寧夏無果枸杞芽水提物對老年小鼠心肌細胞抗氧化及凋亡蛋白表達的影響

馬新偉，劉 郎，曹羿堃，嚴 青，秦 毅，賈 樺，張蓮香，4△

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，銀川 750004;2.寧夏醫科大學總醫院，銀川 750004;3.寧夏回族自治區石嘴山市第一人民醫院 753600;4.寧夏顱腦疾病重點實驗室,銀川 750004)

論著·基礎研究

寧夏無果枸杞芽水提物對老年小鼠心肌細胞抗氧化及凋亡蛋白表達的影響

馬新偉1，劉 郎2#，曹羿堃3，嚴 青1，秦 毅1，賈 樺1，張蓮香1，4△

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，銀川 750004;2.寧夏醫科大學總醫院，銀川 750004;3.寧夏回族自治區石嘴山市第一人民醫院 753600;4.寧夏顱腦疾病重點實驗室,銀川 750004)

目的 觀察寧夏無果枸杞芽水提物對老年小鼠心肌細胞抗氧化能力及凋亡相關蛋白表達的影響。方法 將13個月齡自然衰老的C57BL/6J小鼠分為老年對照組和AEFLS低劑量組(AEFLS1組)、AEFLS中劑量組(AEFLS2組)、AEFLS高劑量組(AEFLS3組)。AEFLS1組、AEFLS2組、AEFLS3組分別給予5、10、20 mg/kg的AEFLS灌胃，老年對照組灌胃生理鹽水，連續8周。分別用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定心臟組織SOD和MDA的水平；Western-blot技術和免疫組織化學方法檢測小鼠心肌組織Bcl-2、Bax和Capase-3的表達。結果 與老年對照組比較，AEFLS2和AEFLS3組MDA水平降低，SOD活性升高,差異有統計學意義(P<0.01)。 Western-blot結果：與老年對照組比較，AEFLS2和AEFLS3組的Bcl-2蛋白光密度值升高，Bax和Capase-3蛋白光密度值降低(P<0.01)；免疫組化結果：與老年對照組比較，AEFLS2和AEFLS3組Bcl-2 蛋白免疫陽性表達均升高，Bax和Capase-3蛋白免疫陽性表達降低(P<0.01)。結論 中、高劑量的 AEFLS 能提高衰老小鼠的心肌組織抗氧化能力，上調Bcl-2的表達，下調Capase-3和Bax的表達，發揮抗心肌細胞凋亡的作用。

衰老；無果枸杞芽；心臟；抗氧化；凋亡

研究表明，隨著年齡的增加心臟功能逐漸減退，其主要原因一方面老年心肌細胞不能再生，另一方面隨著年齡的增長心肌細胞的丟失增多，而這種心肌細胞的丟失以細胞凋亡為主[1-2]。故通過藥物干預延緩或減少心肌細胞凋亡，進而延緩增齡造成的心功能的減退是研究的重點。枸杞為傳統的抗衰老中藥，無果枸杞芽為無果枸杞樹上采摘的嫩芽，作者研究發現無果枸杞芽提取物可提高衰老小鼠腦組織抗氧化能力[3-4]，發揮抗衰老作用，但關于對心肌細胞衰老的影響少見報道。本研究擬觀察無果枸杞芽水提物(AEFLS)對老年小鼠心肌組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平及凋亡蛋白表達的影響，為探討其抗心肌細胞衰老機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 酶標儀(上海)，RE501旋轉蒸發器(上海)，冰凍切片機(德國，Leica公司)，電泳儀、轉移槽、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。蛋白測定試劑盒、SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物研究所)，蛋白提取試劑盒、兔抗人Bcl-2、Bax和Capase-3 多克隆抗體、SP試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗動物及分組 取健康SPF級C57BL/6J雄性小鼠13月齡60只，老年小鼠月齡的確定參考方喜業主編的《醫學實驗動物學》[5]，小鼠由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(寧)(2005-0001)，隨機分為AEFLS低劑量組(AEFLS1)、AEFLS中劑量組(AEFLS2)、AEFLS高劑量組(AEFLS3)和老年對照組，每組15只。

1.3 方法

1.3.1 無果枸杞芽水提物的制備及給藥方法 取無果枸杞芽干品(寧夏杞芽食品科技有限公司提供，批號0955A0111)1 kg 浸泡12 h，煎煮5 h,過濾取出藥液，藥渣加冷水再煎，反復3次，合并藥液，靜置沉淀，用4層紗布過濾 3次，煎出的藥液放到小火上煎煮蒸發濃縮，使它逐漸形成稠膏狀。制備的無果枸杞芽水提物每克膏相當于3.17 g生藥。根據《中國藥典》成人(體質量60 kg為參考)中草藥的劑量與小鼠(體質量20 g為參考)用藥劑量進行換算，將水提物分為3個劑量5、10、20 mg/kg，按0.2 mL/10 g溶解在蒸餾水中，以灌胃的方式給予，1次/天，持續8周，對照組灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 取材 將各組小鼠取5只，用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，取材做石蠟包埋備用。

1.3.3 小鼠心臟組織SOD和MDA含量的測定 各組小鼠取5只斷頭處死，取左心室稱重，按1∶15的比例加入蛋白裂解液勻漿，4 ℃ 4 500 r/min離心15 min，取上清液，進行蛋白定量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，其余蛋白-80 ℃保存。

1.3.4 Western-blot技術檢測Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表達 取已提取的蛋白按照Western-blot操作步驟檢測Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表達，用Bio-Rad分析系統得到相對光密度比值。

1.3.5 免疫組化SP法檢測Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表達 制備5 μm石蠟切片進行免疫組織化學染色，具體步驟按照免疫組化SP法操作說明書進行，光學顯微鏡下觀察。Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白免疫反應陽性表現為棕色或棕黃色顆粒,陽性顆粒定位于細胞胞漿中。每張切片于陽性表達區域選擇5個無重復視野，用圖像分析系統分析其光密度值。

2 結 果

2.1 各組SOD和MDA水平 與老年對照組比較，AEFLS2和AEFLS3組心肌組織SOD活性明顯增加，AEFLS3組MDA水平明顯下降(P<0.01)；AEFLS1組SOD活性及AEFLS1、AEFLS2組MDA水平無明顯變化(P>0.05)。與AEFLS1組比較，AEFLS2和AEFLS3組心肌組織SOD活性明顯增加(P<0.01)；AEFLS3組MDA水平明顯下降(P<0.01)。 見表1。

2.2 SP法檢測小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達 各組小鼠心肌細胞均可見Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白免疫陽性細胞，陽性細胞為棕黃色，免疫陽性顆粒主要表達在胞漿。各組分別選取5個高倍視野，統計免疫陽性細胞的光密度值，結果見圖1、2、3。Bcl-2免疫陽性細胞：與老年對照組比較，AEFLS1組陽性細胞光密度值差異無統計學意義(P>0.05)； AEFLS2組和AEFLS3組免疫反應陽性細胞光密度值明顯增加(P<0.01)。與AEFLS1組比較，AEFLS2組和AEFLS3組免疫陽性細胞的光密度值增加(P<0.01)。Bax及Caspase-3免疫陽性細胞光密度值：老年對照組及AEFLS1組Bax及Caspase-3免疫陽性細胞光密度值較高，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；AEFLS2組和AEFLS3組明顯降低，與老年對照組及AEFLS1組比較，AEFLS2組和AEFLS3組蛋白光密度值減小(P<0.01)；AEFLS2組和AEFLS3組光密度值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠心肌組織SOD和MDA水平比較

*：P<0.01，與老年對照組比較；#：P<0.01，與AEFLS1組比較。

A:對照組;B：AEFLS1組；C：AEFLS2組；D：AEFLS3組。

圖1 各組Bcl-2蛋白的表達(Bar:50 μm)

A:對照組;B：AEFLS1組；C：AEFLS2組；D：AEFLS3組。

圖2 各組Caspase-3蛋白的表達(Bar:50 μm)

*：P<0.01,與對照組比較；#：P<0.01，AEFLS1組比較。

圖3 各組Bcl-2、Capase-2蛋白免疫陽性細胞的平均光密度值

*：P<0.01,與對照組比較；#：P<0.01，AEFLS1組比較。

圖4 各組Wester-blot檢測結果

2.3 Western Blot技術Bcl-2、Bax和Caspase-3的相對光密度比值 與老年對照組比較，AEFLS1組Bcl-2蛋白相對光密度比值差異無統計學意義(P>0.05)；AEFLS2和AEFLS3組Bcl-2蛋白的光密度比值明顯增高(P<0.01)。與AEFLS1組比較，AEFLS2和AEFLS3組Bcl-2 蛋白光密度比值亦明顯增高(P<0.01)；AEFLS2組 與AEFLS3組比較，Bcl-2 蛋白光密度比值差異無統計學意義(P>0.05)。Bax和Caspase-3蛋白相對光密度比值：與老年對照組比較，AEFLS1組兩種蛋白的光密度比值差異無統計學意義(P>0.05)；AEFLS2組和AEFLS3組Bax和Caspase-3蛋白光密度比值降低(P<0.01)。與AEFLS1組比較，AEFLS2和AEFLS3組Bax和Caspase-3蛋白光密度比值降低(P<0.01)；AEFLS2與AEFLS3組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖5 各組Western-blot檢測結果

3 討 論

既往研究認為心肌細胞死亡之后很難再生。Anversa等[6]研究發現心肌細胞在不斷發生凋亡、壞死中再生，心肌細胞的增殖和丟失是維持正常心臟組織自穩態的一部分。成年后，隨著年齡的增加心肌細胞逐漸出現老化，其典型表現是心肌細胞丟失增多和增殖減少，增齡造成的心肌細胞丟失由細胞壞死、自噬和凋亡共同作用的結果。生理狀態下，以細胞凋亡為主。隨著年齡增加，心臟自身生理功能與應激能力下降[7]，人體內自由基清除系統呈退化趨勢,造成脂質過氧化和自由基大量積聚，引起心肌細胞凋亡增加，進而導致心肌收縮和舒張功能降低[8-11]。凋亡是由基因控制的程序性細胞死亡方式，提示可通過抑制或減少細胞凋亡來降低心肌細胞丟失率進而延緩心功能的下降。如何最大限度地減少心肌細胞的死亡，在防治老年心臟退行性疾病中具有重要意義，中藥的抗衰老作用效果顯著。

枸杞的抗衰老作用，歷代醫書都有記載，其根、莖、芽、果均可入藥。早在唐代甄權的《藥性本草》中已有關于枸杞葉藥用價值的記載?！妒朝煴静荨?“堅筋耐老，除風，補益筋骨，能益人，去虛勞”。有較多文獻[12-13]報道枸杞芽具有增強免疫、抗疲勞、耐缺氧等功效。本文應用的寧夏無果枸杞芽經甘肅農業大學重點實驗室檢測，多種成分遠高于枸杞果和普通枸杞芽，其中多酚類物質含量是綠茶的3倍，每百克中含兒茶素14.9 g，硒27 μg、黃酮520 mg、鐵3.71 mg、鎂1 060 mg、鉀669 mg、磷1 570 mg、鈣12.2 mg、鋅30 μg，生物素16 μg。文獻[14]報道黃酮類、多酚類、兒茶素類物質具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老等功效。文獻[15-16]報道微量元素如鋅、硒、銅、鐵、磷、鈣等在抗衰老機制中發揮重要的作用。李寶玉等[17]研究發現補鋅可緩解由缺鋅誘導的心肌纖維化對心肌細胞和心肌纖維起到保護作用。因無果枸杞芽中多種微量元素和生物活性物質含量較高，推測其可清除心肌中的自由基、發揮抗氧化、抗心肌細胞凋亡的作用。

因此，本研究觀察了無果枸杞芽水提物對衰老心臟的抗氧化作用和對凋亡蛋白表達的影響。結果顯示：給予衰老小鼠灌胃無果枸杞芽水提物8周，無果枸杞芽水提物低劑量組小鼠心臟組織SOD及MDA水平無明顯變化，中、高劑量的無果枸杞芽水提物可使小鼠心臟組織SOD活性明顯提高，高劑量的無果枸杞芽水提物可明顯降低小鼠心臟組織MDA水平，提示低劑量的無果枸杞芽水提物其抗氧化能力相對較弱，不能完全清除自由基抵御損傷的作用；中、高劑量的無果枸杞芽水提物其抗氧化成分含量較高，可顯著提高衰老小鼠SOD活性，發揮其抗氧化能力，SOD 不斷清除心肌組織中的自由基，減少脂質過氧化，降低氧自由基對心肌組織造成的損害，保證心肌組織代謝平衡，維持其功能正常，發揮抗氧化、抗衰老作用。

本研究應用不同劑量的無果枸杞芽水提物干預后，通過免疫組織化學方法和 Wstern-blot 技術觀察到衰老心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達變化，結果表明中、高劑量的無果枸杞芽水提物可增加衰老心肌細胞Bcl-2蛋白的表達，降低Bax和Caspase-3蛋白的表達。而且免疫組化和Western-blot檢測結果一致，實驗結果亦表明中、高劑量的無果枸杞芽水提物使Bcl-2/Bax比值增加，提示無果枸杞芽水提物可改變Bcl-2 蛋白家族Bcl-2家族成員的表達，減少心肌細胞的凋亡。

因此，無果枸杞芽水提物抗心肌細胞凋亡機制可能與提高衰老小鼠心臟組織SOD活性，降低MDA水平，提高機體抗氧化能力，減少了氧自由基在體內的堆積對心肌組織造成的損害，同時無果枸杞芽水提物上調抗凋亡蛋白Bcl-2，下調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白的表達，提高Bcl-2/Bax比值有關，發揮抗心肌細胞凋亡的作用。有關無果枸杞芽水提物中的哪種或哪些成分發揮了作用需要進一步深入研究。

[1]Mallat Z,Fornes P,Costagliola R,et al.Age and gender effects on cardiomyocyte apoptosis in the normal human heart[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2001,56(11):719-723.

[2]Lakatta EG.Cardiovascular regulatory mechanisms in advanced age[J].Physiol Rev,1993,73(2):413-467.

[3]陳海軍，王慧茹，張蓮香，等．寧夏無果枸杞芽水提物對慢性溫和不可預見性應激小鼠學習記憶的影響[J]．神經解剖學雜志，2014，30(2)：211-216．

[4]張蓮香，陳海軍，胡嘉航，等．寧夏無果枸杞芽提取物對自然衰老小鼠SOD、MDA及NCAM的影響[J]．寧夏醫科大學學報，2012，34(12)：1265-1268.

[5]中華醫學會.法定計量單位在醫學上的應用[M].3版.北京：人民軍醫出版社，2001.

[6]Anversa P,Nadal-Ginard B.Myocyte renewal and ventricular remodelling[J].Nature,2002,415(6868):240-243.

[7]Warner HR,Hodes RJ,Pocinki K.What does cell death have to do with aging?[J].J Am Geriatr Soc,1997,45(9):1140-1146.

[8]Dorn GW.Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure[J].Cell Cycle,2010,9(17):3442-3448.

[9]Boengler K,Schulz R,Heusch G.Loss of cardioprotection with ageing[J].Cardiovasc Res,2009,83(2):247-261.

[10]Nitahara JA,Cheng W,Liu Y,et al.Intracellular Calcium,DNase activity and myocyte apoptosis in aging Fischer 344 rats[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30(3):519-535.

[11]王瑾，王曉樑，白克華，等．心肌細胞凋亡對老年大鼠心臟功能的影響[J]．山西醫科大學學報，2013，44(10)：758-762．

[12]王莉，魏智清．寧夏枸杞芽水提物增強小鼠抗疲勞抗缺氧能力研究[J]．時珍國醫國藥，2012，23(3)：583-584．

[13]Shi XY.The antioxidation and mechanism of tea polyphenols[J].Foreign Med Sci:SecPharm,1998,25(4):196-198.

[14]Chen X,Lu Y,Li QS,et al.The protective effect of EGCG on Hydrogen peroxide induced SH-SY5Y cell injury[J].Chin Pharmacol Bull,2011,27(3):320-324.

[15]龔太平，紀曉萍．傳統中醫抗衰老中藥的微量元素分析[J]．微量元素與健康研究，2002，19(3)：32-33．

[16]Ostrakhovitch LA,Lordnejad MR,Schliess F,et al.Copper ions strongly activate thephosphorinositide 3-kinase/Akt pathway independent strongly of the generation of reactive oxygen species[J].Arch Biochem Biophys,2002,397(2):232-239.

[17]李保玉，金毅，王景華，等．ET-NO系統與心肌膠原代謝的關系[J]．臨床與實驗病理學雜志，1999，15(1)：57-59．

Effect of Ningxia fruitless lycium sprout extracts on cardiomyocyte antioxidation and apoptotic protein expression in aging mice*

MaXinwei1,LiuLang2#,CaoYikun3,YanQin1,QinYi1,JiaHua1,ZhangLianxiang1,4△

(1.FacultyofHumanAnatomy,HistologyandEmbryology,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.GeneralHospital,AffiliatedHopsitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;3.ShizuishangMunicipalFirstPeople′sHospital,Shizuishang,Ningxia753000,China;4.NingxiaKeyLaboratoryofCerebrocranialDiseases,Yinchuan,Ningxia750004,China)

Objective To observe the effect of Ningxia aqueous extracts of fruitless lycium sprout (AEFLS ) on cardiomyocyte antioxidation and apoptosis-related protein expression in aging mice.Methods The natural aging C57BL/6J mice with 13 months old were randomly divided into aged control group,AEFLS low dose group(AEFLS1),AEFLS middle dose group(AEFLS2)and AEFLS high dose group(AEFLS3).The AEFLS1,AEFLS2 and AEFLS3 groups were respectively given with 5,10,20 mg/kg AEFLS gavage,while the aged control group was given with the normal saline gavage,for continuous 8 weeks.The xanthine oxidase assay and thiobarbituric acid method were used for the determination of SOD and MDA in heart tissues.Western-blot and immunohistochemical method were used to detect the expressions of Bcl-2,Bax and Capase-3 in heart tissue.Results Compared with the aged control group,the MDA level in the AEFLS2 and AEFLS3 groups was decreased,while the SOD activity was increased,the difference was statistically significant (P<0.01).The Western-blot result showed that compared with the aged control group,the optical density value of Bcl-2 in the AEFLS2 and AEFLS3 groups was increased,but the optical density values of Bax and Capase-3 were decreased (P<0.01);the immunohistochemical results showed that compared with the aged control group,the immunopositive(IP) expressions of Bcl-2 protein in heart tissues in the AEFLS2 and AEFLS3 groups were increased (P<0.01),while the IP expressions of Bax and Capase-3 were decreased (P<0.01).Conclusion Middle and high doses of AEFLS can increase the antioxidative ability of myocardial tissue,up-regulates the Bcl-2 expression,down-regulates the Bax and Capase-3 expressions and plays anti-cardiomyocyte apoptotic role.

aging;aqueous extract of fruitless lycium sprout;heart;antioxidant;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.004

教育部春暉計劃項目(11045)；寧夏醫科大學面上項目(NY2014053)。 作者簡介：馬新偉(1980-),實驗師，本科，主要從事衰老和地方中草藥抗衰老研究。#：共同第一作者，劉郎(1983-)，在讀研究生，主管技師，主要從事心血管疾病的相關研究?！?/p>

，E-mail:zhlianxiang@163.com。

R285

A

1671-8348(2017)16-2170-04

2017-01-20

2017-03-24)