板藍根抗氧化成分及抗氧化性能研究

農石生，龔子龍，周金花，喻巧容，黃鎖義，梁凌玲，周世友，7(1.右江民族醫學院 臨床醫學院，廣西 百色 33000；2.廣西崇左市大新縣人民醫院，廣西 大新 32300；3.廣西百色市人民醫院，廣西 百色 33000；4.廣西南寧市上林縣人民醫院，廣西 上林 3000；.廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色 33000；6.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 30001；7.右江民族醫學院 藥學院，廣西 百色 33000)

板藍根抗氧化成分及抗氧化性能研究

農石生1，2，龔子龍1，3，周金花4，5，喻巧容5，6，黃鎖義5，7*，梁凌玲5，周世友5，7
(1.右江民族醫學院 臨床醫學院，廣西 百色 533000；2.廣西崇左市大新縣人民醫院，廣西 大新 532300；3.廣西百色市人民醫院，廣西 百色 533000；4.廣西南寧市上林縣人民醫院，廣西 上林 530500；5.廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色 533000；6.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001；7.右江民族醫學院 藥學院，廣西 百色 533000)

目的：研究板藍根抗氧化成分及抗氧化性能，為板藍根提取物抗衰老、抗腫瘤等領域的開發利用提供科學依據。方法：本文采用系統的分離方法，從板藍根中提取黃酮、多糖、多酚及生物堿四種成分，并采用Schaal 烘箱法、鄰苯三酚法、水楊酸法測定板藍根四種提取物的總抗氧化能力、清除超氧陰離子(O2-·)及清除羥自由基(·OH)能力。結果：板藍根提取物對三種食用油脂均有良好的抗氧化效果，且對抗氧化作用具有劑量效應關系；Vc、檸檬酸及酒石酸對板藍根提取物的抗氧化作用均有協同增效作用；板藍根提取物對超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)有良好的清除作用，且清除作用具有劑量效應關系；其中板藍根提取物生物堿和黃酮分別對超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)清除作用較強。結論：板藍根取物具有良好的抗氧化作用，可將其作為一種天然的抗氧化劑應用于油脂、食品及日用品中；也可將其應用于抗衰老，抗高血脂藥物研究中，進一步開發其藥用價值。

板藍根；總抗氧化能力；超氧陰離子；羥自由基

隨著生活水平的提高，生活節奏的加快，越來越多的現代人步入亞健康，許多現代文明病與人體缺乏抗氧化營養物質有關，而補充抗氧化營養物質則有助于對這些疾病的預防治療。由于抗氧化劑作用的重要性，醫學界已經開始考慮以血液中抗氧化劑的水平來評估人體的健康水平，并利用抗氧化劑進行積極的疾病預防。新近研究發現很多慢性疾病都與自由基和脂質過氧化損傷有關，因而正興起開發天然抗氧化劑如維生素E，維生素A，維生素C和胡蘿卜素、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚類中的茶多酚[1]、原花青素[2]和黃酮類中的槲皮素[3]等來防治冠心病、腦血管疾病和腫瘤等。

板藍根為十字花科菘藍屬植物菘藍(IsantisindigoticaFort.)的干燥根，原產我國，分布于江蘇、浙江、福建、河南、廣西、臺灣等地，全國各地均有栽培。

本品味苦性寒，歸心、肝、胃經。具有清熱、解毒、涼血、利咽之功效。臨床上常用于治療瘟毒發斑、高熱頭痛、大頭瘟疫、爛喉丹疹、疼腮、喉痹、瘡腫、水痘、麻疹、肝炎、流行性感冒等病癥，其主要產品有板藍根顆粒沖劑[4]。

有文獻報道，板藍根中提取分離得到總生物堿具有抗病毒作用[5]，有機酸具有非常明顯的抗內毒素和抗菌作用[6]，板藍根二酮B具有體外抗腫瘤活性[7]，巨噬細胞免疫實驗結果表明板藍根多糖具有顯著的提高免疫活性功能，藥理活性篩選發現水提部位對單純性皰疹病毒有明顯的活性[8]，而沒有其體外抗氧化有效物方面的成分及性能的研究。為此，本研究采用系統分離方法，結合抗氧化性能測定，初步系統分析板藍根中抗氧化有效物的抗氧化效果，以期為板藍根提取物抗衰老、抗腫瘤等領域的開發利用提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

板藍根：購于廣西百色市。油脂樣品：市售豬油、芝麻油及花生油。乙醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、醋酸、氨水、氫氧化鈉、硝酸銀、三氯化鋁、三氯化鐵、碘、碘化鉀、淀粉、抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、鹽酸、丙酮、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、水楊酸、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷。以上試劑均為AR。

722N型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；pHS-3C精密 pH計(上海雷磁儀器廠)；78WH-1型恒溫磁力攪拌器(杭州藍天化驗儀器廠)；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋(上海登實驗設備有限公司)；GN2085型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；ZKJ-1002型循環水真空抽氣泵(上海嘉鵬科技有限公司)；TPL80-2B型離心機(上海安亭科學儀器廠)；ZF-1型三用紫外分析儀(上海寶山順村電光儀器廠)；FZ-102型植物粉碎機(上海勝啟儀表有限公司)。

1.2 板藍根抗氧化成分的提取[9]

1.2.1 黃酮提取

取50 g粗板藍根粉末用350 mL 80%乙醇回流提取3 h，提取液放置過夜，濃縮除去乙醇加水溶解，用乙醚萃取除脂，再用乙酸乙酯萃取，濃縮蒸干得黃色固體0.104 g，為粗黃酮。

1.2.2 多糖提取

將乙酸乙酯萃取的水相加入100 mL丙酮，有黃褐色沉淀生成，離心，分離，放入干燥箱在50 ℃下恒溫干燥，得固體0.268 g，為粗多糖。

1.2.3 生物堿提取

另取50 g粗板藍根粉末加5倍量95%乙醇回流加熱提取2 h，冷濾，渣再加乙醇提取2次，合并提取液，濃縮得膏。于膏中加水，加濃鹽酸調pH=2，加氯仿震蕩除油脂和脂性雜質共3次，分離，氯仿用量均為水的1/3，加氨水調pH=10，再加入其體積1/3量的氯仿，振蕩萃取游離生物堿，分出氯仿層，水層同樣萃取，共萃取3次，合并萃取液，濃縮，蒸干，得淡黃色固體0.647 g，為粗生物堿。

1.2.4 多酚提取

將氯仿萃取的水相，依次加入60 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用磁力攪拌器在80 ℃濃縮，放入干燥箱中干燥，得固體0.158 g。

1.3 抗氧化成分的提取結果

表1 板藍根抗氧化成分的提取結果

注：板藍根總量為50 g。

1.4 提取物的定性試驗[10]

1.4.1 黃酮顯色反應

三氯化鋁反應：取黃酮樣品的乙醇溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干。在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點。

1.4.2 多糖顯色反應

托倫試劑反應：取一支試管，加入2 mL 5%硝酸銀，滴加5% NaOH 2滴使之產生沉淀，然后滴加5%的氨水使沉淀剛好溶解，最后加入少量多糖樣品，搖勻后放入60 ℃水浴鍋水浴5 min。試管壁上附著一層銀白的金屬物，銀鏡反應陽性。

1.4.3 多酚顯色反應

三氯化鐵反應：取多酚樣品的乙醇溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鐵乙醇溶液(加鹽酸少許)，在可見光下呈綠色斑點。

1.4.4 總生物堿顯色反應

碘-碘化鉀試劑反應：取總生物堿樣品的乙醇溶液點在濾紙上，滴加碘-碘化鉀試劑(Wagner試劑)溶液，在可見光下呈棕色斑點。

1.5 板藍根提取物總抗氧化能力的測定

采用Schaal烘箱法[11]，取20 g油樣，放入80 mL燒杯中，敞口，按一定量加入板藍根提取物或抗氧化劑或增效劑，混合均勻，將油樣放入70 ℃恒溫箱中強化保存，定時攪拌，并交換它們在恒溫箱中的位置，24 h后用紫外可見分光光度法[12-13]測定油樣的過氧化值(POV)。

1.5.1 標準曲線的繪制

①碘標準液(1.18 μmol/mL)的配制：精確量取碘固體0.015 g，加濃KI溶液(取1.8 g KI固體溶于2.5 mL蒸餾水中)溶解，用50 mL容量瓶加蒸餾水定容至刻度后，移入棕色容量瓶，密封避光保存備用。②標準曲線的測定：分別取0.1、0.2、0.6、0.7、1.0 mL的碘標準液于50 mL容量瓶中，加5.00 mL氯仿-冰醋酸，1.00 mL 1%淀粉溶液，加水定容至50 mL，搖勻后取上層清液于585 nm處測定其吸光度(1 cm比色皿，蒸餾水為參比)，繪制標準曲線，回歸出碘量-吸光度之間的數學關系，結果見圖1。

圖1 碘-淀粉比色標準曲線

1.5.2 油脂POV的測定

準確稱取燒杯中的待測油樣0.2 g于50 mL容量瓶中，加5.00 mL氯仿-冰醋酸溶解后，加入1.00 mL 10% KI溶液，加蓋搖勻30 s，并置于暗處反應3 min。取出后立即用水稀釋(約40 mL)，加入1.00 mL 1%淀粉溶液，以后操作同標準曲線。根據吸光度和標準曲線計算出碘生成量，并計算油樣的過氧化值(POV)。油樣POV的計算：

1.5.3 板藍根提取物對不同油脂的抗氧化作用

取以無水乙醇為溶劑配成0.02%濃度的板藍根各提取物溶液1 mL，分別加入到溫熱的豬油、芝麻油及花生油中，以后操作同前。其中，以不加板藍根提取物的油脂為對照樣。板藍根提取物對不同油脂的抗氧化作用見表2。結果表明在添加0.02%板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿的3種不同油脂，都比同等條件下未添加的油脂所測定的過氧化值(POV)低，但程度有所差別，且差別程度大小順序均為：豬油>芝麻油>花生油。說明板藍根四種提取物對上述3種油脂均有較好的抗氧化效果，且抗氧化效果的強弱順序均為：豬油>芝麻油>花生油。

表2 板藍根提取物對不同油脂的抗氧化效果

1.5.4 不同添加量的板藍根提取物對豬油的抗氧化效果

取以無水乙醇為溶劑配成0.01%、0.02%、0.05%濃度的板藍根各提取物溶液1 mL，分別加入到溫熱的豬油中，以后操作同前。其中，以不加板藍根提取物的豬油為對照樣。添加不同量的板藍根提取物對豬油的抗氧化效果見表3。結果表明在本實驗劑量范圍內，隨著板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿劑量的增大，豬油的過氧化值越低，板藍根上述四種提取物隨著加入量的增大，其抑制豬油生成氫過氧化物的能力也加強，且板藍根提取物對豬油的抗氧化能力有劑量效應關系。

表3 不同量板藍根提取物對豬油的抗氧化效果

1.5.5 添加增效劑對板藍根提取物抗氧化作用的影響

取以無水乙醇為溶劑配成0.02%濃度的板藍根各提取物溶液1 mL和1 mL 0.02%濃度的Vc、檸檬酸及酒石酸，分別加入到溫熱的豬油中，以后操作同前。其中以不加增效劑僅加板藍根提取物為對照樣。添加增效劑對板藍根提取物抗氧化作用的影響見表4。結果表明，在增效劑的添加劑量為0.02%時，Vc、檸檬酸及酒石酸對板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿的抗氧化作用均有增效作用。

表4 增效劑對板藍根提取物抗氧化效果的影響

1.6 板藍根提取物清除超氧陰離子(O2-·)能力的測定

采用鄰苯三酚法[14]。分別取1 L濃度為0.01%，0.02%，0.05%的板藍根提取物于試管中，加人3 mL pH為8.2的Tris-HCl緩沖液，25 ℃水浴20 min。水浴結束時，各樣品中加人7 mmo1/L的鄰苯三酚溶液，反應4 min后加人28 μL 10 mol/L的鹽酸終止反應，以Tris-HCl緩沖液調零在420 nm處測吸光度值，根據抑制率判斷樣品對清除的能力。抑制率的計算：

抑制率=[A對照-(A樣品-A樣品空白)/A對照×100%

式中：A對照為不加樣品的反應體系；A樣品為加人樣品的反應體系；A樣品空白為不加鄰苯三酚的反應體系。

板藍根提取物清除超氧陰離子(O2-·)能力測定的結果見表5。結果表明在本實驗劑量范圍內，隨著板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿劑量的增大，對超氧陰離子(O2-·)的清除率越高，且上述四種提取物對超氧陰離子(O2-·)清除的能力有劑量效應關系。其中，板藍根總生物堿對對超氧陰離子(O2-·)的清除作用最強。

表5 板藍根提取物清除超氧陰離子(O2-·)能力測定

1.7 板藍根提取物清除羥自由基(·OH)能力的測定

采用水楊酸法[15]，分別取1 L濃度為0.01%、0.02%、0.05%的板藍根提取物于試管中，加人8.8 mmol/L H2O21 mL，10 mmoL FeSO4，1 mL10 mmol/L水楊酸1 mL。加H2O2啟動反應，37 ℃反應0.5 h，以蒸餾水作參比，在510 nm下測吸光度。清除率計算：

清除率=[(A0-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0對照液的吸光度；A1為加人樣品后的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2樣品溶液的吸光度。

板藍根提取物清除羥自由基(·OH)能力測定的結果見表6。結果表明在本實驗劑量范圍內，隨著板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿劑量的增大，對羥自由基(·OH)的清除率越高，且上述四種提取物對羥自由基(·OH)清除的能力有劑量效應關系。其中，板藍根黃酮對羥自由基(·OH)的清除作用最強。

表6 板藍根提取物清除羥自由基(·OH)能力測定

2 結 論

板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿對三種食用油脂均有良好的抗氧化效果，抗氧化效果的強弱順序均為：豬油>芝麻油>花生油，且板藍根提取物對豬油的抗氧化能力有劑量效應關系，表明板藍根提取物可以作為油脂的抗氧化劑，保持或提高油脂使用價值和長期存貯的目的。油脂的氧化分為自氧化、光氧化、酶催化氧化及金屬催化氧化四種情況，抗氧化劑的抗氧化機理主要有以下四種：清除自氧化過程中的自由基，清除活性氧分子，與油脂中氧氣結合延緩氧化及螯合金屬離子[16]。板藍根提取物對油脂抗氧化作用機理與提取物的結構有關，多酚和黃酮類物質，多為含有酚羥基的化合物，能夠提供活潑的氫質子，有效地清除氧自由基，預防脂質過氧化的啟動，其次，與過氧化自由基結合成穩定的化合物，阻止了氧化過程中鏈鎖反應的傳播[12]；生物堿是一類大多具有復雜含氮環狀結構、顯著生理活性的有機化合物，其可通過與1O2碰撞，本身獲得能量而使1O2失活轉變為3O2，即與油脂中氧氣結合延緩氧化，從而起到抗氧化的作用，其中，影響生物堿抗氧化活性的結構因素主要是立體結構和電性因素，雜環中氮原子越“裸露”在外有利于充分地接近活性氧并與之反應，抗氧化效果就越好，供電子基團或者能使氮原子富有電子的結構因素也可增加其抗氧化活性[17-18]；而多糖可以捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的ROS，減少脂質過氧化反應鏈長度，因此可以阻斷或減緩脂質過氧化的進行，對于·OH 而言，可快速地攫取多糖碳氫鏈上的氫原子結合成水，而多糖的碳原子上則留下一個成單電子，成為碳自由基，進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產物，對于O2-·多糖可與其發生氧化反應，達到清除的目的[19]。

維生素C、檸檬酸及有機酸在添加量為0.02%時，對板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿的抗氧化具有協同增效作用。之所以具有以上增效作用，可能是油脂中添加增效劑，使上述四種提取物處于微酸環境，有利于其穩定；另一方面油脂中存在的某些金屬離子如Cu離子、Fe離子、Mn離子、Ni離子等對油脂氧化具有催化作用，加入維生素C、檸檬酸、酒石酸等增效劑可以將金屬離子螯合，消除了金屬離子影響，因此增效劑具有良好的抗氧化增效作用，可在很大程度上延長油脂的儲存期，延長上述四種提取物發揮抗氧化作用的[20]。而且，從經濟方面考慮這種復配還可以極大的降低成本，所以使用上述四種提取物作抗氧化劑時，添加有機酸增強上述四種提取物的抗氧化作用具有可行性。

板藍根提取物黃酮、多糖、多酚及總生物堿對超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)有良好的清除作用，且上述四種提取物的清除能力有劑量效應關系。其中，板藍根提取物生物堿和黃酮分別對超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)清除作用較強，板藍根總生物堿對對超氧陰離子(O2-·)的清除作用較強。自由基是帶有未成對電子的分子或離子，具有很高的反應活性。它可對機體產生毒害，破壞生物大分子，影響細胞活性，主要損害細胞膜包括血管內皮細胞膜及細微結構，并引起一系列有害的生化反應?，F已明確自由基與許多病理生理現象都有密切的關系，如衰老、腫瘤、炎癥、突變、心腦缺血、動脈粥樣硬化、帕金森病等[21]，而板藍根提取物對超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)有良好的清除能力，因此可將其應用于抗衰老，抗高血脂藥物研究中，進一步開發其藥用價值。

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Analysis of Antioxidant Components and Properties of Radix Isatidis

Nong Shisheng1，2，Gong Zilong1，3，Zhou Jinhua4，5，Yu Qiaorong5，6，Huang Suoyi5，7*，Liang Lingling5，Zhou Shiyou5，7

Objective：Study on the antioxidant properties and antioxidant activity of Radix Isatidis to provide the scientific basis for its development in anti-aging and anti-tumor areas. Method：By systematic separation，flavonoids，polysaccharides，polyphenol，and alkaloids of Radix Isatidis were extracted and Schaal oven- storage method，pyrrogallol autoxidation method and salicylic acid method were adopted respectively to determine the four extracts' total antioxidant capacity，scavenging the superoxide anion (O2-·) and hydroxyl radicals (·OH) capacity. Method：Extract of Radix Isatidis had good oxidation resistance to three types of fats，and had a dose-response relationship；vitamin C，citric acid and tartaric acid had synergic action on the extract' antioxidative effect；extract of Radix Isatidis and good scavenging effect on superoxide anion (O2-·) and hydroxyl (·OH) and had a dose-effect relationship；alkaloid and flavone extracts of Radix Isatidis revealed stronger scavenging effects on superoxide anion (O2-·) and the hydroxyl radical (·OH) respectively. Conclusion：Extract of Radix Isatidis has a good antioxidant effect，and can be used as a natural antioxidant in grease，food and daily necessities；it can also be applied to the study of anti-aging and anti-high blood fat drugs to further develop its medicine value.

Radix Isatidis；total antioxidant capacity；superoxide anion；hydroxyl radicals

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.005

2016-10-12

國家中醫藥管理局“十二五”中醫藥重點學科中藥化學建設項目(國中醫藥人教發[2012]32號)；廣西重點學科藥物化學建設項目(桂教科研[2013]16號)；廣西高?？萍紕撔履芰μ嵘こ探ㄔO項目和右江流域特色民族藥研究廣西高校重點實驗室項目(桂教科研〔2014〕14號)；右江民族醫學院2013年度大學生創新訓練計劃立項重點項目(XJACX20l312)。

農石生(1990—)，男，學士。E-mail：2009apq@sina.com

*通訊作者： 黃鎖義(1964—)，男，教授，碩士生導師，主要從事醫用化學的教學和科研工作。研究方向：天然產物化學、藥物化學、食品衛生。E-mail：huangsuoyi@163.com

R284

A

1006-9690(2017)03-0018-05

(1.College of Clinical Medicine，Youjiang Medicine University for Nationalities，Baise 533000，China；2.The People’s Hospital of Daxin in Chongzuo，Daxin 532300，China；3.The People’s Hospital of Baise，Baise 533000，China；4.The People’s Hospital of Shanglin in Nanning，Shanglin 530500，China；5.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley，Baise 533000，China；6.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China；7.College of Pharmacy，Youjiang Medicine University for Nationalities，Baise 533000，China)