血管系統和腎臟[3-5]。如Zhang等[6]研究發現，短期暴露PM2.5加重氧化應激和炎癥反應，從而促進BALB/c小鼠腎臟損傷。Yang等[7]同樣發現，PM2.5能夠激活核因子紅細胞相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素氧化酶-1(heme oxygenase 1, HO1)通路，進而加重人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷。因此，抑制氧化應激將有助于減輕PM2.5導致的腎損傷。黃芪甲苷是從常見中藥黃芪中提取的活性成分。Gui等[8]學者報道，黃芪甲苷可通過抑制凋亡途徑和氧化應激通路預防缺血引起的急性腎損傷。由此推測，黃芪甲苷可能有助于減輕PM2.5誘導的腎臟氧化損傷。因此，本研究通過體外實驗探究黃芪甲苷在抑制PM2.5誘導的腎臟氧化損傷中的作用及其分子機制，以期為PM2.5所致腎臟氧化損傷的治療提供幫助。

1 材料

1.1 試劑 HK-2細胞購：中國科學院細胞庫；DMEM和F12培養液：美國Thermo Fisher Scientific公司；黃芪甲苷：南京春秋生物工程有限公司；Western blot相關試劑、Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、CCK8試劑盒、BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒和一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；RIPA裂解液：上海雅吉生物科技有限公司；總活性氧(reactive oxygen species，ROS)分析試劑盒：Sigma Aldrich；抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)檢測試劑盒：R&D Systems；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；羊抗兔二抗：杭州華安生物技術有限公司；兔多克隆一抗：Abcam。

1.2 儀器 BioTek ELx800全自動酶標儀：美國BioTek公司；BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀：美國BD公司；ImageQuant RT ECL凝膠成像系統：美國GE Healthcare公司；TGL-18臺式高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；XDS-200D數碼電腦型倒置顯微鏡：蘇州景通儀器有限公司；TSP/PM10/PM2.5顆粒物大流量采樣器：青島精誠儀器儀表有限公司；全自動超聲波清洗機：深圳市深力勁超聲波自動化設備有限公司。

2 方法

2.1 PM2.5的采集 PM2.5采集于上海市靜安區中心醫院、華山醫院靜安分院；通過PM2.5大流量采樣器對PM2.5進行連續采樣(流量：1.05 m3/min；時間：22 h)。對采樣后的濾膜稱質量，并裁剪為1 cm×1 cm，浸泡去離子水的同時進行超聲振蕩(每次0.5 h，共3次)，隨后對洗提液進行6層紗布過濾，濾液經真空干燥后制成粉末，經紫外線照射殺菌0.5 h后，通過磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)配制成5 mg/mL的PM2.5懸液，使用前超聲振蕩15 min。

2.2 細胞分組 HK-2細胞培養基為含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養液；培養條件：5% CO2和37 ℃，匯合度70%～80%時消化，并按1∶4比例傳代培養。黃芪甲苷用PBS制成500 nmol/L的溶液。將HK-2細胞分為5組：對照組(僅PBS處理)、模型組(200 μg/mL PM2.5處理24 h)、黃芪甲苷低劑量組(200 μg/mL PM2.5及10 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)、黃芪甲苷中劑量組(200 μg/mL PM2.5以及100 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)、黃芪甲苷高劑量組(200 μg/mL PM2.5以及200 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 HK-2細胞經消化、離心、清洗后依次添加結合緩沖液(100 μL)、Annexin-Ⅴ-FITC(20 ng/L，10 μL)，在避光條件下孵育(37 ℃)0.5 h，隨后添加PI(50 ng/L，5 μL)，在避光條件下孵育(37 ℃)5 min，接著添加結合緩沖液(0.4 mL)，并迅速通過BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測凋亡率。

2.4 CCK8測定細胞增殖能力 1×106/mL HK-2細胞接種于96孔板中(每孔0.1 mL)，12 h后，更換含10% CCK8試劑的培養基0.1 mL，培養(37 ℃，避光條件下)2～3 h后，最后通過BioTek ELx800全自動酶標儀測定450 nm處的吸光值。

2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡 各組HK-2細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板內，濃度l×108/mL，培養過夜后給予各組相應處理，經4%多聚甲醛固定1 h后，PBS洗滌并添加3% H2O2封閉10 min；經0.1% Triton X-100檸檬酸鈉通透液孵育120 s后，添加TUNEL反應液并孵育60 min，經洗滌后添加POD轉換液并孵育(避光)30 min，接著添加DAB底物并且孵育10 min，最后封片并且在顯微鏡下觀察和分析。

2.6 EdU標記實驗測定細胞增殖能力 將4×103/mL HK-2細胞接種于96孔板中，12 h后，添加0.1 mL含EdU的培養基，孵育2 h，進行多聚甲醛固定以及Triton X-100通透處理，接著添加0.1 mL的Apollo染色反應液，封片后通過BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測細胞增殖能力。

2.7 Western blot檢測總Nrf2、核Nrf2、HO1、NQO1表達水平 經RIPA裂解液裂解30 min后,收集上清并檢測總蛋白濃度,然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉膜并封閉。接著孵育一抗過夜,包括Nrf2抗體(1∶500稀釋)、NAD(P)H醌脫氫酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]抗體(1∶500稀釋)、HO-1抗體(1∶500稀釋)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(1∶1 000稀釋)；洗膜后孵育羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋),2 h后添加電化學發光反應底物,暗室曝光后掃描底片,最后計算灰度值。

2.8 氧化應激指標檢測 將不同處理的HK-2細胞進行裂解，然后將上清液在冷的線粒體分離緩沖液中進行搖勻。使用ROS分析試劑盒、MDA含量檢測試劑盒檢測ROS和MDA水平；采用總SOD活性檢測試劑盒、GSH-px檢測試劑盒檢測GSH-px與SOD，詳細操作按照試劑盒說明書進行。

3 結果

3.1 黃芪甲苷減輕PM2.5誘導的腎小管上皮細胞損傷 流式細胞儀分析結果(圖1)顯示，PM2.5處理導致腎小管上皮細胞凋亡比例明顯增加，而給予黃芪甲苷處理后，凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨著黃芪甲苷濃度的提高，腎小管上皮細胞凋亡比例逐步降低。進一步行TUNEL染色，檢測結果(圖2)顯示與流式細胞儀分析結果相似的趨勢。隨后觀察黃芪甲苷對腎小管上皮細胞HK-2細胞增殖的影響。EdU細胞增殖檢測結果(圖3)顯示，PM2.5處理顯著抑制腎小管上皮細胞增殖(P<0.05)，而黃芪甲苷處理后，HK-2細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)；隨著黃芪甲苷濃度的提高，HK-2細胞增殖能力逐步增強。CCK8檢測結果顯示同樣的趨勢(圖4)。

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

3.2 黃芪甲苷抑制氧化應激反應 本研究對氧化應激反應進行檢測發現，PM2.5處理導致HK-2細胞ROS、MDA水平顯著提高(P<0.05)，而抗氧化酶SOD、GSH-Px水平均明顯降低(P<0.05)。給予黃芪甲苷處理后，PM2.5處理導致的ROS和MDA水平升高被顯著抑制，且隨黃芪甲苷處理濃度的增加，ROS和MDA水平不斷降低。進一步對抗氧化酶進行檢測發現，與模型組比較，黃芪甲苷處理后抗氧化酶SOD和GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)，且隨黃芪甲苷處理濃度的增加，SOD和GSH-Px水平不斷升高。見表1。

3.3 黃芪甲苷對Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-Nrf2-抗氧化反應元件(antioxident response element, ARE)信號通路的影響 本研究對氧化應激相關信號通路Keap1-Nrf2-ARE進行檢測發現，與對照組比較，PM2.5處理后總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平顯著降低(P<0.05)，而給予黃芪甲苷處理后，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平明顯升高(P<0.05)，且隨黃芪甲苷濃度的升高而升高。結果見圖5和表2。

表1 黃芪甲苷對HK-2細胞ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P<0.05；與黃芪甲苷中劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

研究顯示，PM2.5具有表面積較大、粒徑較小、含有較多有害物質且在空氣中漂浮時間長的特點，因而具有長距離傳輸的能力[9-10]。研究發現，PM2.5是由金屬(砷、鉛)、有機物(多環芳烴、有機碳)、微生物(真菌孢子、細菌)等成分組成的復雜混合物。這種顆粒非常小，很容易沉積在肺泡中[7,11]。最近的研究表明，PM2.5很容易通過肺泡上皮細胞進入循環系統，最終破壞心血管系統和腎臟[12-13]。因此，抑制PM2.5所致腎臟損傷也成為學者關注的焦點。本研究結果顯示，PM2.5處理后，腎小管上皮細胞凋亡率明顯增加；而給予黃芪甲苷處理后，細胞凋亡率明顯下降。這表明黃芪甲苷能夠抑制PM2.5所致腎小管上皮細胞凋亡。進一步檢測細胞增殖情況發現，經PM2.5處理的腎小管上皮細胞增殖力明顯降低，而經黃芪甲苷處理后，細胞增殖力則明顯高于模型組。結果說明黃芪甲苷處理有助于促進腎小管上皮細胞增殖。因此，黃芪甲苷的應用有助于PM2.5所致腎臟損傷的治療。

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；

表2 黃芪甲苷對Keap1-Nrf2-ARE信號通路相關蛋白相對表達水平的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P<0.05；與芪甲苷中劑量組比較，◇P<0.05

PM2.5所致氧化應激是其誘導生物學效應的關鍵機制[13-14]。如Hu等[15]研究顯示，PM2.5暴露可激活HaCaT角質形成細胞的氧化應激反應和線粒體凋亡，導致皮膚刺激和損傷。因此，本研究從氧化應激方面進一步探究黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細胞損傷的分子機制。結果顯示，PM2.5處理后，HK-2細胞ROS和MDA水平顯著升高，同時SOD、GSH-Px水平均明顯降低，說明PM2.5導致腎小管上皮細胞損傷是由氧化應激反應加重導致的。腎小管上皮細胞給予PM2.5和黃芪甲苷共同處理后，進一步檢測指標表明，ROS、MDA水平均顯著低于PM2.5處理的HK-2細胞，而SOD、GSH-Px水平顯著高于PM2.5處理的HK-2細胞。由此確定黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細胞損傷是由抑制氧化應激反應實現的。這與Yan等[16]的研究——黃芪甲苷通過抑制氧化應激反應減輕順鉑所致急性腎損傷的結果相近。

Keap1-Nrf2-ARE通路在氧化應激中作用明顯。Nrf2通過與ARE、Keap1相互作用，進而啟動下游解毒酶以及抗氧化蛋白的基因表達，展示出細胞保護作用[17-19]。因此，本研究探究了黃芪甲苷對Nrf2、HO1、NQO1表達的調控作用。結果顯示，腎小管上皮細胞經黃芪甲苷處理后，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1的表達水平均明顯升高；進一步分析發現，隨著黃芪甲苷濃度的增加，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1表達水平不斷升高。這說明黃芪甲苷的抗氧化作用是通過Keap1-Nrf2-ARE通路實現的，并且黃芪甲苷處理能夠促進Nrf2入核。目前多項研究報道了黃芪甲苷等中藥提取物在抗氧化應激中的作用[20-21]。如黃存東等[22]發現，黃芪甲苷通過調控Keap1-Nrf2-ARE通路保護腎小球系膜細胞免受高糖環境的損傷。然而黃芪甲苷如何促進Nrf2表達和入核目前尚未完全被闡明。

綜上所述，本研究探究了黃芪甲苷對PM2.5所致腎小管上皮細胞損傷的保護作用。結果顯示黃芪甲苷能夠通過調控Keap1-Nrf2-ARE信號通路抑制氧化應激反應，從而減輕PM2.5誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷。本研究結果將有助于腎小管上皮細胞氧化損傷的治療，以及為黃芪甲苷的臨床應用提供幫助。同時，黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細胞氧化損傷的體內研究以及黃芪甲苷作用時間的選擇仍需進一步研究。