N端9個谷氨酸或7個天冬氨酸顯著增強普魯蘭酶在大腸桿菌中表達分泌

栗亞美， 安展飛， 陳阿娜， 楊艷坤， 白仲虎

(1． 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122； 2． 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3．江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

N端9個谷氨酸或7個天冬氨酸顯著增強普魯蘭酶在大腸桿菌中表達分泌

栗亞美1,2,3， 安展飛1,2,3， 陳阿娜1,2,3， 楊艷坤1,2,3， 白仲虎1,2,3

(1． 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122； 2． 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3．江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

各種標簽被廣泛應用于大腸桿菌分泌表達異源蛋白，其中最簡單有效地便是氨基酸標簽，尤其是帶電荷氨基酸標簽。為了研究N端添加不同種類和數目的帶電荷氨基酸標簽對普魯蘭酶(pullulanase,BaPul13A)在大腸桿菌中表達分泌水平的影響，構建了25株BaPul13A變體。實驗結果表明：N端添加9個連續的谷氨酸標簽，降低了mRNA的轉錄水平，增加了N端mRNA的穩定性，使得普魯蘭酶總酶活達到179.60 U/mL，比不添加氨基酸標簽的對照菌高278.28%。N端添加7個連續的天冬氨酸標簽，增強了大腸桿菌細胞內膜通透性，大量的普魯蘭酶，48.18 U/mL，分泌到培養基中。通過蛋白質結構預測軟件I-TASSER分析得知，N端添加不同帶電荷氨基酸標簽引起CBM41結構域發生變化，猜測該變化是導致BaPul13A變體表達分泌水平差異的主要原因。

帶電荷氨基酸標簽；表達分泌；mRNA；膜通透性；蛋白結構預測

大腸桿菌，因其豐富而配套的載體和菌株系統，以及內在的蛋白分泌系統，被稱為一類完美的宿主[1-2]。在大腸桿菌中，蛋白質通過氨基酸末端信號序列的引導，穿過細胞質膜進入周質空間或者胞外[3]，無論是在N端或是C端，序列的改變都會引起異源蛋白表達分泌水平的差異[4-7]。Kim等[1]提到N端添加5個連續的天冬氨酸標簽能夠促進脂肪酶B分泌，上清脂肪酶B產量達到65 U/mL，Kato 等[8]在牛胰蛋白酶抑制劑變體(BPTI-22) C端添加了5個賴氨酸標簽后，可溶性產量提高了6.2倍，而Yamane 等[9]證明，在信號肽后面引入堿性氨基酸殘基會抑制蛋白轉運。

Bacillusacidopullulyticus酸性普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶(BaPul13A)，是一種專一性切割 α-1,6糖苷鍵的淀粉脫支酶，在工業上，與專一性切割 α-1,4糖苷鍵的淀粉酶共同作用，完成淀粉分解過程[10-12]。目前，工業化的BaPul13A是在地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis中進行可溶性表達和分泌的[10]。由于BaPul13A蛋白分子質量大，在大腸桿菌中很難實現大量可溶性表達甚至分泌。而一些傳統的可溶蛋白載體[8]如麥芽糖結合蛋白(MBP)[13]和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)[14]，分子量較大甚至會破壞目的蛋白的結構和功能。氨基酸標簽(SEP-tags, 可溶性增強標簽)分子質量小，同時也能起到提高目的蛋白可溶性和分泌性的效果，甚至在目的蛋白未折疊時就會發揮作用[8]。所以氨基酸標簽是用來可溶性表達和分泌大分子蛋白最合適的選擇。

目前國內關于氨基酸標簽的研究很少，主要集中在組氨酸標簽上[15]，并且對不同氨基酸標簽對普魯蘭酶表達和分泌的差異影響不甚了解，同時對造成這種差異的原因也沒有進行過探究。同時，本實驗室前期運用許多傳統方法[10]，都沒有實現普魯蘭酶的高效表達和大量分泌。據此，本文通過構建一系列N端帶有不同帶電荷氨基酸標簽的普魯蘭酶變體菌株，研究N端氨基酸標簽對普魯蘭酶表達和分泌的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli) BL21(DE3)用于普魯蘭酶表達。酸性普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶基因(Accession No.Ax203843.1) (pul13A)由上海Invitrogen合成。載體pET28a(+)-pelB-pul13A，含有信號肽基因pelB和普魯蘭酶基因pul13A，由本實驗室構建。

1.2 基因操作

通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增合成N端帶有不同帶電荷氨基酸標簽的普魯蘭酶基因。以pET28a(+)-pelB-pul13A為模板，正反向引物通過特別設計并且都含有特定的DNA限制性內切酶酶切位點。為了保證限制性內切酶識別序列(NcoI: CCATGG)恰恰在載體pET28a(+)-pelB-pul13A的pelB信號肽后面并且避免移碼，我們在正向引物內切酶識別序列后添加了兩個密碼子CC變成CCATGGCC，因此正向引物編碼的氨基酸都含有丙氨酸。在每個PCR反應中反向引物pul13A+XhoI (5′-CCGCTCGAGTTATTGTTTGAGAATAAGCGTACTTATAGC-3′)均相同。比如，利用正向引物(5′-CATGCCATGGCCGATGATTCTACTTCGACTAAAGTTATTGTTC-3′)和反向引物pul13A+XhoI可以擴增出N端帶一個天冬氨酸標簽的重組普魯蘭酶基因。然后，將PCR產物和載體用NcoI和XhoI消化，T4 DNA 連接酶連接，轉化BL21(DE3)感受態。轉化子進行酶切和測序驗證后用于后期發酵實驗。重組菌株名稱，PCR引物及添加的氨基酸標簽如表1。

表1 N端添加標簽類型及其對應的PCR引物

( )n代表括號內的元素重復n次；丙氨酸：Ala或A；天冬氨酸：Asp或 D；谷氨酸：Glu或E；組氨酸：His或H；精氨酸：Arg或R；賴氨酸：Lys或K

1.3 培養基和培養條件

N端帶有不同帶電荷氨基酸標簽的BaPul13A變體菌BL21(DE3)于-80℃保存在25%甘油中，用添加了50 μg/mL卡那霉素的LB培養基(5 g/L 酵母提取物, 10 g/L 蛋白胨, 10 g/L NaCl) 37℃，230 r/min過夜培養活化?；罨越KD600 nm=0.05轉接到新鮮的含有50 μg/mL卡那霉素的TB/SB培養基(12 g/L 蛋白胨, 24 g/L 酵母提取物, 2.31 g/L KH2PO4, 12.55 g/L K2HPO4；3H2O, 10 g/L glycerol, pH=7.0)中，37℃，230 r/min培養5 h后，添加0.1 mol/L IPTG，改變培養溫度為20℃、230 r/min培養20 h收獲，用于酶活測定和SDS-PAGE。

1.4 細胞分級處理

取發酵液，12 000 r/min離心10 min，上清代表胞外可溶組分(ESF)。周質空間組分通過滲透沖擊法獲得[16]。菌體沉淀經50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH=9.0)洗滌2次，然后加入等體積的OS緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl、 20% 蔗糖、1 mmol/L EDTA、pH=8.0)，室溫緩慢攪拌10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清定義為OS組分(OSIF)，沉淀加入等體積冰凍的5 mmol/L MgSO4，冰上緩慢攪拌10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清即為OS組分(OSIIF)。沉淀溶解在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH=9.0)中，超聲破碎(功率20%，超聲2 s，停2 s，20 min)，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清即為胞內可溶組分(ISF)。分離的所有組分保存在-80℃。

1.5 普魯蘭酶活的測定

通過DNS法[17]測定普魯蘭酶酶活，原理是DNS和還原糖(由普魯蘭酶分解普魯蘭多糖產生)的氧化還原反應，0.1 mL粗酶液(上清組分或周質空間組分)加入到含有0.2 mL 1%普魯蘭糖的100 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液的EP管內，混勻，60℃水浴10 min，迅速加入0.45 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)，沸水浴10 min，于冰上冷卻后稀釋20倍測定D540 nm吸光度，并根據標準曲線，計算出酶活。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原碳水化合物的毫克數，其還原力相當于產生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.6 生物信息學工具

為了研究N端含有不同帶電荷氨基酸標簽的BaPul13A的二級結構變化，我們用軟件Iterative Threading ASSEmbly Refinement (I-TASSER)進行預測[18]，鏈接是http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/。為了計算N端mRNA最小自由能，我們用軟件hybrid-ss-min program進行預測[19]，鏈接是http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3。

1.7 熒光定量PCR

新鮮的菌體沉淀用RNA提取試劑盒(Tiangen, China)提取RNA。提取的RNA用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,China)進行反轉錄。定量PCR體系按照SYBRPremixEXTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, China)試劑盒說明書配制。用來檢測普魯蘭酶基因的引物(the forward primer: 5′-CGCGATTTTTCGATTGATGCTA-3′, the reverse primer: 5′-GCTGTTCCTTCTGGAGTTGTGGC-3′) ，以及內參基因16 sRNA引物(the forward primer: 5′-TCGGGAACCGTGAGACAGG-3′, the reverse primer: 5′-CGGACTACGACGCACTTTATGAG-3′)均由蘇州金唯智公司合成。所用儀器是Applied Biosystems(USA)。

1.8 細胞內外膜通透性的測定

細胞內外膜通透性的測定方法根據文獻[20]并作適當調整：12 000 r/min 5 min離心收集菌體，用PBS洗滌2次，固定終D600 nm=0.5。取經過上述處理的新鮮菌液200 μL，于96孔板中加入1.1 g/L鄰硝基苯β-D-半乳糖苷(ONPG) 20 μL或頭孢硝噻吩(Nitrocefin) 20 μL，利用酶標儀檢測D420 nm或者D500 nm變化來表示內膜或外膜通透性的改變。

2 結果和討論

2.1 N端不同帶電荷氨基酸標簽的普魯蘭酶變體菌株的構建

為了分析N端帶電荷氨基酸標簽對BaPul13A表達分泌的影響，我們構建了25株普魯蘭酶變體菌株。包含2個負電荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)，3個正電荷氨基酸(組氨酸、精氨酸、賴氨酸)及其不同數目的組合。比如，L1(L6、L11、L16和L21)菌株是N端帶有1個Glu (1Asp、1His、1Arg和1Lys)標簽的普魯蘭酶變體菌株。L2 (L7、L12、L17和L22)菌株是N端帶有3個Glu(3Asp、3His、3Arg及3Lys)標簽的普魯蘭酶變體菌株。L3 (L8、L13、L18和L23)菌株是N端帶有5個Glu(5Asp、5His、5Arg及5Lys)標簽的普魯蘭酶變體菌株。L4 (L9、L14、L19和L24) 菌株是N端帶有7個Glu (7Asp、7His、7Arg及7Lys)標簽的普魯蘭酶變體菌株。L5 (L10、L15、L20和L25)菌株是N端帶有9個Glu (9Asp、9His、9Arg及9Lys)標簽的普魯蘭酶變體菌株。由于丙氨酸是生物化學和結構上的中性氨基酸[21]，為了避免移碼，在起始密碼子ATG后面添加了CC，所以GCC恰好在pelB信號肽和pul13A普魯蘭酶基因起始位點之間。為了實現普魯蘭酶更好地表達分泌并且能夠通過T7 promoter和Lac operator控制本底表達，PCR所用模板是來自于載體pET28a(+) 和pET22b(+)-pelB-Pul13A 經BglII和XhoI雙酶切連接后構建的pET28a(+)-pelB-pul13A。

圖1 25株變體菌及對照菌發酵后表達提高量(a)和分泌量(b)

2.2 帶電荷氨基酸標簽對普魯蘭酶BaPul13A表達分泌的影響

為了系統地研究N端不同帶電荷氨基酸的添加對普魯蘭酶表達和分泌水平的影響，我們采用相同的培養和操作方法處理25株普魯蘭酶變體菌株及不添加氨基酸標簽的對照菌株。各組分酶活(表2)和SDS-PAGE(圖2)如下：

圖2 不同帶電荷氨基端重組普魯蘭酶SDS-PAGE分析

所有數據均重復3次且平均值的標準差小于5%。ESF代表胞外組分酶活，OSIF代表周質空間OSI酶活，OSIIF代表周質空間OSII酶活，ISF代表胞內酶活，TEA代表總酶，TAE/D600 nm代表比酶活。TAE等于ESF、OSIF、OSIIF、ISF之和；表達提高量等于該菌比酶活與對照菌比酶活之差再除以對照比酶活的值；分泌量等于胞外酶活(ESF、OSIF、OSIIF三者之和)與總酶活的比值由表2可知，普魯蘭酶N端添加不同類型和長度的帶電荷氨基酸標簽會對普魯蘭酶變體菌株的生長，可溶性表達以及分泌表達都會產生不同程度的影響，促進或抑制。以D600 nm為例，除了少數幾個菌株(L2、L6、L7、L9、L10和L13)的生長受到抑制，大部分都有促進作用。

對比表2和圖2可知，目的蛋白分子質量約為105.4 ku，各組分酶活的檢測數據與SDS-PAGE一致。

就表達量而言(表2)，對照菌帶有pelB信號肽但是N端沒有帶電荷氨基酸標簽，普魯蘭酶表達量為53.82 U/mL。并且，只要添加合適數量的不同帶電荷氨基酸都會對普魯蘭酶表達量的提高有所幫助。N端帶有5個天冬氨酸標簽(5D-pul13A)的L3菌株表達量較對照提高了188.46%，N端帶有7個組氨酸標簽(7H-pul13A)的L14菌株表達量較對照提高了92.60%，N端帶有1個精氨酸標簽(1R-pul13A)的L16菌株表達量較對照提高了169.15%，N端帶有5個賴氨酸標簽(5K-pul13A)的L23菌株表達量較對照提高了118.53%，此外N端帶有9個谷氨酸標簽(9E-pul13A)的L10菌株表達量較對照提高了278.78%，并且表達量為最高，179.60 U/mL。在所有的變體菌株中，N端添加負電荷氨基酸標簽(酸性氨基酸標簽)的BaPul13A變體，除了L8表達量與對照相近以及L1、L5明顯低于對照外，其他菌株，包括N端帶有E、3E、7E、3D、5D和7D，都對普魯蘭酶可溶性表達起到一定的促進作用，分別提高235.41%、225.18%、158.89%、84.25%、188.46%和10.77%。添加正電荷氨基酸標簽(堿性氨基酸標簽)的BaPul13A變體中，7H-BaPul13A的表達量提高到125.30 U/mL，比酶活是8.84 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達量提高92.60%；1R-BaPul13A、5R-BaPul13A 的表達量分別提高到142.28 U/mL、110.89 U/mL，比酶活是12.35 U/mL/D600 nm、6.46 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達量高169.15%、40.76%；3K-BaPul13A和5K-BaPul13A的表達量分別提高到110.82 U/mL和120.54 U/mL，比酶活是6.25 U/mL/D600 nm和10.03 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達量高36.7%和118.35%，其他的BaPul13A變體表達量均下降，甚至有些菌株檢測不到酶活。

就分泌量而言，由圖1、圖2和表2可知，對照菌表達的普魯蘭酶基本上無分泌。很明顯，N端7D的L4實現了普魯蘭酶胞外大量分泌，胞外和周質空間總酶活達到50.07 U/mL，其中上清酶活為48.18 U/mL，分泌蛋白占總蛋白72.30%。其他菌株對普魯蘭酶分泌沒有產生明顯的影響。有研究表明，正電荷氨基酸殘基，在信號肽疏水結構域之前，對蛋白通過細胞質膜的轉運起促進作用，在信號肽疏水結構域之后，對蛋白通過細胞質膜的轉運起抑制作用[9]。并且有人提出，多聚賴氨酸會影響蛋白通過SecYEG的轉運時間和效率，隨著多聚賴氨酸數目增多，相應的轉運時間會增加，轉運效率會降低[23-24]。有一種猜想認為，磷脂雙分子層會抑制N端帶正電荷氨基酸的蛋白通過，因為信號肽通過電化學梯度引導蛋白過膜，N端正電荷氨基酸影響電化學梯度，進而抑制轉運[25-26]。

2.3 N端氨基酸標簽對pul13A mRNA 和BaPul13A變體菌株細胞膜通透性影響

2.3.1 N端氨基酸標簽對pul13A mRNA 轉錄水平和N端mRNA穩定性影響

在所有的變體中，選取了表達量相對較高的5個菌株(L3、L10、L14、L16和L23)進行了熒光定量PCR測定如表3。通過兩步法測定pul13A轉錄水平，重復3次。標準曲線用來檢測引物可用，以及決定樣品的稀釋倍數。

表3 不同帶電荷氨基端重組普魯蘭酶mRNA分析

其中C作為對照，mRNA相對量為1，其他菌株mRNA相對量均較對照組小。在pul13A mRNA相對量和Pul13A變體比酶活之間存在相反的變化趨勢，pul13A mRNA相對量越低，Pul13A變體比酶活越高。L10，pul13A mRNA相對量最低為0.27，比酶活最高為17.39。同時，L14，pul13A mRNA相對量最高為0.58，比酶活為8.84，比L10比酶活低2倍。產生這種現象的原因可能是，轉錄水平的降低有助于mRNA有足夠的時間轉運和正確折疊，避免形成大量包涵體。

N端mRNA的穩定性也會影響轉錄和mRNA的量，進而影響表達翻譯。我們采用在線預測軟件，hybrid-ss-min program，預測N端最小自由能。N端預測序列包含pelB序列，添加的帶電荷氨基酸標簽序列以及從起始密碼子開始的前20個氨基酸序列。預測值越負代表N端mRNA越穩定性。對比得知，帶負電荷氨基酸標簽的L3和L10，最小自由能較負，N端mRNA較其他菌株穩定。帶正電荷氨基酸標簽的L14、L16和L10，最小自由能與不帶氨基酸標簽的C菌基本一致。

2.3.2 N端氨基酸標簽對BaPul13A變體菌株細胞內外膜通透性影響

帶電荷氨基酸標簽會影響異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達和分泌[2]。一方面，在成熟序列前端兩個正電荷氨基酸的存在會顯著影響蛋白轉運[9]；另一方面，N端高密度的負電荷能誘導更多的D5-CalB蛋白從細胞質到周質空間的轉運，并使外膜無序[1]。為了揭示L4菌株中7D-BaPul13A如何高效分泌到培養基中，我們檢測了L4菌株和對照菌細胞內外膜通透性。如圖3，L4內膜通透性較對照呈現出明顯地增長趨勢，但是外膜通透性較對照沒有明顯的變化。因此，我們認為N端負電荷氨基酸標簽通過增加內膜通透性能有效幫助蛋白轉運。但是，在周質空間折疊好的7D-Pul13A通過一些未知的與外膜的相互作用幫助其有效分泌，而非僅僅通過增加外膜通透性。

圖3 大腸桿菌細胞內(a)、外膜(b)通透性

■ 代表L4；●代表對照菌

3 討論

很明顯，N端或C端不同類型或長度的氨基酸對表達和分泌產生不同的影響[27-28]，但是，我們發現，在氨基酸的選擇上還是存在一定的規律可循。比如，N端7個天冬氨酸能有效增強7D-BaPul13A的分泌，同時Kim等[1]也提到，N端5個天冬氨酸標簽保證脂肪酶B胞外產量達到65 U/mL。因此可以通過生物信息學工具設計一個系統的實驗進行相應的數據分析，從而發現內在規律，指導我們選擇合適的氨基酸實現高效表達和分泌。

為了進一步闡明25株變體表達分泌差異機制，我們用I-TASSER(Iterative Threading ASSEmbly Refinement)，一種通過按等級劃分的方法預測蛋白結構和功能的原件，對BaPul13A變體蛋白結構進行預測。Turkenburg等已經得到了Pul13A的晶體結構，由于CBM41結構域處于無序狀態，所以晶體結構上并沒有CBM41結構域[12]。而我們的氨基酸標簽添加在N端，因此我們采用蛋白預測軟件I-TASSER方法，預測了包含CBM41在內的所有結構域(CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH48)；采用Discovery Studio Client進行蛋白預測結構分析。

圖4 Pul13A變體蛋白結構(a)及CBM41結構域(b)預測結果

對照菌及25株變體菌普魯蘭酶3D二級結構圖見圖4-a，顯示除了CBM41結構域外，BaPul13A變體其他結構域與晶體結構域一致；從對照菌及25株變體菌普魯蘭酶放大后的CBM41結構域可以看出，變體菌中α-螺旋、β-折疊數目以及無規則卷曲均發生變化(圖4-b)。不同的氨基酸標簽可以與CBM41結構域相互作用，進而造成CBM41結構域的改變。這和本實驗室以前的研究結果相一致：CBM41結構域的缺失使得普魯蘭酶酶活大約提高了50倍。因此，CBM41的缺失或改變均會引起分泌表達差異。

N端氨基酸標簽不僅僅會增強表達和分泌，還有很多其他的用途。氨基酸標簽，一種可溶性增強標簽(SETs)，通過克服可溶性和穩定性問題，使得蛋白符合核磁共振技術要求[29]。而且通過氨基酸標簽，而不單是組氨酸標簽，可以開發一種新型的過量表達和分泌的載體[30]。

[1]KIM S K, PARK Y C, LEE H H, et al. Simple amino acid tags improve both expression and secretion of Candida antarctica lipase B in recombinantEscherichiacoli[J]. Biotechnology & Bioengineering, 2015, 112(2) : 346-355.

[2]JUNG H J, KIM S K, MIN W K, et al. Polycationic amino acid tags enhance soluble expression of Candida antarctica lipase B in recombinantEscherichiacoli[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2011, 34(7) : 833-839.

[3]KAJAVA A V, SERGEY N Z, AMDREY E K, et al. The net charge of the first 18 residues of the mature sequence affects protein translocation across the cytoplasmic membrane of gram-negative bacteria [J]. Journal of Bacteriology, 2000, 182(8) : 2163-2169.

[4]KOBAYASHI T, MIWA S, HIROFUMI N, et al. Short peptide tags increase the yield of C-terminally labeled protein [J]. Biotechnol Lett, 2007, 29(7) : 1065-1073.

[5]XU C G, FAN X J, FU Y J, et al. Effect of location of the His-tag on the production of soluble and functionalButhusmartensiiKarschinsect toxin [J]. Protein Expr Purif, 2008, 59(1) : 103-109.

[7]WOESTENENK E A, HAMMARSTR?M M, VAN DEN B S, et al. His tag effect on solubility of human proteins produced inEscherichiacoli: a comparison between four expression vectors[J]. J Struct Funct Genomics, 2004, 5(3): 217-229.

[8]KATO A, MAKI K, EBINA T, et al. Mutational analysis of protein solubility enhancement using short peptide tags [J]. Biopolymers, 2007, 85(1) : 12-18.

[9]YAMANE K, MIZUSHIMA S. Introduction of basic amino acid residues after the signal peptide inhibits protein translocation across the cytoplasmic membrane ofEscherichiacoli[J]. J Biol Chem, 1988, 263(36) : 19690-19696.

[10]CHEN A, LI Y, LIU X, et al. Soluble expression of pullulanase fromBacillusacidopullulyticusinEscherichiacoliby tightly controlling basal expression[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(12) :1803-1810.

[11]CHEN A, LI Y, NIE J, et al. Protein engineering ofBacillusacidopullulyticuspullulanase for enhanced thermostability using in silico data driven rational design methods [J]. Enzyme Microb Technol, 2015, 78 : 74-83.

[12]TURKENBURG J P, BRZOZOWSKI A M, SVENDSEN A, et al. Structure of a pullulanase fromBacillusacidopullulyticus[J]. Proteins, 2009, 76(2) : 516-519.

[13]DI GUAN C, LI P, RIGGS P D, et al. Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides inEscherichiacoliby fusion to maltose-binding protein [J]. Gene, 1998, 67(1): 21-30.

[14]SMITH D B, JOHNSON K S. Single-step purification of polypeptides expressed inEscherichiacolias fusions with glutathione S-transferase [J]. Gene, 1988, 67(1) : 31-40.

[15]劉英麗, 劉駿明, 王 靜, 等. 栓菌漆酶的異源表達及重組酶碳端和氮端組氨酸標簽修飾對酶學特性的影響 [J]. 食品科學, 2014, 35(21) : 143-148.

[16]NEU H C, HEPPEL L A. Some observations on the "latent” ribonuclease ofEscherichiacoli[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1964, 51 : 1267-1274.

[17]KANG J, PARK K M, CHOI K H, et al. Molecular cloning and biochemical characterization of a heat-stable type I pullulanase fromThermotoganeapolitana[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2011, 48(3): 260 266.

[18]YANG J, YAN R, ROY A, et al. The I-TASSER suite: protein structure and function prediction [J]. Nat Methods, 2015, 12(1): 7-8.

[19]KUDLA G, MURRAY A W, TOLLERVEY D, et al. Coding-sequence determinants of gene expression inEscherichiacoli[J]. Science, 2009, 324(5924): 255-258.

[20]ERIKSSON M, NIELSEN P E, GOOD L. Cell permeabilization and uptake of antisense peptide-peptide nucleic acid (PNA) intoEscherichiacoli[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(9): 7144-7147.

[21]ISLAM M M, KHAN M A, KURODA Y, et al. Analysis of amino acid contributions to protein solubility using short peptide tags fused to a simplified BPTI variant [J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1824(10) : 1144-1150.

[22]LIANG F C, BAGESHWAR U K, MUSSER S M, et al. Position-dependent effects of polylysine on Sec protein transport [J]. J Biol Chem, 2012, 287(16) : 12703-12714.

[23]DU PLESSIS D J, NOUWEN N, DRIESSEN A J. The Sec translocase [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1808(3): 851-865.

[24]PAOLO N, THOMAS B, ARNOLD J M D. Sec-and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-distinct translocases and mechanisms [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1778(9): 1735-1756.

[25]Mickael D, Michel H, Regine D, et al. Secretion and subcellular localizations of bacterical proteins: a semantic awareness issue [J]. Trends in Microbiology, 2009, 17(4) : 139-145.

[26]LORRAINE S M, REMBRANDT JF H, KATRINA T F. Structural insights into the type II secretion nanomachine [J]. Current Opinion in Structural Biology, 2012, 22(2) : 208-216.

[27]BLEVE G, LEZZI C, SPAGNOLO S, et al. Role of the C-terminus ofPleurotuseryngiiEry4 laccase in determining enzyme structure, catalytic properties and stability [J]. Protein Engineering Design & Selection, 2013, 26(1) : 1-13.

[28]TREVINO S R, SCHOLTZ J M, PACE C N. Amino acid contribution to protein solubility: Asp, Glu, and Ser contribute more favorably than the other hydrophilic amino acid in RNasa Sa [J]. J Mol Biol, 2007, 366(2) : 449-460.

[29]ZHOU P, WAGNER G. Overcoming the solubility limit with solubility-enhancement tags: successful applications in biomolecular NMR studies [J]. J Biomol NMR, 2010, 46(1) : 23-31.

[30]ASHRAF S S, BENSON R E, PAYNE E S, et al. A novel muti-affinity tag system to produce high levels of soluble and biotinylated proteins inEscherichiacoli[J]. Protein Expression and Purification, 2004, 33 (2): 238-245.

N-terminal 9-glutamine and 7-aspartate tags significantly increase the expression and secretion of pullulanase from
BacillusacidopullulyticusinEscherichiacoli

LI Ya-mei1,2,3, AN Zhan-fei1,2,3, CHEN A-na1,2,3, YANG Yan-kun1,2,3, BAI Zhong-hu1,2,3

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology; 2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; 3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Various tags, especially charged amino acids, were widely applied in soluble expression and secretion of heterogenous proteins inEscherichiacolirecent years. To know how the charged amino acids types and numbers influent the Pul13A expression and secretion, 25 Pul13A mutants were constructed, which had different N-terminal amino acid tags. Among them, the nine-glutamine tag could decrease the transcription level and increase the N-terminal mRNA stability, and Pul13A′s activity changed to 179.60 U/mL that was 278.28% higher than the control without any amino acid tag. Meanwhile, the N-terminal seven-aspartate tag enhanced the inner membrane permeability, and secreted massive pullulanse into the culture medium ( 48.18 U/mL ). Furthermore, it was found that the CBM41 structural domain was different in different mutants, which maybe mainly result in the differences of the expression and secretion levels.

charged-amino-acid tags; expression and secretory; mRNA; membrane permeability; protein structure prediction

2016-03-30；

2016-04-14

中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助(JUSRP51401A)；863項目(2015AA020802)；973項目(2013CB733602)； 國家自然科學基金項目(31570034)

栗亞美，碩士研究生，主要從事發酵工程研究，E-mail: 1198066405@qq.com

白仲虎，教授，主要從事發酵工程領域科研工作，E-mail: baizhonghu@jiangnan.edu.cn；楊艷坤，副教授，主要從事發酵工程領域科研工作，E-mail: yangyankun@jiangnan.edu.cn

Q78;TQ925

A

2095-1736(2017)03-0011-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.011