飛蝗幾丁質脫乙?；富虻姆肿犹匦院蜕飳W功能

于榮榮，丁國偉，劉衛敏，張敏，趙小明，韓鵬飛，馬恩波，張建珍

?

飛蝗幾丁質脫乙?；富虻姆肿犹匦院蜕飳W功能

于榮榮1,2，丁國偉1,2，劉衛敏1，張敏1，趙小明1，韓鵬飛1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學應用生物學研究所，太原030006；2山西大學生命科學學院，太原030006）

【目的】幾丁質脫乙?；福╟hitin deacetylase，CDA）是昆蟲幾丁質代謝系統的重要酶系，研究飛蝗（）幾丁質脫乙?；富虻姆肿犹匦院蜕飳W功能，為新型農藥靶標篩選提供科學依據?！痉椒ā炕陲w蝗轉錄組數據庫，獲得幾丁質脫乙?；富虻腸DNA序列，將其與飛蝗基因組進行比對，繪制基因結構圖。將其與赤擬谷盜CDAs序列進行比對，并采用BlastP和SMART軟件進行功能域預測。將已鑒定的飛蝗CDAs分別與赤擬谷盜、果蠅、岡比亞按蚊、家蠶、中華稻蝗和云杉卷葉蛾的同源序列進行聚類分析，采用MEGA 5.02軟件中的neighbor-joining（NJ）法構建系統發育樹。采用reverse transcription quantitative PCR（RT-qPCR）方法檢測分析在飛蝗5齡若蟲不同組織部位和不同發育日齡表皮中的表達特性，進一步采用RNA干擾（RNAi）技術研究其對飛蝗蛻皮發育的影響。采用化學檢測法測定其幾丁質含量。利用透射電鏡（TEM）觀察其對表皮幾丁質排列的影響?！窘Y果】在飛蝗轉錄組數據庫中搜索獲得3條幾丁質脫乙?；富蛉LcDNA序列，生物信息學分析發現其均具有信號肽，開放閱讀框包含幾丁質結合區（ChBD）和幾丁質脫乙?；呋颍–DA）2個功能域。與赤擬谷盜CDAs序列比對結果表明飛蝗2條CDAs部分序列存在差異，且與赤擬谷盜的2個剪切子差異序列位置一致，顯示2條序列為2個剪切子。聚類分析結果表明，3條序列分別與6種昆蟲CDA4和CDA5以較高的置信度聚為一支。分別將其命名為和。不同組織部位表達結果表明和在飛蝗前腸、后腸和表皮中高表達，在脂肪體中也有較高的表達；CDAs在5齡不同天數表皮表達結果顯示和在5齡第1和第2 天的表皮中表達量較高，之后逐步下降。注射ds或ds24 h后，與對照組相比，基因表達量顯著降低，沉默效率達到98.1%和95.6%，但均無可見表型，都可正常蛻皮至成蟲。幾丁質含量和透射電鏡分析顯示，上述基因RNAi后不影響表皮幾丁質含量及排列?！窘Y論】飛蝗幾丁質脫乙?；?和5基因主要在飛蝗表皮和前/后腸表達，生物學功能研究表明這2個基因不參與飛蝗蛻皮發育過程，靶基因沉默對飛蝗生長發育及表皮結構無影響。

飛蝗；幾丁質脫乙?；?；組織部位；日齡；表型；幾丁質含量和排列

0 引言

【研究意義】飛蝗（）是世界范圍內農業生產的重大害蟲，中國長期以來對蝗蟲的治理主要依靠化學防治，由于常年施用農藥，使飛蝗產生抗藥性，同時導致農業環境污染[1-2]。因此，研發環境友好型殺蟲劑是植物保護領域的研究熱點。幾丁質（chitin）是-1,4糖苷鍵連接的-乙酰-D-氨基葡萄糖，對昆蟲表皮形態維持起著重要作用[3]。飛蝗的生長發育經歷周期性蛻皮發育，幾丁質代謝相關酶系在這一過程中發揮著關鍵作用，幾丁質脫乙?；福╟hitin deacetylase，CDA）催化幾丁質轉化為殼聚糖，是幾丁質代謝系統的關鍵酶[4]。由于人類和高等動物不具備這一代謝系統，因此，基于CDAs的研究有望成為飛蝗防治的新型分子靶標?！厩叭搜芯窟M展】CDAs是糖酯酶4家族（CE4）的一類修飾酶，可將幾丁質的乙?；撊?，形成殼聚糖，殼聚糖的氨基可提供與其他表皮蛋白和圍食膜蛋白相結合的位點[5]。根據功能域的不同將CDAs分為5類，第1類（CDA1和CDA2）和第2類（CDA3）均含有3個功能域：即幾丁質結合域（ChBD）、低密度脂蛋白受體（LDLa）和催化域（CDA），第3類（CDA4）和第4類（CDA5）含有2個功能域：即ChBD和CDA，第5類（CDA6、7、8、9）僅含有CDA功能域[6-7]。目前已鑒定的CDAs具有3種功能。其一為參與圍食膜的形成。在擬尺蠖（）中腸cDNA文庫中首次鑒定出CDA蛋白，發現其與中腸圍食膜形成相關[8]。在蓓帶夜蛾（）的圍食膜中鑒定出，發現其在幼蟲期表達[9]。Campbell等[10]采用電泳和質譜分析法從棉鈴蟲（）圍食膜中鑒定獲得CDA蛋白，推測其可能參與毒素攔截；Zhong等[11]采用蛋白組學結合二維電泳方法在家蠶（）圍食膜中鑒定出，但其分子功能尚不明確；SANDOVAL-MOJICA等[12]發現在北美散白蟻（）中特異性地結合在圍食膜上。其二為參與表皮幾丁質片層結構的形成。如果蠅（）的（）和（Verm）參與幼蟲表皮幾丁質片層結構的形成[13]。赤擬谷盜（）中和在表皮中特異表達，且在蛻皮中起著重要作用[6]。干擾云杉卷葉蛾（）和褐飛虱（）的和均可影響蟲體正常蛻皮[14-15]。飛蝗的參與5齡若蟲表皮幾丁質的排列且LmCDA2具有幾丁質脫乙酰酶活力[16-17]。美國白蛾（）鑒定出HcCDA1和HcCDA2均具有催化活性[18]，中華稻蝗（）的和對其蛻皮起著重要作用[19-20]。此外，果蠅中2個CDA酶對胚胎期氣管的形成和延伸具有重要作用[21-22]?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內外對昆蟲中第1類CDAs生物學功能有較為系統的研究報道，而對第3和第4類CDAs的研究較少，同時，研究發現這兩類CDAs在不同昆蟲間其分子特性和生理功能存在差異，如赤擬谷盜的和在表皮中特異表達，但不影響其蛻皮和正常發育[6]。稻縱卷葉螟（）的在頭部表達最高，在表皮中表達最高，推測可能參與幾丁質代謝[23]。褐飛虱的對其生長發育具有重要作用，當該基因沉默后，蟲體出現難以脫去舊表皮最終導致死亡的表型[15]。此外，蜱螨目肩胛硬蜱（）的表達被沉默后雖無可見表型，但其腸道中病原菌伯氏包柔螺旋體（）數量顯著增加。推測CDAs增加了圍食膜的孔徑，使病原體更容易侵入[24]。飛蝗第3和第4類CDAs的功能尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】獲得飛蝗和全長cDNA序列，采用RNA干擾技術研究其對飛蝗表皮的影響，探索和的生物學功能，為進一步篩選殺蟲劑新靶標提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在山西大學應用生物學研究所完成。

1.1 材料

供試昆蟲：飛蝗卵塊購于河北滄州蝗蟲養殖基地，將其置于人工氣候箱中孵育，設置溫度為（30±2）℃，相對濕度為60%，光周期為L﹕D=14 h﹕10 h。待其孵化為1齡若蟲后，將其轉移至紗籠中放于人工氣候培養箱中繼續培養，每天飼喂足量新鮮麥苗，待其長至3齡若蟲后，添加足量麥麩。直至其蛻皮為5齡若蟲時開展后續試驗。

試驗試劑：總RNA提取所需試劑RNAisoTMPlus、cDNA第1鏈合成所需試劑Revert AidTMHMinus M-MuLV反轉錄酶和5×reaction buffer、dNTP mix和RNAase inhibitor、RT-qPCR所需試劑SYBR PremixExTaqTMII和熒光染料ROX均購于日本TaKaRa公司；PCR擴增所需試劑2×Taq PCR MasterMix購于天根生物公司；Wizard?SV Gel、PCR Clean-Up System、RNAi雙鏈RNA（dsRNA）合成所需試劑T7 RiboMAXTMExpress RNAi System購于Promega公司。氯仿、異戊醇和75%無水乙醇均為國產分析醇。

1.2 飛蝗和的cDNA序列鑒定

1.2.1 飛蝗和的cDNA序列獲得 將關鍵詞“chitin deacetylase”輸入飛蝗轉錄組數據庫中，采用sequencher軟件將搜索獲得序列進行拼接，獲得、和的cDNA序列。采用Expasy translate在線軟件將其翻譯為氨基酸，采用NCBI網站的blastP和SMART工具對其進行功能域預測。將和的序列部分氨基酸去掉，采用GeneDoc生物軟件將、、和的氨基酸序列進行比對，并對其功能域進行標記。

1.2.2 飛蝗和基因結構及聚類分析 采用NCBI的Blastn工具，將已鑒定的、和的cDNA序列與飛蝗基因組序列進行比對，AG-GT原則分析其內含子和外顯子。采用Adobe Illustrator CS6繪制基因結構圖。采用NCBI搜索獲得其他昆蟲CDAs氨基酸序列，Clustal X軟件對其進行比對，Mega 5.02對其進行neighbor-joining（NJ）聚類分析。

1.3 飛蝗和的組織部位和發育日齡表達分析

1.3.1 飛蝗和的引物設計 基于飛蝗轉錄組數據庫獲得和全長cDNA序列，采用Primer 5.0軟件分別在及和的公共區域設計表達引物和干擾引物，委托上海生工生物股份有限公司合成（表1）。

1.3.2 不同組織部位cDNA模板制備 收集30頭5齡第6天飛蝗若蟲，使用解剖刀在解剖鏡下快速將7個組織部位（表皮、前腸、中腸、胃盲囊、后腸、馬氏管和脂肪體）置于冰盒上解剖，凍存于液氮中，參照TaKaRa公司提取RNA說明書，提取總RNA，采用瓊脂糖膠檢測其完整性，采用NanoDrop2000進行濃度測量。以1 μg RNA為模板，采用Revert AidTMHMinus M-MuLV反轉錄酶獲得cDNA第1鏈。10頭蟲體為1個生物學重復，共設3個生物學重復。

表1 本研究所用的表達引物和雙鏈合成引物

1.3.3 不同發育日齡表皮cDNA模板制備 收集63頭5齡飛蝗若蟲用于CDAs在不同發育日齡的表達檢測，使用解剖刀在顯微鏡下快速將不同日齡若蟲的表皮置于冰盒上解剖取出，凍存于液氮中。提取總RNA和合成cDNA第1鏈的方法同1.3.2。每3頭蟲體為1個生物學重復，共設3個生物學重復。

1.3.4和表達量的檢測 采用RT-qPCR檢測和在不同組織和發育日齡的表達。將1.3.2和1.3.3合成的cDNA模板稀釋20倍，采用表達引物進行RT-qPCR擴增。體系為SYBR PremixExTaqTMII 10 μL，模板2 μL，上游和下游表達引物分別為0.8 μL，ROX 0.4 μL。程序為95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s共40個循環，加熔解曲線95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。采用ABI Prism 7300 SDS 1.1軟件進行數據收集。采用2-△△Ct法進行數據分析。采用SPSS軟件Turkey分析進行顯著性差異分析。設置3個生物學重復和2個技術重復。為內參基因[25]。

1.4 飛蝗和的生物學功能

1.4.1 雙鏈RNA(dsRNA)合成 采用RNA干擾引物進行PCR擴增。體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，無菌去離子水10.5 μL，上下游dsRNA合成引物各0.5 μL，表皮cDNA模板1 μL。使用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒對PCR產物進行純化。采用瓊脂糖凝膠檢測檢測目的條帶，使用NanoDrop 2000（Thermo scientific）對其進行定量，使終濃度達到0.25 μg·μL-1，參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒說明書合成ds和ds，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為對照。使用NanoDrop 2000進行定量，使其終濃度達到2 μg·μL-1，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.4.2 干擾效率檢測和表型觀察 選取大小一致，生長狀況良好的5齡第2天飛蝗若蟲78頭進行干擾效率檢測和表型觀察。采用25 μL微量進樣器將6 μg dsds和ds分別注射入飛蝗2—3腹節節間膜處。處理組和對照組分別設置3個生物學重復，每個重復3頭蟲體。將注射dsRNA的試蟲放于人工氣候箱中繼續飼養，待24 h后分別將對照組和處理組各9頭蟲體凍存于-80℃冰箱中，參照1.3.2方法提取RNA并反轉錄為第1鏈cDNA。3頭試蟲為1個重復，共設置3個生物學重復。采用RT-qPCR檢測目的基因表達情況，檢測方法參照1.3.4。剩余60頭試蟲放于培養箱中繼續飼喂，每天觀察記錄其發育情況。

1.4.3 幾丁質含量測定 選取5齡第2天飛蝗若蟲共90頭隨機分為3組，分別注射dsds和ds，每組注射30頭蟲，至5齡第7天時將其腹部表皮解剖取出，置于90℃干燥箱中烘干，待其達到恒重后，參考ZHANG等[26]方法測定幾丁質含量。對照組和處理組分別設置10組，每組含有3頭蟲，設置3個技術重復。

1.4.4 透射電鏡觀察 選取15頭5齡第2天若蟲，將其平均分為3組，分別注射ds、ds和ds，待其蛻皮死亡后，將其表皮快速解剖取出，固定于3%戊二醛中，參照LIU等[27]方法進行透射電鏡樣品制備及觀察。

2 結果

2.1 飛蝗的cDNA序列分析

基于飛蝗轉錄組數據庫搜索獲得幾丁質脫乙?；?和5基因的全長cDNA序列，其中包含2個剪切子，分別將其命名為和?；蚪Y構圖顯示，包含10個外顯子和9個內含子，和均包含20個外顯子和19個內含子，且其在第15個外顯子處序列存在差異，將其命名為E15a和E15b（圖1-A）。功能域分析表明，開放閱讀框為1 449 bp，編碼483個氨基酸。開放閱讀框均為3 300 bp，編碼1 100個氨基酸。其均具有信號肽、幾丁質結合域（ChBD）和幾丁質脫乙?；呋颍–DA）（圖1-B）。與赤擬谷盜、和序列比對結果表明，和的差異區域與和的差異區域位置一致。其均含有幾丁質結合域（ChBD）特征序列（6個cys），幾丁質脫乙?；呋颍–DA）均具有5個特征序列，分別為TFD[D/G]、[H/E]××S[H/L]、RAP[Y/F]、[F/Y] [I/T]YDS和LDYK××H（圖1-C）。

A：黑色實心框和線段為LmCDA5a和LmCDA5b共有外顯子和內含子。紅色和藍色實心框和線段分別為LmCDA5a和LmCDA5b特有外顯子，分別為E15a和E15b Black solid boxes and lines indicated the common exons and introns. Red and blue solid boxes and linses presented the specific exon and introns, named E15a and E15b；B：藍色三角形為信號肽，綠色六邊形為幾丁質結合域，黃色框為催化功能域。數字代表氨基酸長度Blue triangles showed the signal peptides, the green hexagon represented chitin-binding domains and yellow boxes represented catalytic domains. Numbers showed the length of amino acid；C：灰色陰影為信號肽區域，綠色框為幾丁質結合區（ChBD），紫色陰影為幾丁質結合域（ChBD）特征氨基酸（cys），橘色下劃線為幾丁質脫乙?；复呋颍–DA），黃色陰影為催化區域保守序列。藍色和紅色分別為赤擬谷盜和飛蝗CDA5a和CDA5b的差異序列，//表示CDA5沒有顯示的氨基酸序列The signal peptide was shaded with gray, chitin binding domain (ChBD) was marked with green box, the signature amino acids of ChBD domain were shaded with purple, chitin deacetylase catalyticdomains (CDA) were underlined with orange line, the conserved signature motifs were marked with yellow shadow. The specific amino acids of CDA5a and CDA5b in T. castaneum and L. migratoria were marked with blue and red. // indicated additional amino acids of CDA5 not shown

2.2 飛蝗與其他已知昆蟲CDAs的聚類分析

將飛蝗LmCDA4、LmCDA5a和LmCDA5b與赤擬谷盜、果蠅、岡比亞按蚊（）、家蠶、稻蝗和云杉卷葉蛾的CDAs構建NJ系統進化樹（圖2）。結果表明，LmCDA4以較高的置信度與果蠅DmCDA4及赤擬谷盜TcCDA4聚為一支。同時LmCDA5a和LmCDA5b與赤擬谷盜和果蠅CDA5s聚為一支?；谄渌δ苡虿煌?，CDAs可分為5類，LmCDA4屬于第Ⅲ類，LmCDA5a和LmCDA5b屬于第Ⅳ類。第Ⅲ和第Ⅳ類僅含有幾丁質結合域（ChBD）和幾丁質脫乙?；复呋颍–DA）。

2.3 飛蝗和的組織部位和發育日齡表達特性

組織部位表達圖譜顯示，飛蝗在前腸表達最高，在表皮和后腸次之，而在前腸表達最高，在表皮、后腸和脂肪體表達較高（圖3-A）。發育日齡表達圖譜顯示，和均在蛻皮后表達較高。即5齡第1、2天表達較高，之后呈現逐漸降低趨勢（圖3-B）。

Dm：果蠅D. melanogaster；Ag：岡比亞按蚊A. gambiae；Tc：赤擬谷盜T. castaneum；Bm：家蠶B.mori；Cf：云杉卷葉蛾C. fumiferana；Oc：中華稻蝗O. chinensis；Lm：飛蝗L. migratoria。不同陰影代表不同分組。藍色實心圓為LmCDA4、LmCDA5a和LmCDA5b氨基酸序列 Different shadows showed the different groups. The amino acids of LmCDA4, LmCDA5a and LmCDA5b were marked with blue solid circles

IN：表皮Integument；FG：前腸Foregut；MG：中腸Midgut；GC：胃盲囊Gastric caeca；HG：后腸Hindgut；MT：馬氏管Malpighian tubules；FB：脂肪體Fat body。N5：5齡若蟲，D1—D7：第1—7天。β-actin為內參對照，柱上不同字母表示樣品間存在顯著差異（P＜0.05）β-actin was the reference. Different letters on the columns meant significant difference (P＜0.05)

2.4 飛蝗和沉默效率檢測和表型觀察

注射dsds和ds24 h后，采用RT-qPCR分別檢測和的相對表達量（圖4-A）。與對照相比，注射dsRNA后，靶基因的表達均顯著降低。即注射ds后，相對表達量降低了98.1%。注射ds后，相對表達量降低了95.6%。表型觀察表明，注射ds和ds的蟲體均可成功蛻皮發育至成蟲。對其幾丁質含量進行檢測。結果表明（圖4-B），與對照相比，注射dsRNA后，其幾丁質含量均未出現顯著差異。進一步將其腹部表皮解剖下來，進行透射電鏡觀察（圖4-C），結果表明注射ds組其腹部原表皮呈現層狀結構排列。注射ds和ds并未影響其原表皮層狀結構排列。

A：柱形圖上的**表示處理組和對照組之間存在極顯著差異（P＜0.01）Two asterisk on the columns indicated markedly significant difference between the control and dsLmCDA4 or dsLmCDA5 injection (P＜0.01)；C：黃色框表示與上表皮相鄰的原表皮，黑色框表示與表皮細胞相鄰的原表皮。標尺為5 μm和500 nm Yellow boxes indicated the area of procuticle next to epicuticle, black boxes indicated the procuticle next to the epidermal cell. Scale bars were 5 μm and 500 nm

3 討論

幾丁質脫乙?；窩DAs存在于多種昆蟲中。其作為一種修飾酶系，可以催化幾丁質轉化為去乙?；鶐锥≠|[28]。目前在赤擬谷盜中鑒定出9條CDAs序列，根據其所含的功能域不同，將其分為5類，其中第3類和第4類含有幾丁質結合域和催化域[7]。本研究基于飛蝗轉錄組數據庫，獲得3條序列，經功能域分析，發現其均含有幾丁質結合域和催化域，故認為其可能是第3類或第4類CDAs。進一步與其他昆蟲的CDAs進行氨基酸比對，發現LmCDA4和LmCDA5分別以較高的置信度與其他昆蟲的CDA4和CDA5聚為一支，故將其命名為和。赤擬谷盜的具有2個剪切子，分別為和[6-7]。為明確的2條序列是否為不同剪切子，將其與赤擬谷盜和進行了氨基酸序列比對，發現的差異區域與赤擬谷盜的差異區域位置一致，故將其命名為和。

不同昆蟲中CDA4和CDA5在不同組織部位和不同發育階段的表達具有多樣性。在褐飛虱的表皮中表達較高，且其在蛻皮前后表達較高[15]。赤擬谷盜和均在表皮中表達最高，在除蛹期外其他齡期均有表達，在整個發育齡期均有表達[6]。稻縱卷葉螟在頭部表達較高，且其在成蟲期表達顯著高于幼蟲期，在表皮中高表達，其齡期表達與表達模式相反，即其在幼蟲期的表達顯著高于成蟲期[23]。本研究發現，飛蝗和均在前腸表達最高，在表皮和后腸表達較高。此外，在脂肪體表達較高。與表皮來源相同，昆蟲前腸和后腸均由外胚層內陷形成[29]。前人報道果蠅氣管來源于脂肪體，后經血淋巴將其轉移到氣管細胞中，最終經胞吞作用，將其運輸到氣管腔中[30]，故推測飛蝗與脂肪體相關，但是否其來源于脂肪體，還需進一步驗證。和均在蛻皮前后表達較高，推測其可能參與飛蝗表皮的生長發育。

幾丁質去乙?；福‥C 3.5.1.41）是碳水化合物酯酶4家族成員之一。CDA能夠催化幾丁質-1,4糖苷鍵連接的-乙?；咸前返囊阴０坊?，形成脫乙酰幾丁質（或稱聚葡萄糖胺，殼聚糖）[28]。研究表明，同一昆蟲CDAs的功能有所差異。赤擬谷盜中和的dsRNA進入蟲體后，出現蛻皮致死的表型，但沉默、和后并未出現致死表型[6]。褐飛虱、和的dsRNA注射進入蟲體后，出現蛻皮致死的表型，但沉默并不影響其正常生長發育[15]。筆者實驗室前期研究發現，飛蝗中負責幾丁質排列，將其沉默后，蟲體難以從舊表皮中蛻出，最終導致死亡，電鏡觀察表明幾丁質片層結構消失，幾丁質層變得疏松導致原表皮層厚度增加，但并未影響幾丁質的含量[16]，本文將已鑒定的和的dsRNA注射入蟲體后，發現其均可成功發育至成蟲，未影響幾丁質含量和表皮幾丁質排列，表明飛蝗不同CDAs功能上存在差異。根據CDAs所含功能域不同，將CDAs分為5類，其中CDA1和CDA2屬于第Ⅰ類，負責昆蟲蛻皮和表皮結構的完整性，包含幾丁質結合域（ChBD）、低密度脂蛋白受體域（LDLa）和催化域（CDA），而CDA4和CDA5分別屬于第Ⅲ和Ⅳ類，均不含LDLa功能域，哺乳動物中多個LDLa串聯形式在一起，結合并且轉運脂蛋白進入細胞中，從而參與膽固醇的代謝[7]。昆蟲僅有1個LDLa功能域，可能參與脂蛋白的運輸，脂蛋白是上表皮的重要組成成分，由于CDA1和CDA2含有LDLa功能域，基因沉默后導致昆蟲蛻皮困難最終死亡，而CDA4和CDA5均不含有LDLa功能域，推測其不參與這一運輸過程，故不影響昆蟲蛻皮，這與赤擬谷盜和相一致，目前對其生物學功能及其機理還需要進一步研究。此外，赤擬谷盜和以及云杉卷葉蛾出現蛻皮致死的原因推測可能由于ds和ds引起幾丁質脫乙酰度發生改變[4,14]，本文中和不影響飛蝗正常蛻皮，是否影響脫乙酰度還需要進一步驗證。綜合分析表明，和在不同昆蟲中均不影響正常蛻皮。本研究結果豐富了飛蝗CDAs家族的生物學功能研究內容，為基于幾丁質代謝關鍵靶標基因篩選提供了理論和實踐依據。

4 結論

獲得飛蝗幾丁質脫乙?；?和5基因的全長cDNA序列，具有2個剪切子，分別命名為和。和均在5齡若蟲的表皮、前腸和后腸中表達量較高，且其均在蛻皮后的表達顯著高于其他時期。RNA干擾可有效沉默靶基因的表達，注射ds和ds的試蟲可正常蛻皮發育，無可見表型，幾丁質含量和電鏡結果也表明未影響表皮幾丁質含量和原表皮片層結構。

References

[1] 張龍. 國內外蝗害治理技術現狀與展望. 應用昆蟲學報, 2011, 48(4): 804-810.

ZHANG L. Advances and prospects of strategies and tactics of locust and grasshopper management., 2011, 48(4): 804-810. (in Chinese)

[2] MA E B, HE Y P, ZHU K Y. Comparative studies of acetylcholinesterases purified from two field populations of the oriental migratory locust (): implications of insecticide resistance., 2004, 78(1): 67-77.

[3] MOUSSIAN B, SCHWARZ H, BARTOSZEWSKI S, NüSSLEIN- VOLHARD C. Involvement of chitin in exoskeleton morphogenesis in, 2005, 264(1): 117-130.

[4] TSIGOS L, MARTINOU A, KAFETZOPOULOS D, BOURIOTIS V. Chitin deacetylases: new, versatile tools in biotechnology., 2000, 18(7): 305-312.

[5] ZHU K Y, MERZENDORFER H, ZHANG W Q, ZHANG J Z, MUTHUKRISHNAN S. Biosynthesis, turnover and function of chitin in insects., 2016, 61(1): 177-196.

[6] ARAKANE Y, DIXIT R, BEGUM K, PARK Y, SPECHT C A, MERZENDORFER H, KRAMER K J, MUTHUKRISHNAN S, BEEMAN R W. Analysis of functions of the chitindeacetylase gene family in., 2009, 39(5/6): 355-365.

[7] DIXIT R, ARAKANE Y, SPECHT C A, RICHARD C, KRAMER K J, BEEMAN R W, MUTHUKRISHNAN S. Domain organization and phylogenetic analysis of proteins fromthe chitin deacetylase gene family ofand three other species of insects., 2008, 38(4): 440-451.

[8] GUO W, LI G X, PANG Y, WANG P. A novel chitin-binding protein identified from the peritrophic membrance of the cabbage looper,., 2005, 35(11): 1224-1234.

[9] TOPRAK U, BALDWIN D, ERLANDSON M, GILLOTT C, HOU X, COUTU C, HEGEDUS D D. A chitin deacetylase and putative insect intestinal lipases are components of the(Lepidoptera: Noctuidae) peritrophic matrix., 2008, 17(5): 573-585.

[10] CAMPBELL P M, CAO A T, HINES E R, EAST P D, GORDON K H. Proteomic analysis of the peritrophic matrix from the gut of the caterpillar,., 2008, 38(10): 950-958.

[11] ZHONG X W, WANG X H, TAN X, XIA Q Y, XIANG Z H, ZHAO P. Identification and molecular characterization of a chitin deacetylase fromperitrophic membrane., 2014, 15(2): 1946-1961.

[12] SANDOVAL-MOJICA A F, SCHARF M E. Gut genes associated with the peritrophic matrix in(blattodea: rhinotermitidae): Identification and characterization., 2016, 92(2): 127-142.

[13] GANGISHETTI U, VEERKAMP J, BEZDAN D, SCHWARZ H, LOHMANN I, MOUSSIAN B. The transcription factor Grainy head and the steroid hormone ecdysone cooperate during differentiation of the skin of, 2012, 21(3): 283-295.

[14] QUAN X G, LADD T, JUN D, WEN F Y, DOURCET D, CUSSON M, KRELL P J. Characterization of a spruce budworm chitin deacetylase gene: stage-and tissue-specific expression, and inhibition using RNA interference., 2013, 43(8): 683-691.

[15] XI Y, PAN P L, YE Y X, YU B, ZHANG C X. Chitin deacetylase family genes in the brown planthopper,(Hemiptera: Delphacidae)., 2014, 23(6): 695-705.

[16] YU R R, LIU W M, LI D Q, ZHAO X M, DING G W, ZHANG M, MA E B, ZHU K Y, LI S, MOUSSIAN B, ZHANG J Z. Helicoidal organization of chitin in the cuticle of the migratory locust requires the function of the chitin deacetylase2 enzyme (LmCDA2)., 2016, 291(47): 24352-24363.

[17] 趙盼, 張學堯, 劉曉健, 趙小明, 于榮榮, 董瑋, 馬恩波, 張建珍, 張敏. 飛蝗幾丁質脫乙?；傅恼婧吮磉_、親和純化及酶活性. 中國農業科學, 2017, 50(6): 1057-1066.

ZHAO P, ZHANG X Y, LIU X J, ZHAO X M, YU R R, DONG W, MA E B, ZHANG J Z, ZHANG M. Eukaryotic expression, affinity purification and enzyme activity of chitin deacetylase in., 2017, 50(6): 1057-1066. (in Chinese)

[18] 閆曉平, 趙丹, 郭巍, 王偉, 張雅昆, 郜玉杰, 趙坤莉. 美國白蛾幾丁質脫乙酰酶的克隆、表達及酶學性質. 中國農業科學, 2017, 50(5): 849-858.

YAN X P, ZHAO D, GUO W, WANG W, ZHANG Y K, GAO Y J, ZHAO K L. Cloning, expression and enzymatic characterization of chitin deacetylases from., 2017, 50(5): 849-858. (in Chinese)

[19] 于榮榮, 丁國偉, 郭亞平, 馬恩波, 張建珍. 中華稻蝗幾丁質脫乙?；?基因的分子特性和生物學功能. 中國農業科學, 2014, 47(7): 1321-1329.

YU R R, DING G W, GUO Y P, MA E B, ZHANG J Z. Molecular characterization and functional analysis of chitin deacetylase 2 gene in., 2014, 47(7): 1321-1329. (in Chinese)

[20] 丁國偉, 于榮榮, 楊美玲, 馬恩波, 楊靜, 張建珍. 中華稻蝗幾丁質脫乙?；?基因的分子特性及功能. 昆蟲學報, 2014, 57(11): 1265-1271.

DING G W, YU R R, YANG M L, MA E B, YANG J, ZHANG J Z. Molecular characterization and functional analysis of chitin deacetylase 1 gene in(Orthoptera: Acrididae)., 2014, 57(11): 1265-1271. (in Chinese)

[21] WANG S, JAYARAM A S, HEMPHALA J, SENTI K A, TSAROUHAS V, JIN H, SAMAKOVLIS C. Septate-junction- dependent luminal deposition of chitin deacetylases restricts tube elongation in thetrachea., 2006, 16(2): 180-185.

[22] LUSCHNIG S, B?TZ T, ARMBRUSTER K, KRASNOW M A.andencode matrix proteins with chitin binding and deacetylation domains that limit tracheal tube length in., 2006, 16(2): 186-194.

[23] YU H Z, LIU M H, WANG X Y, YANG X, WANG W L, GENG L, YU D, LIU X L, LIU G Y, XU J P. Identification and expression profiles of chitin deacetylase genes in the rice leaf folder,., 2016, 19(3): 691-696.

[24] KARIU T, SMITH A, YANG X, PAL U. A chitin deacetylase-like protein is a predominant constituent of tick peritrophic membrane that influences the persistence of Lyme disease pathogens within the vector., 2013, 8(10): e78376.

[25] Liu X J, Li F, Li D Q, Ma E B, Zhang W, Zhu K Y, Zhang J Z. Molecular and functional analysis of UDP--acetylglucosamine pyrophosphorylases from the migratory locust,., 2013, 8(8): e71970.

[26] ZHANG J, ZHU K Y. Characterization of a chitin synthase cDNA and its increased mRNA level associated with decreased chitin synthesis inexposed to diflubenzuron., 2006, 36(9): 712-725.

[27] LIU W, XIE Y, XUE J, GAO Y, ZHANG Y, ZHANG X, TAN J. Histopathological changes ofinfected by., 2009, 101(2): 96-105.

[28] ZHAO Y, PARK R D, MUZZARELLI R A. Chitin deacetylases: properties and applications., 2010, 8(1): 24-46.

[29] CHAPMAN R F.. New York: American Elsevier, 1998.

[30] DONG B, MIAO G X, HAYASHI S. A fat body-derived apical extracellular matrix enzyme is transported to the tracheal lumen and is required for tube morphogenesis in., 2014, 141(21): 4104-4109.

（責任編輯 岳梅）

Molecular Characterization and Biological Function of Chitin Deacetylase Genes in

YU RongRong1 2, DING GuoWei1 2, LIU WeiMin1, ZHANG Min1, ZHAO XiaoMing1, HAN PengFei1, MA EnBo1, ZHANG JianZhen1

(1Research Institute of Applied Biology, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

【Objective】Chitin deacetylase (CDA) is a key enzyme involved in chitin metabolism. The objective of this paper is to study the molecular characteristics and biological function of chitin deacetylase genes in, and to provide a theoretical basis for screening novel targets for pest control.【Method】Based on the transcriptome of, three cDNA sequences putatively encoded LmCDAs were obtained, and the gene structure was analyzed by comparing with the locust genome database. Alignment was performed with the CDAs fromand the functional domains were predicted by BlastP and SMART software. The homologous sequences from,,,,andwere selected to perform clustering analysis with LmCDA4, LmCDA5a and LmCDA5b, and phylogenetic tree was constructed by using Mega 5.02 software with the neighbor-joining (NJ) method. The RT-qPCR was applied to detect the relative expression ofandandduring the molting process of. The chitin content was detected by chemical method. The transmission electron microscope (TEM) was applied to study whether theandhave effects on the cuticle structure.【Result】The three full length cDNA sequences putatively encoded chitin deacetylase were identified from locust transcriptome database. The bioinformatics analysis showed that they possess the signal peptide, the open reading frame contains two functional domains:chitin binding domain (ChBD) and chitin deacetylase catalytic domain (CDA). Alignment with the CDAs fromshowed that partial sequences of two CDAs fromwere different, and the splicing sites are similar to two alternatively spliced variants offrom, which indicated two CDAs were alternatively spliced variants. The phylogenetic analysis showed that three LmCDAs were closely grouped with the CDA4 and CDA5 from other six insect species with high bootstrap value, and named as,and, respectively. Tissues expression pattern showed that bothandwere mainly expressed in the integument, foregut and hindgut. besides,also had a high expression in the fat body. Expression of CDAs in integuments of different days of 5th instar nymph showed that both ofandwere highly expressed in the 1stand 2nd days of 5thinstar nymph, then decreased gradually. After injection of dsand ds, the expression of target gene was significantly reduced at 24 h compared with dsinjected controls, and the silence efficiency of gene was 98.1% and 95.6%, respectively. Phenotypic analysis showed no visible phenotypes were observed and both treatment and control insects could molt to adult successfully. Chitin content detection and TEM observation suggested that silencing the expression of bothanddid not affect the chitin content and chitin organization.【Conclusion】andare highly expressed in the integument, foregut and hindgut. Biologic functional analysis suggested both of them are not essential in the molting process of, silencing of their expression showed no effect on locust development and cuticle structure.

; chitin deacetylase; tissues; days; phenotype; chitin content and organization

2016-12-01；接受日期：2017-03-27

國家自然科學基金（31672364）、山西省基礎研究計劃（2015011070）、山西省回國留學人員科研資助項目（2015-007）、山西省高等學?？萍紕撔马椖浚?017104）、山西省研究生優秀創新項目（02180114092041）

于榮榮，Tel：0351-7016102；E-mail：yurrong@163.com。通信作者張建珍，Tel：0351-7017098；E-mail：zjz@sxu.edu.cn