益生菌發酵銀杏汁飲料的研究與開發

孫達鋒，張衛明，張鋒倫，朱昌玲，沈嬌嬌(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

益生菌發酵銀杏汁飲料的研究與開發

孫達鋒，張衛明，張鋒倫，朱昌玲，沈嬌嬌
(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

選用銀杏果作為原料，通過植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌進行發酵(其菌種比例為1∶1∶3)。主要研究銀杏汁的發酵液濃度，飲料體系穩定方法以及發酵過程中的參數，如pH，溫度以及活菌數等。通過對益生菌發酵銀杏汁的感官及口感的檢測，發現銀杏果與水的比例為1∶10時最佳。為獲得體系穩定的銀杏汁，加入中溫淀粉酶和中性蛋白酶水解。通過在不同溫度下使用乳酸菌發酵銀杏汁，得到最適宜銀杏汁發酵的溫度為40 ℃，發酵時間10 h，乳酸菌發酵銀杏汁的pH趨于穩定，在3.47左右，初始活菌數為2×106cfu/mL，其最大活菌數為10 h時達到，為4.7×107cfu/mL，得到香味濃郁，質地細膩，酸味適中以及顏色乳黃的益生菌發酵銀杏汁飲料產品。

銀杏果；益生菌；發酵；生產工藝

銀杏果是銀杏科銀杏屬植物的果實。其營養豐富，據報道含淀粉62.4%，蛋白11.3%，脂肪2.6%，蔗糖5.2%，還原糖1.1%，核蛋白0.26%，礦物質3.0%，粗纖維1.2%[1]。銀杏果不僅富含銀杏酸、銀杏酚、銀杏醇、銀杏黃素、銀杏黃酮、蛋白質、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵、鎂、鉀、胡蘿卜素、維生素等，還含有內酯、膽固醇、聚戊醇等有效成分[2]。銀杏果中含有的銀杏黃酮具有清除自由基的功能，延緩癌細胞的生長，還能夠舒張血管平滑肌，改善心腦等器官循環。白果酸還能抑制一些皮膚真菌和結核桿菌[3]。并且銀杏果中的白果酚具有降壓作用。近年來的研究還發現，銀杏具有美容功能[4]。據《本草綱目》和《本草再新》記載，銀杏可食可入藥。食則補心養氣，益腎潤肺，澀精固元，延年益壽；入藥可止咳平喘[5]。因此銀杏果不僅具有豐富的營養價值，還有較高藥用價值。我國具有豐富的銀杏資源，對于銀杏的開發利用也有了很大的發展。近年來不僅有白果糕點，銀杏月餅的制備，還有白果罐頭，銀杏汁，銀杏果茶的生產。銀杏果富含碳水化合物，可以作為優質的釀酒原料[5]。另外還發展出以銀杏汁為原料，與銀耳，紅棗等配成的銀杏蛋白露和銀杏棗汁等[6]。

益生菌對人體具有很高的營養和保健價值。其生長于人體腸道及生殖系統內，有助于維持人體健康以及改善人體微生態的平衡，是對人體有益的一類微生物[7]。如雙歧桿菌，嗜熱鏈球菌，植物乳桿菌等。據國內外研究報道，益生菌對人體具有一系列的作用。益生菌可以改善和促進人體腸道健康，增強人體的免疫力，緩解乳糖不耐受患者的癥狀，降低人體內的膽固醇，幫助人體產生所需的維生素，從而增強人體對營養的吸收和利用以及降低各種疾病的發病率，如腫瘤，肝損傷，結腸癌等[8]。據國內外報道，目前益生菌70%用于乳制品的生產中，如酸奶，奶酪，干酪，乳酸菌飲料以及冰淇淋等。但一部分人對于奶制品中的乳糖具有不耐受性，在飲用奶制品后會出現腹痛，腹瀉等情況。目前人們也開始尋求益生菌的其他發酵載體，如蔬菜，水果以及谷物等。還發展出發酵型泡菜，發酵型肉制品和醫藥保健品等。如日本的一種酪酸梭菌活菌制劑，因對腸道疾病的療效優于很多制劑，很快躍居我國消化科用藥第五位[9]。以及通過嗜酸乳桿菌、長雙歧、大腸桿菌發酵的德國藥物制劑Omniflora等[10]。

由于銀杏果中的營養成分多樣，含有豐富的淀粉，蛋白質和糖類等，在加入益生菌發酵后，其可以充分利用銀杏果中的物質，轉化為更利于人體吸收的成分。一方面補給了人體所需的益生菌數，維持人體微生物群的平衡，另一方面銀杏果所具有的營養物質也有利于人體健康。目前，國內外針對益生菌發酵銀杏果這方面的研究也并不完善。因此，本研究對銀杏果新產品開發具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏果：市購。

菌種：植物乳桿菌(1株)，保加利亞乳桿菌(1株)，嗜熱鏈球菌(3株)(益菌加)。

培養基：MRS(Man Rogosa Sharpe)培養基

蛋白胨 10.0 g

牛肉粉 5.0 g

酵母粉 4.0 g

葡萄糖 20.0 g

吐溫80 1.0 mL

K2HPO4·7H2O 2.0 g

醋酸鈉·3H2O 5.0 g

檸檬酸三銨 2.0 g

MgSO4·7H2O 0.2 g

MnSO4·4H2O 0.05 g

瓊脂粉 15.0 g

將上述成分加入到1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調節pH，調至到pH6.2左右，分裝后于121 ℃高壓滅菌15～20 min。

儀器：YQ-3型海鷗牌勻漿機(江蘇省江陰縣祝塘儀器廠)；HH-2數顯恒溫水浴器(金壇市江南儀器廠)；JJ-1大功率攪拌器(常州國華電器有限公司)；20PR-52D離心機(日立工機株式會社)；pHS-25型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；SPX-70BⅢ生化培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SW-CJ-1F超凈臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；Olympus BH-2顯微鏡(奧林巴斯光學有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 銀杏汁制備流程

銀杏果去殼、銀杏果煮沸、去皮、制漿、勻漿、煮沸滅菌、酶解、高溫滅酶、過濾或離心、冷卻、發酵。

1.2.2 銀杏汁的發酵

將制備得到的銀杏漿汁，放入三角瓶中，加入1%的乳酸菌于水浴鍋中密閉發酵，即200 mL銀杏汁，加入0.2 g的乳酸菌制劑。

1.2.3 發酵過程中不同溫度下pH的測定

在不同溫度下(30，35，40，45，50 ℃)于不同時間下(0，2，4，6，8 h)，用pH計測定乳酸菌發酵銀杏汁飲料的pH值。

1.2.4 最適溫度下不同時間pH的變化

在最適溫度下，于水浴鍋中發酵，測定(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)下銀杏汁的pH值。

1.2.5 最適條件下發酵銀杏汁中活菌數的檢測

將最適條件下發酵的銀杏汁，于(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)取樣，在超凈工作臺中，取1 mL樣品到離心管中，用1 mL移液槍取900 μL無菌水于另一滅菌過的離心管中，后加入100 μL樣品，以此方法，逐漸10倍稀釋。根據待檢樣品活菌總數的估計，選取2～3個稀釋度，進行涂板。每個稀釋度吸取100 μL稀釋液分別置于MRs平板中，使用L型玻棒進行涂布。后置于37 ℃生化培養箱中，培養48小時后計數平板上的菌落數。隨機挑取5個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，并做過氧化氫酶試驗。鏡檢時看到的是革蘭氏陽性(被染成紫色)無芽孢球菌或桿菌。同時過氧化氫酶試驗為陰性無芽孢桿菌或球菌可判定為乳酸菌[11]。

2 結果與討論

2.1 銀杏汁中加水量對乳酸菌發酵銀杏汁飲料的影響

銀杏果與水的添加比例的不同，會對銀杏汁飲料的穩定性，口感，質感以及色澤產生很大的影響[12]。表1是關于水的添加量不同導致的銀杏汁的區別。

表1 不同加水量的銀杏汁的區別

因此，較適合于益生菌發酵銀杏飲料的銀杏果與水的比例為1∶10。

2.2 均質對銀杏汁飲料澄清度的影響

均質可以使銀杏漿汁中的銀杏顆粒降至顯微水平，使其中不溶性的大顆粒物質的粒度減少，從而減少各個組分的沉降系數[13]，獲得更為穩定的銀杏汁液。進而解決銀杏果在榨汁后出現的顆粒過大，沉淀渾濁和分層的現象。通過實驗發現，經過均質勻漿后的銀杏汁要明顯澄清，在加熱后其糊化分層現象明顯減弱。

2.3 淀粉酶對澄清型銀杏汁飲料的影響

由于銀杏中的淀粉含量高達62.4%，在加熱糊化以及發酵過程中會產生大量的沉淀，嚴重影響了銀杏汁的口味，形態和外觀品質。因此在實驗中，發現加入1%的中溫淀粉酶于75 ℃下反應2 h后，其澄清度會稍有改善，并且在加入益生菌后，它在發酵過程中的沉淀會減少，靜置穩定性顯著提高。

2.4 蛋白酶對澄清型銀杏汁飲料的影響

經過淀粉酶水解過后的銀杏汁在乳酸菌的發酵下，于6 h后依然會出現絮狀沉淀，澄清度下降。根據分析，由于銀杏果中含有的11%的蛋白質，在乳酸菌發酵銀杏汁的過程中，產生大量的乳酸，pH值下降，使得銀杏果漿汁中的蛋白質變性，析出，產生絮狀沉淀，嚴重影響了銀杏汁的發酵后的質地和口感。通過加入銀杏果量(去殼去皮)1%的中性蛋白酶于50 ℃水浴鍋中酶解3～6 h，并過濾后發現銀杏汁稍顯澄清。在后續的發酵過程中并未出現沉淀分層現象。甚至直到20 h后，也未出現絮狀物質，靜置穩定性良好。這是由于中性蛋白酶在中性條件下可以迅速的分解蛋白質類物質。從而使得益生菌發酵的銀杏汁飲料的澄清度增加。

2.5 不同溫度下乳酸菌發酵銀杏汁的pH變化

在一系列溫度梯度下(30，35，40，45，50 ℃)發酵銀杏汁，每隔2 h用pH計測定其pH值。

圖1 不同溫度下乳酸菌發酵銀杏果汁過程中pH隨時間的變化

由圖1可見，銀杏汁發酵之前，其pH值處于中性，約為6.4左右。在加入植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌以后，其pH值在2 h內并未發生明顯變化，大致位于6.2，這是由于乳酸菌處于生長遲緩期。菌種需適應其環境，乳酸生成較少。從圖還可以看出，在不同的溫度下，乳酸菌發酵銀杏汁時的產酸能力不同。在溫度為40 ℃時，銀杏汁的pH值能夠最快到達3.53。當溫度為35 ℃時，乳酸菌發酵銀杏汁的產酸能力次之，在8 h時可以達到3.85。溫度為45 ℃時，其產酸能力和在35 ℃下大體一致，8 h后的最終pH值為4.15。圖1中還可以看出，當溫度為30 ℃或50 ℃時，溫度太低或太高并不利于乳酸菌的生長，因此乳酸生成的速度很慢，在8 h后pH的變化仍不明顯，分別為4.47和5.43。因此，可以看出，乳酸菌發酵銀杏汁的最適溫度為40 ℃，在此溫度下，其產酸能力最強。

2.6 在最適溫度下益生菌發酵銀杏汁的pH變化

圖2是在最適溫度，即40 ℃下，乳酸菌發酵銀杏汁的pH隨時間的變化曲線。由圖可見，在0～2 h內，pH的變化并不明顯，由最初的6.47降至6.23。隨著時間的變化，乳酸菌逐漸適應銀杏汁的環境后，利用銀杏汁中的營養快速發酵，進入對數期，乳酸快速生成，銀杏汁的pH值顯著降低，自2～8 h，其pH值由6.23降至3.53。而8 h以后，乳酸菌的發酵進入穩定期，銀杏汁發酵液中的pH值降低速度緩慢，由10 h的3.47到12 h的3.23。由于乳酸的不斷生成，抑制了乳酸菌的生長代謝，最終pH值趨于穩定，在15 h和20 h時均為3.07。

圖2 乳酸菌發酵銀杏果汁過程中pH隨時間的變化

2.7 最適溫度下益生菌發酵銀杏汁飲料的活菌數隨時間的變化

在最適溫度下，即40 ℃水浴鍋中，用乳酸菌發酵銀杏汁飲料，分別在(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)時取樣，進行涂板培養，于48 h后計數平板上的菌落數，并染色，鏡檢。

圖3 銀杏汁發酵中活菌數的變化

細菌的生長周期分為遲緩期，對數期，穩定期和衰退期。由圖3可見，在0～2 h時銀杏汁中的乳酸菌處于遲緩期，其菌群數由2×106cfu/mL增長到3×106cfu/mL，由于其中的乳酸菌剛剛適應銀杏汁中的營養環境，其需要一個短暫的適應過程，有些菌種因對外在環境敏感，無法適應，而造成死亡。遲緩期的乳酸菌菌群數曲線平坦，菌落繁殖很少。處于遲緩期的細胞代謝活躍，體積增大，從介質中能快速吸收營養物質，大量合成細胞分裂所需的酶類、ATP和其他細胞成分等[14]。2～8 h時，銀杏汁中發酵的乳酸菌生長進入對數期，期間，細胞快速分裂，這一期細胞數目呈幾何級數增加，代時最短，細胞合成核糖體及蛋白質增多。當然這不僅與菌種有關，也與其環境，如溫度，pH和培養基成分等相關。8～12h時，乳酸菌的生長進入穩定期。菌群數由8 h的4.2×107cfu/mL生長到10 h的4.7×107cfu/mL，到達12 h時，乳酸菌菌落數維持在3.9×107cfu/mL。此時，新生的細胞數目與死亡的細胞數目相等，總菌落數達到最大值，活菌數保持恒定。銀杏汁中的營養物質被逐漸消耗，無法滿足乳酸菌的生長需要。而處于穩定期的細菌繼續培養，細胞的死亡率逐漸增加，最終群體中獲得細胞數目將以對數速率急劇下降，即為死亡期。為圖3中的12～20 h時，活菌數最終降低為15 h的1×107cfu/mL和20 h時的4×106cfu/mL。

3 結 論

(1)得到口感最佳，質地細膩，色澤明亮的銀杏汁飲料，最適宜乳酸菌發酵的銀杏果與水的比例為1∶10。

(2)因銀杏果含有大量淀粉和不少蛋白質，若直接制漿發酵，會導致發酵中產生沉淀分層，澄清度下降。為獲得穩定性良好，澄清度較高的銀杏汁，需通過均質，中溫淀粉酶水解，中性蛋白酶水解和離心過濾的方法。

(3)選用的乳酸菌為植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，菌種比例為1∶1∶3時，最適宜發酵的溫度為40 ℃，最適宜上述菌種發酵銀杏汁的時間為10 h，這時，銀杏汁的pH為3.47，而在后續的發酵中，即直到20 h時pH降低到3.00，其并不適合乳酸菌的生長。而且10 h時，發酵的銀杏汁中的乳酸菌，其達到最高菌群數，即4.7×107cfu/mL，得到香味濃郁，質地細膩，酸味適中以及顏色乳黃的益生菌發酵銀杏汁飲料產品。

(4)后續的研究中，還需研究食品添加劑的添加對銀杏汁飲料口味的影響，還有在冷藏條件下，益生菌發酵銀杏汁飲料貯藏穩定性的變化以及益生菌發酵過后的銀杏汁中成分的變化。

[1] 黃霄，王海龍. 銀杏汁的加工工藝及品質測定[J]. 食品研究與開發，2012 (6)：97-99.

[2] 史垠垠. 白果飲料加工工藝及穩定性研究 [D]. 南京：南京林業大學，2010.

[3] 楊婧曦，于海峰. 銀杏飲料穩定性的研究進展[J]. 山東食品發酵，2013 (3)：44-46.

[4] 張煥新，劉靖，臧大存，等. 銀杏汁酸乳的研制[J]. 中國釀造，2008，16：93-95.

[5] 段蕊. 銀杏制品的發展現狀[J]. 食品與發酵工業，2002，28(8)：57-61.

[6 ]趙伯濤，王玉成. 銀杏系列飲品的加工技術及質量控制[J]. 中國野生植物資源，1995(1)：31-34.

[7] SHARMA V，MISHRA H N. Fermentation of vegetable juice mixture by probiotic lactic acid bacteria[J]. Nutrafoods，2013，12(1)：17-22.118-119.

[8] YOON K Y，WOODAMS E E，HANG Y D. Production of probiotic cabbage juice by lactic acid bacteria[J]. Bioresource Technology，2006，97(12)：1427-1430.

[9] 曾子丹，姚朔影. 益生菌的研究前景及國內外發展狀況[J]. 食品工業科技，2007，28(8)：251-254.

[10] 杜鵬，霍貴成. 國內外益生菌制品發展現狀[J]. 食品科學，2004，25(5)：194-198.

[11] 劉世武. 乳酸菌飲料中乳酸菌的檢測分析[J]. 濰坊學院學報，2008，8(4)：118-119.

[12] 邢賀欽. 復合蔬菜汁發酵飲料的加工工藝研究[D]. 長春：吉林農業大學，2008.

[13] ZHANG H，WANG Z，XU S Y. Optimization of processing parameters for cloudy ginkgo juice[J]. Journal of food engineering，2007，80(4)：1226-1232.

[14] DI CAGNO R，CODA R，DE ANGELIS M，et al. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J]. Food Microbiology，2013，33(1)：1-10.

Research and Development of Probiotic FermentedGinkgobilobaJuice Beverage

Sun Dafeng，Zhang Weiming，Zhang Fenglun，Zhu Changling，Shen Jiaojiao
(Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042，China)

Ginkgobilobawas chosen as the raw material，and fermented byLactobacillusplantarum，LactobacillusbulgaricusandStreptococcusthermophilus(the ratio of the strain was 1∶1∶3).The research aimed to study the concentration of the fermentation broth，the stability of the beverage system and the parameters in the fermentation process，such as pH，temperature and the number of viable bacteria.Through the detection of the sense and taste of the fermented juice of probiotics，it was found that the ratio ofGinkgobilobato water was 1∶10.In order to obtain the stability of ginkgo juice，add medium temperature amylase and neutral protease to hydrolize. At different temperatures by using lactic acid bacteria fermented ginkgo juice，get the most suitable ginkgo juice fermentation temperature is 40 ℃ and the fermentation time 10 h，lactic acid bacteria fermented ginkgo juice pH stabilized at around 3.47，the initial number of live bacteria is 2×106cfu/mL，the maximum number of live bacteria occurred at 10 h，4.7×107cfu/mL，get a rich flavor，delicate texture，acidity and yellow probiotic fermented ginkgo juice beverage product.

Ginkgobiloba；probiotics；fermentation；production technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.017

2016-11-12

孫達鋒(1977—)，男，副研究員，研究方向：天然產物。E-mail：sdafeng@163.com

TS275.4

A

1006-9690(2017)03-0078-05