龍眼漆酶基因(DlLac)的克隆及表達分析

帥 良,趙昱清,+,廖玲燕,宋慕波,朱東建,蔡 文,段振華,吳振先,韓冬梅

(1.賀州學院食品科學與工程技術研究院,廣西賀州 542800;2.華南農業大學園藝學院，廣東省果蔬保鮮重點實驗室,廣東廣州 510642;3.廣東省農業科學院果樹研究所，農業部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室,廣東廣州 510640)

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龍眼漆酶基因(DlLac)的克隆及表達分析

帥 良1,2,趙昱清1,2,+,廖玲燕1,宋慕波1,朱東建1,蔡 文1,段振華1,吳振先2,*,韓冬梅3,*

(1.賀州學院食品科學與工程技術研究院,廣西賀州 542800;2.華南農業大學園藝學院，廣東省果蔬保鮮重點實驗室,廣東廣州 510642;3.廣東省農業科學院果樹研究所，農業部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室,廣東廣州 510640)

以‘石硤’龍眼為試材,采用RT-PCR結合RACE技術成功克隆一個龍眼漆酶基因全長cDNA序列,命名為DlLac,NCBI登錄號為KY051551。DlLac基因序列全長1898 bp,編碼576個氨基酸,NCBI比對結果顯示其與荔枝漆酶氨基酸序列同源性最高,高達94%;進化樹結果顯示龍眼漆酶氨基酸序列與荔枝漆酶氨基酸序列具有高度同源性。氨基酸保守序列結果表明龍眼漆酶氨基酸序列含有漆酶的3個典型保守結構域,分別為:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2。結合龍眼果實在常溫、低溫貯藏條件下,果皮褐變與DlLac的表達關系,推測DlLac的上調表達可能對龍眼果皮褐變起促進作用。

龍眼,漆酶,果皮褐變,基因克隆,表達

龍眼(DimocarpuslonganLour.)是我國南方重要的優勢特色水果之一,主產于福建、廣東、廣西和臺灣等省。果實成熟于盛夏高溫季節,采收后果實生理代謝旺盛,極易發生果皮褐變而嚴重影響產品的貯運和商品價值[1-2]。研究表明,果皮酶促褐變是引起龍眼果實褐變的最主要原因,其中酚類物質氧化酶在酶促褐變中起著至關重要的作用[3]。酚類氧化酶大體上可以分成兒茶酚氧化酶和漆酶兩大類,兒茶酚氧化酶又稱為多酚氧化酶。它與漆酶的主要區別在于,兒茶酚氧化酶可以將多種酚類物質氧化成醌類,而漆酶僅能將對苯二酚氧化成對苯醌[4]。

漆酶(laccase,LAC),最初是從日本漆樹的汁液中分離得到,因而得名漆酶,是一種含銅的多酚氧化酶,屬于多銅氧化酶家族和銅藍氧化酶蛋白家族中的一員,廣泛存在于真菌、細菌、昆蟲和植物中[5-6]。研究人員已經在植物、真菌、昆蟲和細菌中都發現了漆酶[7-10]。目前,研究最多的是真菌漆酶,其在真菌的形態發生、病原體-宿主互作、逆境防御及木質素降解等過程中起著重要作用[11]。植物漆酶的研究相對較少,人們認為植物漆酶在參與細胞壁的形成、酚類物質的氧化、木質素化和去木質素化等過程起著重要作用[12]。劉保華等在荔枝果皮上的研究發現,荔枝漆酶基因在果實采后貯藏過程中前期呈上調表達,推測其可能起促進褐變的作用[7]。Fang等通過對荔枝的研究發現,荔枝漆酶在果皮褐變中起著降解花色素苷的作用,由此推知,漆酶在荔枝果皮褐變中起促進作用[13]。而有關龍眼漆酶與龍眼果皮褐變之間的關系至今未見報道。本研究通過設計兼并引物,以龍眼果皮為材料,克隆龍眼漆酶基因,并對其序列特征進行分析,探討龍眼果皮褐變與漆酶基因表達之間的關系,為進一步揭示龍眼果皮褐變奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘石硤’龍眼 廣東省農業科學院果樹研究所種質資源圃。采收后,選擇成熟度均勻一致,無病、蟲、傷、褐的龍眼果實于施?？巳芤褐薪? min,取出晾干。其中常溫(20±1) ℃貯藏用塑料小托盤包裝封膜,每盤裝20個果,每次取3盤作為三個重復,每2 d取樣一次;低溫貯藏(4±1) ℃ 用0.03 mm聚乙烯袋包裝貯藏在冷庫,每袋裝25個果,每次取3袋作為三個重復,每8 d取樣一次。取樣時,將果皮和果肉分開,液氮冷凍,錫箔紙包好,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

Amp、X-gal、IPTG、氯化鈉、氯化鈣、四硼酸鈉、硼酸、磷酸鈉、LB培養基等試劑 上海生物工程有限公司;RNAOUT試劑盒 北京華越洋生物科技有限公司;瓊脂糖、大腸桿菌感受態細胞、TaKaRa PCR Amplification kit、PMD 20-T Vector kit、TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、TaKaRa Gel DNA Purification Kit Ver2.0 TaKaRa公司;M-MLV逆轉錄酶 美國Life公司;SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒 Clontech公司;熒光定量試劑盒 德國Roche公司。

RS232C型分光光度計、5810D型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司;BS224S型電子分析天平 德國Sartorious公司;Milli-Q-B超存水系統 美國Millipoe公司;PTC-200型PCR儀 美國MJ Research公司;羅氏LightCycler? 480熒光定量PCR儀 德國Roche公司;702Rell超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司;T2A型凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內果皮褐變指數的評定 參照林河通等的方法,略有改動[14]。每次隨機取20個果,根據內果皮褐變程度分為5個等級。0級果:內果皮無明顯褐斑;1級果:褐變總面積小于1/4;2級果:褐變總面積達果皮總面積1/4～1/2;3級果:褐變總面積達總面積1/2～3/4;4級果:褐變總面積占內果皮總面積的3/4以上,或者長霉。重復3次。

內果皮褐變指數=∑(褐變級數×該級果數)/總果數

1.2.2 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 本實驗采用北京華越洋超快型植物RNAOUT試劑盒提取龍眼果皮的總RNA。以純度合格且已經去除基因組DNA的RNA為模板,按TAKARA cDNA合成試劑盒操作步驟先合成cDNA第一鏈,反轉錄酶采用Reverse Transcriptase M-MLV,使用Random Primer,cDNA的合成參照說明書的方法進行,-40 ℃保存,用于漆酶基因cDNA的克隆。

1.2.3 龍眼DlLac基因片段的克隆 依據GenBank上已經報道的其它物種的中性轉化酶基因序列,設計簡并引物DlLac-For和DlLac-Rev(表1)。以cDNA為模板進行PCR擴增,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段,切膠,回收,連接轉化,測序。通過去載體分析所擴增的片段。

1.2.4 龍眼DlLac基因3′-RACE和5′-RACE的克隆 根據所得到的片段序列,利用Primer Premier 5.0軟件,參照TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒要求設計3′-RACE引物3′-RACE-Outter-DlLac和3′-RACE-Inner-DlLac,按照Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒要求設計5′-RACE引物5′-Race-DlLac(表1),嚴格按照說明書進行后續PCR擴增,目的基因片段回收、連接、轉化、鑒定、測序及結果分析同上。

1.2.5 龍眼DlLac基因全長的獲得及ORF驗證 將上述獲得的3′-RACE和5′-RACE結果序列和片段序列采用ContigExpress軟件進行拼接,獲得DlLac基因全長cDNA序列,通過使用NCBI的Blast和SIB的翻譯工具(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)進行序列分析,找出基因全長序列的開放閱讀框(ORF),設計ORF序列引物DlLac-ORF-For和DlLac-ORF-Rev,對ORF序列進行克隆,檢測,以確定所拼接的序列為正確的基因序列(表1)。

1.2.6 龍眼DlLac基因的生物信息學分析 使用NCBI上的ORF(開放閱讀框)Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具查找基因的ORF;使用SIB(Swiss Institute of Bioinformatics)的(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)對ORF進行翻譯;蛋白質分子量及理化性質分析采用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)工具分析;使用NCBI上的Blastn和Blastx對序列進行比對分析;同源性及序列多重比較分析使用Clustal X 1.83軟件并用GeneDoc軟件進行美化編輯;運用MEGA 5軟件中的Neighbor-Joining(鄰位相連法,NJ)法構建系統進化樹并進行編輯。

表1 龍眼漆酶基因克隆與表達分析中使用的引物Table 1 Primers used in cloning and expression analysis of DlLac

1.2.7 龍眼DlLac基因表達分析 使用BatchPrimer3在線引物設計工具設計龍眼DlLac基因定量引物DlLac-RT-For和DlLac-RT-Rev。RT-qPCR使用熒光染料為SYBR Green I Master(Roche),儀器為Roche Lightcycler? 480,使用384孔模塊。10 μL擴增體系:cDNA模板1 μL,5 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μL,SYBR Green I Master(Roche)5 μL,ddH2O 3 μL。使用DlActin和DlEF-1a基因作為雙內參進行RT-qPCR分析[15-17]。并用相對定量軟件對PCR結果的熔解曲線和標準曲線進行分析、定量。相對表達量計算采用2-ΔΔCT法,由Roche Lightcycler? 480軟件系統自動分析得出結果。

1.3 數據處理與作圖

使用Microsoft Office 2013軟件進行數據處理和分析,使用Origin 8.5作圖,并使用Adobe Illustrator CS6軟件進行圖形編輯。

2 結果與分析

2.1 龍眼果皮褐變指數的變化

在常溫貯藏和低溫貯藏過程中,龍眼內果皮褐變指數隨著貯藏時間的推移而逐漸升高;常溫貯藏下,內果皮在前2 d褐變指數較低,貯藏2 d后褐變指數迅速升高;低溫貯藏下,內果皮在前16 d中褐變指數較低,表現出較好的貯藏品質,貯藏16 d后褐變指數迅速上升(圖1)。由此可知,低溫可以抑制龍眼內果皮褐變,延長龍眼果實的貯藏時間。

圖1 常溫貯藏和低溫貯藏下果皮褐變指數的變化Fig.1 Changes of longan pericarp browning index during room temperature(20±1) ℃ and low temperature(4±1) ℃ storage

2.2 龍眼DlLac基因的克隆

經測定提取的龍眼總RNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間,OD260/OD230比值均高于2.0[18],說明提取的龍眼總RNA的質量較高,純度和完整性較好。進行反轉錄獲得cDNA。

以龍眼cDNA為模板,使用簡并引物DlLac-For和DlLac-Rev進行PCR擴增,得到一條長度為600 bp左右的片段(圖2A),切膠,回收,連接,轉化,送測序。NCBI比對結果發現,成功克隆了一條長619 bp的漆酶基因片段,命名為DlLac。

根據DlLac基因測序結果設計3′-RACE-Outter-DlLac和3′-RACE-Inner-DlLac引物(表1),按照TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒內的PCR條件進行巢式PCR擴增,電泳檢測后均得到650 bp左右的目的片段(圖2B),片段大小與預期相符合,切膠,回收,連接,轉化,送測序,測序結果分析表明,所獲得的3′末端序列與擴增的片段序列有相應的高度重復的片段,說明DlLac基因的3′末端序列擴增成功。

根據DlLac基因測序結果設計5′-RACE引物5′-Race-DlLac(表1),按照Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒內PCR條件進行擴增,電泳檢測后1100 bp左右的目的片段(圖2C),片段大小與預期相符合,切膠,回收,連接,轉化,送測序,測序結果分析表明,所獲得的5′末端序列與擴增的片段序列有相應的高度重復的片段,說明DlLac基因的5′末端序列擴增成功。

圖2 龍眼DlLac基因序列擴增結果Fig.2 PCR product of DlLac gene from longan注:M:DL2000；1,2號孔道為擴增產物;A:中間片段擴增結果; B:3′端片段擴增結果;C:5′端片段擴增結果;D:ORF序列擴增結果。

根據擴增的DlLac基因片段以及3′RACE和5′RACE結果,使用ContigExpress軟件對片段序列進行拼接,獲得DlLac基因的全長cDNA序列,通過使用ORF Finder對序列ORF進行查找,根據ORF序列設計ORF全長引物DlLac-ORF-For和DlLac-ORF-Rev(表1),用于驗證拼接全長序列的準確性,使用LA Taq酶進行PCR擴增,經電泳檢測后均發現與預測片段大小相一致的條帶,DlLac基因的ORF擴增產物約1800 bp左右(圖2D),切膠,回收,連接,轉化后送測序,測序結果去載體后經Blast比對分析發現,DlLac基因條帶的ORF序列正確,結果表明成功獲得了DlLac基因全長cDNA序列。

圖3 龍眼漆酶氨基酸序列系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of laccase in different plants

2.3 龍眼DlLac基因的生物信息學分析

DlLac基因序列全長1898 bp,包括一個長度為2 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR,ORF長度為1731 bp,編碼576個氨基酸,蛋白質的分子質量為63.87 kDa,等電點為4.87,蛋白質的不穩定系數為34.87,脂溶指數為74.81,其疏水性平均值為-0.164,表明該蛋白為親水不穩定脂溶蛋白,NCBI的登錄號為KY051551,經Blast比對后發現與荔枝漆酶基因(EU527187.2)核苷酸序列同源性最高,達到了94%;氨基酸比對結果顯示,與荔枝(ACB22018.2)漆酶基因推導的氨基酸序列同源性最高,達到了90%。聚類分析結果表明,龍眼漆酶氨基酸序列與荔枝漆酶氨基酸序列聚為一枝(圖3)。由此可知所獲得的序列確為龍眼漆酶基因序列。

通過選取荔枝(ACB22018.2)、美國梧桐(AAB09228.1)和可可(XP_007020214.1)漆酶的氨基酸序列進行保守序列分析,結果發現,龍眼漆酶氨基酸殘基序列含有漆酶的3個典型保守結構域,分別為:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2(圖4)。

圖4 不同植物漆酶氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of different plant laccase amino acid sequences

2.4DlLac在貯藏過程中的表達

由圖5可知,在龍眼果實常溫貯藏過程中,DlLac表達量隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，在貯藏的第8 d達到表達量的最大值。低溫貯藏過程中,DlLac表達量隨著貯藏時間的延長,呈現先下降后上升的趨勢,在貯藏第32 d時表達量達到低溫時的最大值。

圖5 DlLac在貯藏過程中的表達變化Fig.5 Changes of DlLac expression in pericarp during storage

3 結論與討論

漆酶是一種結合多個銅離子的蛋白,是一種含銅的多酚氧化酶,它能催化許多化合物的氧化反應,底物比較廣泛,包括許多與對二酚結構類似的化合物[8]。龍眼果皮中含有大量的酚類物質,且種類繁多,主要包括單寧、沒食子酸、水楊酸、兒茶素、表兒茶素等[19-20]。這些酚類物質是多酚氧化酶的底物,同時也是漆酶的氧化底物。研究表明,植物漆酶能夠氧化表兒茶素、單寧酸及沒食子酸等多酚類物質[21]。由此可知,龍眼果皮中的漆酶能夠導致龍眼果皮褐變。

本研究通過采用RT-PCR結合RACE技術成功克隆了龍眼漆酶基因全長cDNA序列,命名為DlLac,NCBI登錄號為KY051551。DlLac基因序列全長1898 bp,編碼576個氨基酸,比對結果發現與荔枝漆酶基因的氨基酸序列同源性最高,達到了94%。系統進化樹分析發現荔枝漆酶氨基酸序列和龍眼漆酶氨基酸序列具有高度同源性。氨基酸保守序列分析發現,龍眼漆酶氨基酸序列含有漆酶的3個典型保守結構域,分別為:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2。在常溫貯藏下,隨著果皮中DlLac表達量上升,龍眼果皮褐變指數也呈直線上升(圖1和圖5),推測可能原因是隨著DlLac表達上升導致龍眼果皮中漆酶總量及活性上升,使果皮中底物氧化量增加,促進龍眼果皮褐變;低溫貯藏條件下,DlLac表達量先下降后上升(圖5),造成這一現象的可能原因是龍眼果實在剛進入低溫環境時,DlLac表達受到了低溫的抑制,但是隨著貯藏過程的延長,DlLac基因適應了低溫環境,導致在貯藏后期DlLac表達量又呈上升趨勢,從而促進龍眼果皮褐變。結合荔枝漆酶基因在果皮褐變中所起作用和研究結果[7],推測龍眼果實貯藏過程中DlLac基因的上調表達可能促進了龍眼果皮褐變。

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Cloning and expression analysis ofthe laccase gene(DlLac)fromDimocarpuslongan

SHUAI Liang1,2,ZHAO Yu-qing1,2,+,LIAO Ling-yan1,SONG Mu-bo1,ZHU Dong-jian1,CAI Wen1,DUAN Zhen-hua1,WU Zhen-xian2,*,HAN Dong-mei3,*

(1.Institute of Food Science and Engineering Technology,Hezhou University,Hezhou 542800,China;2.College of Horticulture of South China Agricultural University,Guangdong Key Lab ofPostharvest Science of Fruit and Vegetable,Guangzhou 510642,China;3.Institute of Tree Research Guangdong Academy of Agriculture Sciences,Key Laboratory ofSouth Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510640,China)

In the present study,laccase gene cDNA was cloned and sequenced from ‘shixia’ longan cultivar using RT-PCR and RACE,which was named asDlLac. The NCBI numbers were KY051551. TheDlLacgene consists of 1898 bp encoding a polypeptide of 576 amino acids.DlLacgene had the highest homology with the Litchi chinensis(94%)through the NCBI blastn. Amino acids of laccase gene sequence had 3 highly conservative domain structure:Cu-oxidase-3,Cu-oxidase and Cu-oxidase-2. During the normal and cold storage,combining the relationship of pericarp browning andDlLacexpression,it suggested that the laccase gene in pericarp may contribute to the postharvest longan pericarp browning.

Dimocarpuslongan;laccase;pericarp browning;gene cloning;expression

2016-12-02 +并列第一作者

帥良(1986-)，男，博士，講師，研究方向：果品采后生理，E-mail:shuailiang1212@163.com。 趙昱清(1988-)，男，碩士，研究方向：果品采后生理，E-mail：zyq208@163.com。

*通訊作者:吳振先(1971-)，男，博士，教授，研究方向：果品采后生理，E-mail:litchi2008@126.com。 韓冬梅(1973-)，女，碩士，研究員，研究方向：果品采后生理，E-mail:handm2009@qq.com。

國家現代農業產業技術體系(荔枝龍眼)(CARS-33-14)資助；賀州學院博士啟動基金(HZUBS201510);賀州市科技開發項目(賀科攻1541008)；廣西中青年教師基礎能力提升項目(KY2016YB457);廣西特聘專家專項經費；廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地開放課題(2016XGDSHFW02)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0095-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.018