基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術篩選乙型肝炎肝硬化至肝癌過程中血清標志蛋白的初步研究

王滄海，吳 靜，宿 慧，郭春梅，林 琳

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基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術篩選乙型肝炎肝硬化至肝癌過程中血清標志蛋白的初步研究

王滄海，吳 靜*，宿 慧，郭春梅，林 琳

目的 應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術分析乙型肝炎肝硬化至肝癌過程中血清標志蛋白的變化，以期發現早期肝癌甚至癌前病變時的血清標志物。方法 選取2010—2012年首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院收治的乙型肝炎肝硬化患者240例，對其進行隨訪，為期3年，每6個月抽血1次，保存血清。其中12例患者在隨訪過程中確診為原發性肝癌，2例患者留取血樣量不足，僅對10例患者的血樣進行分析。對完成隨訪未進展為肝癌的209例乙型肝炎肝硬化患者按照性別、年齡匹配選取40例。并選取同期本院體檢中心健康者的血樣40例。應用MALDI-TOF-MS技術分析患者血清蛋白質組學的變化。結果 應用CM10芯片共檢測出109個蛋白峰，其中具有差異的蛋白質分子量分別為：4 350.8 Da、6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da。其中4 350.8 Da隨著肝癌的發生逐漸呈上調趨勢，6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da隨著肝癌的發生呈下調趨勢。結論 隨著肝癌的發生，分子量為4 350.8 Da的蛋白質呈逐漸上調趨勢，其余6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da蛋白質呈逐漸下調趨勢。

肝腫瘤；肝硬化；光譜法，質量，基質輔助激光解吸電離

王滄海，吳靜，宿慧，等.基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術篩選乙型肝炎肝硬化至肝癌過程中血清標志蛋白的初步研究[J].中國全科醫學，2017，20(20)：2551-2554.[www.chinagp.net]

WANG C H,WU J,SU H,et al.Proteomic markers of the patients with liver cirrhosis to liver cancer by MALDI-TOF-MS[J].Chinese General Practice,2017，20(20)：2551-2554.

原發性肝癌是世界范圍內第二大死亡原因，其中我國患者占50%以上[1]。我國多見于患有慢性乙型肝炎、肝硬化患者，早期診斷原發性肝癌可明顯改善患者預后。臨床常用的篩查方法是肝臟超聲和血清甲胎蛋白(AFP)，AFP>200 μg/L提示肝癌[1]，難以早期診斷?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術是快速鑒定腫瘤標志物的有力工具，本研究擬應用此方法探討乙型肝炎肝硬化進展為原發性肝癌的患者在疾病進展過程中血清蛋白組的變化特點，以期尋找肝癌早期診斷的方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010—2012年首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院收治的乙型肝炎肝硬化患者240例，其中男144例，女96例；年齡29～70歲，平均年齡(53.0±10.3)歲。排除原發性肝癌及其他部位腫瘤患者。

1.2 方法 對患者進行隨訪，隨訪時間為3年。隨訪過程中每6個月抽血1次，檢測AFP和生化肝功能，并行肝臟超聲(必要時腹部增強CT/MRI)確診肝癌。并同時抽取患者空腹12 h晨起靜脈血5 ml，不抗凝，靜置1 h，以2 500 r/min離心5 min，離心半徑16 cm，提取血清，凍存于-80 ℃。并選取同期本院體檢中心健康者40例，其中男30例，女10例；年齡30～75歲，平均年齡(56.1±14.7)歲。

1.3 MALDI-TOF-MS儀器和方法

1.3.1 儀器 美國Ciphergen公司生產蛋白飛行質譜儀(PBS IIc型)，本實驗采用化學修飾的CM10芯片。

1.3.2 操作步驟 (1)血清樣品處理：從-80 ℃冰箱中取出血清，于4 ℃溶解，以10 000 r/min離心2 min，離心半徑16 cm。取3 μl血清樣品，加6 μl U9處理液〔9 mol/L尿素，2% CHAPS，1%二硫蘇糖醇(DTT)，50 mmol/L Tris-Cl，pH 9.0〕，充分混勻，冰浴振蕩30 min后取出，加入108 μl結合緩沖液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)，立即混勻。(2)上樣及洗脫：將CM10芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200 μl結合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，5 min/次，甩干。每孔分別加入100 μl樣品混合液，振蕩孵育1 h，甩去樣品，用200 μl洗脫緩沖液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)室溫振蕩洗滌2次，5 min/次，甩干；再用HPLC H2O洗滌1次，立即甩干。拆開bioprocessor，取出芯片，晾干后，每點加2次0.5 μl SPA，晾干后即可上機測量。(3)數據采集：采用Ciphergen Proteinchip 3.1版本的分析軟件自動采集數據，采用Biomarker Wizard軟件分析實驗前后血清的蛋白質指紋圖譜差異。

1.4 統計學方法 采用Ciphergen Proteinchip 3.1及Biomarker Wizard軟件對數據進行統計學處理，確定各組間蛋白峰值的差異。

2 結果

共221例患者完成3年隨訪，其中12例患者在隨訪過程中確診為原發性肝癌，2例患者留取血樣量不足，僅對10例患者的血樣進行分析，其中男10例，女2例；平均年齡(47.7±8.2)歲。對完成隨訪未進展為肝癌的209例乙型肝炎肝硬化患者按照性別、年齡匹配選取40例，其中男35例，女5例；平均年齡(48.8±12.1)歲。應用CM10芯片共檢測出109個蛋白峰，其中具有差異的蛋白質分子量分別為：4 350.8 Da、6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da(見圖1～4)，15 893 Da未生成蛋白質質譜圖。其中4 350.8 Da隨著肝癌的發生逐漸呈上調趨勢，6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da隨著肝癌的發生呈下調趨勢(見圖5～9)。

注：橫軸為蛋白質分子量，縱軸為蛋白豐度，底部為模擬明膠酶譜

圖1 分子量為4 350.8 Da蛋白質質譜圖

Figure 1 Mass spectrometry of 4 350.8 Da protein

注：橫軸為蛋白分子量，縱軸為蛋白豐度，底部為模擬明膠酶譜

圖2 分子量為6 858.5 Da蛋白質質譜圖

Figure 2 Mass spectrometry of 6 858.5 Da protein

注：橫軸為蛋白分子量，縱軸為蛋白豐度，底部為模擬明膠酶譜

圖3 分子量為7 571 Da蛋白質質譜圖

Figure 3 Mass spectrometry of 7 571 Da protein

注：橫軸為蛋白分子量，縱軸為蛋白豐度，底部為模擬明膠酶譜

圖4 分子量為15 125 Da蛋白質質譜圖

Figure 4 Mass spectrometry of 15 893 Da protein

圖5 分子量為4 350.8 Da蛋白質在肝癌患者中的表達隨時間上升

Figure 5 The expression of 4 350.8 Da in HCC patients increased with time

圖6 分子量為6 858.5 Da蛋白質在肝癌患者中的表達隨時間下降

Figure 6 The expression of 6 858.5 Da in HCC patients decreased with time

圖7 分子量為7 571 Da蛋白質在肝癌患者中的表達隨時間下降

Figure 7 The expression of 7 571 Da in HCC patients decreased with time

圖8 分子量為15 125 Da蛋白質在肝癌患者中的表達隨時間下降

Figure 8 The expression of 15 125 Da in HCC patients decreased with time

圖9 分子量為15 893 Da蛋白質在肝癌患者中的表達隨時間下降

Figure 9 The expression of 15 893 Da in HCC patients decreased with time

3 討論

蛋白質組學研究常用的MALDI-TOF-MS技術是快速鑒定疾病標志物的一個有力工具，在卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤標志物的研究中取得了許多成果?？捎醚?、腦脊液、乳腺分泌物、組織裂解液等上樣，具有快速、高通量、靈敏度高、易操作等特點，尤其對低豐度蛋白質和小分子量蛋白質有較高的檢測靈敏度[2]。

ZHU等[3]對25例乙型肝炎病毒(HBV)導致肝硬化患者、20例肝細胞癌(HCC)患者和25例匹配健康人的血清經MALDI-TOF-MS檢測，發現2種潛在的生物標志物，分子量分別是7 772 Da和3 933 Da，在肝硬化患者血清中呈下調表現。PARADIS等[4]采用MALDI-TOF-MS分析82例肝硬化伴或不伴肝癌患者的血清發現，有30個蛋白質峰度在兩者之間存在差異，經進一步純化和鑒定發現最高的差異峰是vitronetin的C端。STEEL等[5]分別對健康組、無活動性慢性HBV攜帶組、有活動性慢性HBV攜帶組和慢性感染病史組的血清混合進行MALDI-TOF-MS分析，發現與健康組相比，HCC組有2個點在肝癌患者血清中表達豐度是低的，經質量指紋圖譜鑒定，分別是補體C3的羧基端和載脂蛋白A1的異形體。

王家祥等[6]應用MALDI-TOF-MS分析肝癌、肝硬化、正常人的血清，并使用人工神經網絡的方法進行數據分析，肝癌組和肝硬化組比較，分子量為7 759 Da和13 134 Da的2個蛋白質峰有顯著差異，肝癌組與正常人比較，分子量為3 015 Da和5 900 Da的2個蛋白質峰有顯著差異，建立人工神經網絡后以新樣本進行盲法測試，認為利用人工神經網絡預測肝癌的總準確率為91.7%、靈敏度為94.6%和特異度為88.2%。黃成等[7]收集135例原發性肝癌患者，根據有無門靜脈癌栓分為兩組，對其治療前的血清進行MALDI-TOF-MS分析，檢出16個蛋白峰有顯著差異，其中分子量為3 478 Da、1 314 Da、1 744 Da、1 725 Da、2 022 Da、3 380 Da蛋白質在門靜脈癌栓組上調，而8 901 Da、9 353 Da、9 415 Da、8 773 Da、2 766 Da、2 745 Da、8 697 Da、7 773 Da、8 569 Da、1 373 Da蛋白質在門靜脈癌栓組下調，以此建立的決策樹模型準確率為87.5%，靈敏度為100.0%，特異度為77.3%，陽性預測值為78.3%，陰性預測值為100.0%。

劉麗杰等[8]篩選HBV相關肝癌血清差異表達蛋白，其中差異最顯著蛋白(質荷比為5 805)酶解產物表達水平為：正常人群<慢性肝炎組<肝硬化組<肝癌組。鄧敬桓等[9]研究顯示，肝癌高發家系組與無癌家系組共有15個蛋白質具有差異，篩選出4個蛋白質峰建立診斷模型的靈敏度為96.0%(24/25)，特異度為88.0%(22/25)，準確率為92.0%。齊義軍等[10]應用MALDI-TOF-MS同樣可以觀察肝癌患者肝動脈化療栓塞術(TACE)治療前后蛋白質譜的變化。

與上述研究的區別是，本研究采用CM10芯片檢測患者血清蛋白指紋圖譜，主要是動態觀察在乙型肝炎肝硬化進展至原發性肝癌過程中，患者血清蛋白質譜的動態變化趨勢，10例乙型肝炎肝硬化隨訪過程中出現肝癌的患者歷次血清中發生了逐步變化的蛋白質共5種，隨腫瘤的發生呈上調或下調狀態，由于本研究例數較少，無法建立人工神經網絡或決策樹模型，僅能初步觀察具有變化趨勢的蛋白。目前本研究仍有肝硬化患者在進一步隨訪中，有望將上述5種蛋白在罹患肝癌的患者中得到驗證，如能確定其肝癌標志物的地位，可能在以后應用于原發性肝癌的臨床早期診斷。

作者貢獻：王滄海進行文章的構思與設計、撰寫論文；王滄海、吳靜進行研究的實施與可行性分析、論文的修訂、負責文章的質量控制及審校；宿慧、郭春梅、林琳進行數據收集；王滄海、宿慧、郭春梅、林琳進行數據整理、統計學處理、結果的分析與解釋；吳靜對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Proteomic Markers of the Patients with Liver Cirrhosis to Liver Cancer by MALDI-TOF-MS

WANGCang-hai,WUJing*,SUHui,GUOChun-mei,LINLin

DepartmentofGastroenterology,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038，China

*Correspondingauthor：WUJing,Chiefphysician;E-mail：wujing36@163.com

Objective To analyze the changes of serum marker proteins in hepatitis B patients from liver cirrhosis to hepatocellular carcinoma by using matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS),in order to detect serum markers of early liver cancer or even precancerous lesions.Methods From 2010 to 2012,a total of 240 patients with hepatitis B cirrhosis admitted to Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University were enrolled.The patients were followed up for 3 years.The blood was extracted once every 6 months and the serum was preserved.Among them,12 patients were diagnosed as primary liver cancer during follow-up.The blood samples of 2 patients were insufficient and only the blood samples of 10 patients were analyzed.40 cases were selected from 209 patients with hepatitis B cirrhosis who completed follow-up without progression to liver cancer according to sex and age.The blood samples of 40 healthy people in the physical examination center during the same period were selected.The serum proteomic changes of patients were analyzed by using MALDI-TOF-MS technique.Results A total of 109 protein peaks were detected by CM10 chip,Among them,the molecular weights of the proteins with significant differences were 4 350.8 Da,6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da,and 15 893 Da,respectively.And 4 350.8 Da showed a gradually increased trend with the occurrence of liver cancer,and 6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da and 15 893 Da showed a downward trend with the occurrence of liver cancer.Conclusion With the occurrence of liver cancer,the protein with molecular weight of 4 350.8 Da shows a gradual upward trend,while the proteins with molecular weight of 6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da,15 893 Da show a gradual downward trend.

Liver neoplasms;Liver cirrhosis;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y04

2016-10-29；

2017-04-06)

100038北京市，首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院消化內科

*通信作者：吳靜，主任醫師；E-mail：wujing36@163.com