原發性肝癌患者腫瘤轉移與T細胞亞群及其細胞因子的相關性分析

胡叢崗,湯國軍,王建軍,童 骎

(金華廣福醫院胃腸外科，浙江金華 321000)

原發性肝癌患者腫瘤轉移與T細胞亞群及其細胞因子的相關性分析

胡叢崗,湯國軍,王建軍,童 骎

(金華廣福醫院胃腸外科，浙江金華 321000)

目的 探討原發性肝癌患者腫瘤轉移與T細胞亞群及其細胞因子的相關性。方法 2014年1月至2016年1月前瞻性收集原發性肝癌患者97例，根據患者是否發生轉移，將患者分為轉移組和非轉移組，其中轉移組38例，非轉移組59例。所有患者均取得手術標本，使用流式細胞儀測定肝癌組織、癌旁組織和外周血CD4+、CD8+T細胞比例，同時使用酶聯免疫吸附試驗測定外周血中白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ)水平。結果 與非轉移組相比，轉移組患者肝癌組織中CD4+T細胞比例顯著升高(P=0.002)；CD8+T細胞顯著降低(P=0.015)。兩組患者癌旁組織中CD4+T細胞比例差異無統計學意義P=0.328)。轉移組患者癌旁組織中CD8+T細胞比例顯著高于非轉移組(P=0.021)。兩組患者外周血中CD8+T細胞比例差異無統計學意義(P=0.362)。轉移組患者外周血CD4+T細胞比例顯著低于非轉移組(P=0.032)。與非轉移組比較，轉移組患者外周血IL-6水平顯著降低(P=0.012)；IL-10水平顯著升高(P=0.006)；TNF-α水平顯著降低(P=0.000)；IFN-γ水平顯著降低(P=0.035)。結論 原發性肝癌患者腫瘤轉移存在明顯的T細胞亞群和細胞因子平衡失調。

原發性肝癌；腫瘤轉移；T細胞亞群；細胞因子；免疫抑制

我國乙型肝炎發生率較高，長期慢性的乙型肝炎病毒感染可導致肝硬化，進而可導致肝癌[1-2]。另外，由于嗜酒人群得不到有效控制，酒精性肝硬化等導致的肝癌也較為常見[3]。目前，肝癌是中老年患者最常見的惡性腫瘤之一，早期即可肝內轉移、肝門轉移、遠處轉移[4-6]。轉移是肝癌患者臨床預后的決定性因素。因此探討原發性肝癌患者腫瘤轉移的相關因素具有十分重要的意義。免疫系統失衡在腫瘤的發生和發展中具有十分重要的臨床意義。目前在其他腫瘤的研究中已證實腫瘤患者存在免疫抑制，主要表現為Th1/Th2細胞功能失衡[7-9]。為探討免疫系統在原發性肝癌患者中的作用，2013年林澤偉等[10]研究發現肝癌組織中、癌旁正常組織和健康肝組織中CD3+CD4+T細胞占浸潤淋巴細胞的比例分別為(22.31±3.68)%、(10.69±2.47)%和(4.21±4.26)%，差異有統計學意義(P=0.000)，而CD3+CD8+T細胞占浸潤淋巴細胞的比例分別為(26.10±5.82)%、(21.82±2.70)%和(41.31±14.01)%，差異有統計學意義(P=0.000)。CD8+T細胞是抗腫瘤免疫反應中重要的效應細胞，受炎性因子刺激可分化成細胞毒性T淋巴細胞，進而介導腫瘤細胞的殺傷作用[11-12]。在肝癌組織中CD8+T細胞水平減低，表明其殺傷作用降低，有利于腫瘤細胞的生長和轉移。而CD4+T細胞可分化為調節性T細胞，介導腫瘤細胞的免疫耐受[13-15]。因此肝癌組織中CD4+和CD8+T細胞平衡的失調可能參與了肝癌細胞的生長和轉移。上述研究證實了原發性肝癌的發生與免疫抑制相關，但是免疫抑制與肝癌細胞轉移的關系如何，相關研究缺乏。本研究旨在探討原發性肝癌患者腫瘤細胞轉移與T細胞亞群及其細胞因子的關聯性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月至2016年1月前瞻性收集本院收治的原發性肝癌患者，納入標準：(1)原發性肝癌；(2)可獲取手術病理標本；(3)年齡大于或等于18歲且小于或等于65歲；(4)同意參與本研究。排除標準：(1)復發性肝癌；(2)轉移性肝癌；(3)心、腦、肺、腎等臟器功能不全；(4)合并急性或慢性感染；(5)合并其他惡性腫瘤；(6)原發性免疫功能缺陷；(7)血液系統或內分泌系統疾??；(8)甲狀腺功能異常；(9)原發性肝癌多中心發生病灶(各瘤灶相對獨立、周圍包括高分化區域或存在高分化向低分化過渡的區域或多發瘤灶間瘤細胞亞型不同，對于不能區分的肝癌多中心發生病灶和肝內轉移病灶給予排除)；(10)不配合治療。研究期間，根據納入標準和排除標準，共納入原發性肝癌患者97例，根據入院時患者是否發生肝癌轉移，將患者分為轉移組(合并有肝內、肝門或遠處轉移，對于肝內轉移的患者，肝內轉移的診斷要點：肝內多發病灶、瘤灶與門靜脈瘤栓相連、較大瘤灶周圍伴隨多發的衛星病灶或體積較小的實體瘤病灶與體積較大的實體瘤病灶位置接近，組織學特征相似)和非轉移組(肝內單結節病灶，經病理確診為原發性肝癌)，其中轉移組38例，非轉移組59例。轉移組男21例，女17例，年齡35～65歲，平均(51.82±8.92)歲，21例合并肝內轉移，18例合并肝門轉移，7例合并遠處轉移(其中8例為多處轉移)；非轉移組男34例，女25例，年齡37～64歲，平均(50.88±8.12)歲，無患者發生肝內、肝門或遠處轉移。兩組患者的性別和年齡等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究中所有患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會批準。

1.2 數據收集 觀察指標包括肝癌組織中、癌旁組織和外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞，及外周血中白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ)。

1.3 檢測方法 (1)肝癌組織和肝癌旁組織CD4+T細胞和CD8+T細胞：術中留取肝癌組織和肝癌旁組織標本(距離腫瘤組織大于或等于5 cm)，將標本置于培養皿中，使用0.9%的氯化鈉溶液沖洗標本，取新鮮的組織標本，用組織剪將標本剪成1 mm3左右的組織塊，酶消化后用PBS溶液反復沖洗，留取細胞懸液，再低速離心除去細胞團及碎片。使用離心機(2 000 r/min)離心細胞懸液10 min，取細胞沉淀并將其混浴PBS溶液中，使用密度梯度離心法將淋巴細胞分離。PBS溶液再次洗滌淋巴細胞，并在室溫下離心。定容后計入單克隆抗體，室內常溫下反應30 min，60 min內進行流式細胞檢測，儀器：Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。(2)外周血CD4+和CD8+T細胞：抽取患者靜脈血5 mL，留存在乙二胺四乙酸二鈉試管中，加入單克隆抗體后室溫下避光反應30 min后進行流式細胞儀檢測，儀器：Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。(3)外周血中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ：抽取患者靜脈血5 mL，3 000 r/min離心后取上層血清置于-20 ℃的冷柜中保存待檢，使用ELISA法檢測IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ，ELISA試劑盒購自江蘇菲亞生物科技有限公司。

2 結 果

2.1 兩組患者肝癌組織中T細胞亞群分析 與非轉移組相比，轉移組患者肝癌組織中CD4+T細胞比例顯著升高[(24.67±4.82)%vs.(19.83±3.27)%,P=0.002]；CD8+T細胞顯著降低[(20.82±3.08)%vs.(24.76±2.88)%,P=0.015]。

2.2 兩組患者癌旁組織T細胞亞群分析 兩組患者癌旁組織中CD4+T細胞比例差異無統計學意義[(11.99±2.48)%vs.(11.32±1.98)%,P=0.328]。轉移組患者癌旁組織中CD8+T細胞比例顯著高于非轉移組[(18.83±4.25)%vs.(21.45±4.82)%,P=0.021)]。

2.3 外周血中T細胞亞群分析 兩組患者外周血中CD8+T細胞比例差異無統計學意義[(29.33±4.74)%vs.(30.03±3.89)%,P=0.362]。轉移組患者外周血CD4+T細胞比例顯著低于非轉移組[(24.56±3.24)%vs.(28.76±4.12)%,P=0.032)]。

2.4 兩組患者外周血細胞因子水平比較 與非轉移組比較，轉移組患者IL-6水平顯著降低(P=0.012)；IL-10水平顯著升高(P=0.006)；TNF-α水平顯著降低(P=0.000)；IFN-γ顯著降低(P=0.035)。見表1。

表1 兩組患者外周血細胞因子水平比較

3 討 論

免疫系統介導的細胞免疫在機體對抗腫瘤細胞中起到一個關鍵作用。腫瘤組織中淋巴細胞的浸潤有助于限制腫瘤細胞生長及轉移，進而改善患者臨床預后。2016年Sobottka等[16]研究顯示乳腺癌組織中淋巴細胞浸潤有助于降低患者腫瘤細胞轉移風險。同一年Romero等[17]研究同樣證實了淋巴細胞浸潤在非小細胞肺癌中的作用。目前，關于原發性肝癌患者組織中淋巴細胞浸潤情況、癌旁組織中淋巴細胞浸潤情況、外周血中T細胞亞群及其細胞因子變化與腫瘤細胞轉移的關聯性尚不清楚，且相關研究缺乏，因此筆者設計了本研究。CD4+和CD8+T細胞是T淋巴細胞的主要亞群，其水平可以較好地反映患者體內免疫狀態。機體對腫瘤細胞的免疫應答，主要通過CD8+T細胞，可以產生IFN-γ，提高機體對腫瘤細胞的殺傷作用[12,18]。本研究顯示轉移組IFN-γ水平降低，腫瘤組織和癌旁組織中CD8+T細胞水平降低，表明原發性肝癌合并腫瘤細胞轉移的患者對腫瘤細胞的殺傷作用較低，其可能介導了腫瘤細胞的轉移。另外IL-10主要由Th2細胞分泌，可以抑制CD4+T細胞向Th1漂移，進而促進Th1/Th2細胞免疫向Th2免疫漂移，進而介導患者的免疫抑制[19-21]。本研究中轉移組患者IL-10水平升高，表明CD4+T細胞更傾向于向Th2細胞分化，進而促進肝癌細胞的生長和轉移。值得注意的是，本研究顯示轉移組肝癌組織中CD4+T細胞水平升高，而外周血中CD4+T細胞水平下降。腫瘤組織中CD4+T細胞可以在IL-10等炎性因子的作用下，分化為Treg細胞，Treg細胞升高是腫瘤免疫耐受的重要基礎[22-23]。外周血中CD4+T細胞降低，結合其他細胞因子的結果，表明Th1/Th2細胞免疫失衡不僅表現為細胞免疫向Th2漂移，還表現為Th1/Th2細胞免疫能力整體降低。另外，IL-6和TNF-α均是促炎因子。如IL-6由纖維母細胞、單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、上皮細胞等多種炎性細胞產生，刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其免疫功能，其水平降低與免疫抑制有關[24-25]。本研究顯示轉移組患者IL-6和TNF-α水平均降低，從另一方面證實了免疫抑制在原發性肝癌患者轉移中的作用。

綜上所述，原發性肝癌患者腫瘤轉移存在明顯的T細胞亞群和細胞因子平衡失調。

[1]Yamashita T,Nault JC.Stemness of liver cancer:From hepatitis B virus to Wnt activation[J].J Hepatol,2016,65(5):873-875.

[2]Chassagne F,Rojas Rojas T,Bertani S,et al.A 13-year retrospective study on primary liver cancer in cambodia:a strikingly high hepatitis C occurrence among hepatocellular carcinoma cases[J].Oncology,2016,91(2):106-116.

[3]Liang T,Vuppalanchi R,Williams KE,et al.Differential expression of miRNAs in non-tumor liver tissue of patients with hepatocellular cancer due to non-alcoholic steatohepatitis cirrhosis[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2016,12(8):881-889.

[4]Swaid F,Downs D,Rosemurgy AS.A practical approach to liver metastasis from unknown primary cancer:what surgeons need to know[J].Cancer Genet,2016,21(8):3482-3491.

[5]Margonis GA,Buettner S,Sasaki K,et al.The role of liver-directed surgery in patients with hepatic metastasis from primary breast cancer:a multi-institutional analysis[J].HPB (Oxford),2016,18(8):700-705.

[6]Onstenk W,Sieuwerts AM,Mostert B,et al.Molecular characteristics of circulating tumor cells resemble the liver metastasis more closely than the primary tumor in metastatic colorectal cancer[J].Oncotarget,2016,28(12):994-1002.

[7]Nunez C,Lozada-Requena I,Ysmodes T,et al.Immunomodulation of Uncaria tomentosa over dendritic cells,il-12 and profile TH1/TH2/TH17 in breast cancer[J].Rev Peru Med Exp Salud Publica,2015,32(4):643-651.

[8]Kiyomi A,Makita M,Ozeki T,et al.Characterization and clinical implication of Th1/Th2/Th17 cytokines produced from three-dimensionally cultured tumor tissues resected from breast cancer patients[J].Transl Oncol,2015,8(4):318-326.

[9]Ma J,Liu H,Wang X.Effect of ginseng polysaccharides and dendritic cells on the balance of Th1/Th2 T helper cells in patients with non-small cell lung cancer[J].J Tradit Chin Med,2014,34(6):641-645.

[10]林澤偉,駱必偉,袁曉東,等.原發性肝癌患者腫瘤浸潤T淋巴細胞亞群分析[J].中國現代普通外科進展,2013,16(07):523-526.

[11]Huang J,Xiao L,Gong X,et al.Cytokine-like molecule CCDC134 contributes to CD8+T-cell effector functions in cancer immunotherapy[J].Cancer Res,2014,74(20):5734-5745.

[12]Yuan CH,Yang XQ,Zhu CL,et al.Interleukin-7 enhances the in vivo anti-tumor activity of tumor-reactive CD8+T cells with induction of IFN-gamma in a murine breast cancer model[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(1):265-271.

[13]鐘武，江志遠，鐘世彪,等.結直腸腫瘤組織中LAP+CD4+T淋巴細胞的表型特征分析[J].中華腫瘤雜志,2016,38(8):596-601.

[14]Valmori D,Ayyoub M.CD4+T helper cell responses to NY-ESO-1 tumor antigen in ovarian cancer resist perversion into immunosuppressive Tregs[J].Oncoimmunology,2015,4(12):946-952.

[15]Razmkhah M,Abedi N,Hosseini A,et al.Induction of T regulatory subsets from naive CD4+T cells after exposure to breast cancer adipose derived stem cells[J].Iran J Immunol,2015,12(1):1-15.

[16]Sobottka B,Pestalozzi B,Fink D,et al.Similar lymphocytic infiltration pattern in primary breast cancer and their corresponding distant metastases[J].Oncoimmunology,2016,5(6):208-215.

[17]Romero VL.Tumor lymphocytic infiltration in non-small cell lung cancer:the ultimate prognostic marker?[J].Transl Lung Cancer Res,2016,5(4):370-372.

[18]Mumm JB,Oft M.Pegylated IL-10 induces cancer immunity:the surprising role of IL-10 as a potent inducer of IFN-gamma-mediated CD8+T cell cytotoxicity[J].Bioessays,2013,35(7):623-631.

[19]Xue H,Lin F,Tan H,et al.Overrepresentation of IL-10-expressing B cells suppresses cytotoxic CD4+T cell activity in HBV-induced hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2016,11(5):4815-4821.

[20]Zhou X,Su YX,Lao XM,et al.CD19+IL-10+regulatory B cells affect survival of tongue squamous cell carcinoma patients and induce resting CD4+T cells to CD4+Foxp3+regulatory T cells[J].Oral Oncol,2016,53(4):27-35.

[21]Wang L,Liu JQ,Talebian F,et al.IL-10 enhances CTL-mediated tumor rejection by inhibiting highly suppressive CD4+T cells and promoting CTL persistence in a murine model of plasmacytoma[J].Oncoimmunology,2015,4(7):232-239.

[22]Ayyoub M,Pignon P,Classe JM,et al.CD4+T effectors specific for the tumor antigen NY-ESO-1 are highly enriched at ovarian cancer sites and coexist with,but are distinct from,tumor-associated Treg[J].Cancer Immunol Res,2013,1(5):303-308.

[23]Mandapathil M,Szczepanski M,Harasymczuk M,et al.CD26 expression and adenosine deaminase activity in regulatory T cells (Treg) and CD4+T effector cells in patients with head and neck squamous cell carcinoma[J].Oncoimmunology,2012,1(5):659-669.

[24]Ohno Y,Kitamura H,Takahashi N,et al.IL-6 down-regulates HLA class II expression and IL-12 production of human dendritic cells to impair activation of antigen-specific CD4+T cells[J].Cancer Immunol Immunother,2016,65(2):193-204.

[25]Narita Y,Kitamura H,Wakita D,et al.The key role of IL-6-arginase cascade for inducing dendritic cell-dependent CD4+T cell dysfunction in tumor-bearing mice[J].J Immunol,2013,190(2):812-820.

Relationship between tumor metastasis with T cell subsets and cytokines in patients with primary hepatocellular carcinoma

HuConggang,TangGuojun,WangJianjun,TongQin

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,JinhuaGuangfuHospital,Jinhua,Zhejiang321000,China)

Objective To investigate the correlation between tumor metastasis with T cell subsets and cytokines in the patients with primary hepatocellular carcinoma(HCC).Methods Ninety-seven cases of primary HCC were prospectively collected from January 2014 to January 2016 and assigned into the metastasis group (38 cases) and non-metastasis group(59 cases) according to whether suffering from metastasis.Surgical specimens were obtained from all patients and flow cytometry was used to detect the CD4+,CD8+T cell proportion in HCC tissue,paracancerous tissues and peripheral blood.Moreover,ELISA was adopted to detect the peripheral blood IL-6,IL-10,TNF-α and IFN-γ levels.Results Compared with the non-metastasis group,the CD4+T cell proportion of HCC tissue in the metastasis group was significantly increased(P=0.02),while the CD8+T cells were significantly decreased (P=0.015).There was no statistical difference in CD4+T cells proportion in the paracancerous tissue between the two groups (P=0.328).However the CD8+T cells proportion of paracancerous tissue in the metastasis group was significantly higher than that in the non-metastasis group (P=0.021).There was no statistically significant difference in the proportion of CD8+T cells in peripheral blood of the two groups (P=0.362).The proportion of CD4+T cells in peripheral blood of the metastatic group was significantly lower than that in non-metastasis group (P=0.032).When compared with non-metastasis group,the metastasis group got a decreased level of peripheral blood IL-6 (P=0.012);while the IL-10 level was significantly increased (P=0.006);the TNF-α level and IFN-γ level were significantly decreased(P=0.000,P=0.035).Conclusion The patients with primary HCC have obvious T cell subsets and cytokines imbalance.

primary liver cancer;tumor metastasis;T cell subsets;cytokines;immune suppression

胡叢崗(1977-)，本科，主治醫師，主要從事腫瘤外科工作。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.017

R735.7

A

1671-8348(2017)16-2215-03

2017-01-30

2017-04-04)

論著·臨床研究