基于指紋圖譜評價麻黃湯中藥物的成分分析研究

余新華 周 虹 邵永生 韓春生 胡永固 姚連清 王 俊 楊 杰

(1 河南省信陽市第三人民醫院,信陽,464000; 2 中國人民解放軍第154醫院,信陽,464000; 3 河南省信陽市中心醫院,信陽,464000)

中藥研究

基于指紋圖譜評價麻黃湯中藥物的成分分析研究

余新華1周 虹2邵永生3韓春生1胡永固1姚連清1王 俊1楊 杰1

(1 河南省信陽市第三人民醫院,信陽,464000; 2 中國人民解放軍第154醫院,信陽,464000; 3 河南省信陽市中心醫院,信陽,464000)

目的:基于指紋圖譜評價麻黃湯中藥物的成分分析,闡釋中藥復方合理配伍的科學內涵。方法:制備混合對照品溶液和麻黃湯水煎液供試品溶液,以流動相為0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈溶液(B);梯度洗脫0～30 min,3%～5% B,30～35 min,55%～95% B,35～40 min,95% B;柱溫40 ℃;流速0.5 mL/min;進樣量5 μL作為色譜條件進行研究,并根據國家藥典委員會提出的中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A進行相似度分析,采用MATLAB軟件進行數據處理和統計。結果:1)各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于5%,表明實驗方法學重復性良好。2)8種對照品組成的混合對照品所得指紋圖譜無干擾峰,基線穩定;所得實際質荷比和計算質荷比誤差小。3)麻黃湯水煎液指紋圖譜分離出31個化合物。4)麻黃湯水煎液藥物成分分析獲得的31種化合物中以第28種2,3,7-三甲基吲哚和第29種乙酸麻黃堿屬于麻黃湯水煎液特殊成分,其余29種均可歸屬于明確藥物來源,所有藥物的化合物實際質荷比和計算質荷比的誤差均在正負100以內,結果為真。結論:麻黃湯水煎液藥物成分分析獲得的31種化合物中以第28種2,3,7-三甲基吲哚和第29種乙酸麻黃堿屬于麻黃湯水煎液特殊成分,其中主要為來源于麻黃的生物堿類成分,來源于桂枝和苦杏仁的有機酸類成分,以及來源于甘草的黃酮類成分。

指紋圖譜;麻黃湯;成分分析;研究

中藥復方是中醫藥理論和中醫方劑學的精髓,目前中藥復方的研究主要集中在“是否有效”以及“療效機制”方面[1-4],近年來隨著研究的深入研究員逐漸向“藥效物質基礎”方面進行探究,中藥復方通過水浸泡、煎煮、熬制,使多種藥物成分共同作用,進而綜合發揮藥理作用治療疾病,與此同時單一味中藥化學成分又是復方發揮藥效作用的重要物質基礎,為復方中藥物的相互作用、相輔相成提供物質基礎[5-8]。麻黃湯是《傷寒論》中太陽癥發汗解表的經典代表方劑,深受古今中醫藥學臨床醫師的推崇,臨床主要用于太陽表癥,幫助機體發汗解表、兼宣肺平喘[9]。然而目前關于麻黃湯中藥物的成分分析較少,由此,本實驗借助指紋圖譜技術,對麻黃湯全方藥物組成成分展開定性研究,初步研究麻黃湯藥效物質組成?，F將結果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 快速液相(美國Agilent公司提供,型號:1200);電子天平(德國Sartorius公司提供,型號:BP121S);離心機(上海安亭科學儀器廠提供,型號:A316);恒溫水浴鍋(北京國華醫療器械廠,型號:HW159)。

1.2 試劑 甲醇和乙腈均為色譜純,均購自Fisher scientific公司,批號分別是LOT:111280和LOT:096328;鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草次酸、桂皮酸對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院,超純水、甘草酸、苦杏仁苷、毛蕊異黃酮、甘草苷對照品均購自于成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 分析樣品 麻黃湯:麻黃、桂枝、杏仁、甘草藥材,以上藥材均有河南省信陽市第三人民醫院中藥房提供。

2 方法與結果

2.1 色譜質譜條件 色譜條件:Agilent SB-C18RRHD(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱展開研究,流動相為0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈溶液(B);精密量取5 μL進樣量,柱溫控制在40 ℃,以0.5 mL/min的流速進行梯度洗脫,梯度洗脫條件如下:0～30 min,3%～5% B,30～35 min,55%～95% B,35～40 min,95% B。質譜條件:電噴霧離子源(ESI),干燥氣(氮氣)流速為6.0 L/min;干燥氣溫度為250 ℃;正離子模式;毛細管電壓、錐孔電壓、RF透鏡電壓分別為4 000 V、-500 V、80.0 V;霧化器壓力100 kPa;掃描范圍為m/z=50～1 200。

2.2 對照品溶液的制備 取已購的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、桂皮酸、苦杏仁苷、甘草酸、甘草苷、甘草次酸、毛蕊異黃酮,分別精密稱取0.0072 g、0.0145 g、0.0291 g、0.0324 g、0.0366 g、0.0374 g、0.0441 g、0.0491 g于10 mL容量瓶中,并用甲醇定容獲得混合對照品母液;再精密移取50 μL混合對照品母液于1 mL容量瓶中,并用甲醇定容獲得混合對照品溶液:其中鹽酸麻黃堿濃度、鹽酸偽麻黃堿濃度、桂皮酸濃度、苦杏仁苷濃度、甘草酸濃度、甘草苷濃度、甘草次酸濃度、毛蕊異黃酮濃度分別的終濃度為36 ng/mL、72.5 ng/mL、145.5 ng/mL,為162 ng/mL、183 ng/mL、187 ng/mL、220.5 ng/mL、245.5 ng/mL。

2.3 供試品溶液的制備 根據《傷寒論》麻黃湯劑量將麻黃、桂枝、苦杏仁和甘草分別浸泡30 min,麻黃先煎20 min,余藥盡入同煎30 min,獲得第1次水煎液;藥渣再加水煎煮30 min,獲得第2次水煎液;合并2次麻黃湯水煎液濾液并定容至500 mL。精密量24 mL麻黃湯水煎液,加入120 mL乙酸乙酯(分析純),將麻黃湯中藥物成分脂溶性部位提取出來獲得下層麻黃湯水煎液;精密量取0.5 mL下層麻黃湯水煎液,選擇甲醇-乙腈(1∶1)混合溶劑2 mL作為提取劑,離心10 min過濾上清液,供試品溶液制備完成,儲存待用。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液,采用薄層層析的方法對麻黃湯進行專屬性試驗,結果顯示供試品溶液選擇水煎劑,以水為溶劑提取麻黃湯水煎液,鑒別結果顯示麻黃湯中麻黃、桂枝、杏仁、甘草均水溶性成分為主。

2.5 線性關系考察 精密取2.2制備混合對照品溶液0.1 μL、0.5 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL,分別編號1～7并連續進樣,以峰面積為Y軸,5 μL進樣濃度為X軸,繪制標準曲線,并根據對照品的回歸方程計算各有效成分在各自濃度范圍內的線性關系;結果顯示線性關系良好。

2.6 中間精密度試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液,依照1.1的色譜條件,連續5次進樣,測試HPLC儀器的精密度;結果顯示精密度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液,依照1.1的色譜條件,連續5次進樣,測試樣品的穩定性;結果顯示穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取同一對照品溶液根據2.2制備的混合對照品溶液,依照2.1的色譜質譜條件,連續5次進樣,測試指紋圖譜方法的重復性。結果表明,各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于5%,表明實驗方法學重復性良好。

表1 大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積精密度結果

2.9 回收率試驗 取6份同一供試品溶液根據1.1制備的供試品溶液,編號A-F并分別加入鹽酸麻黃堿對照品、桂皮醛對照品、苦杏仁苷對照品、甘草酸對照品,計算各有效成分在HPLC中的加樣回收率;結果顯示加樣回收率試驗結果中平均回收率為99.60%,RSD為2.0%,顯示加樣回收率試驗良好。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 混合對照品溶液藥物成分分析 8種對照品組成的混合對照品指紋圖譜如圖1所示,所得指紋圖譜無干擾峰,基線穩定;所得實際質荷比和計算質荷比誤差小。見表2。

圖1 麻黃湯混合對照品溶液指紋圖譜

編號特征離子(m/z)實際質荷比(m/z)計算質荷比(m/z)對照品來源M1148.1368166.3546166.3032麻黃堿麻黃M2148.1257166.2577166.1325偽麻黃堿麻黃M3475.2104459.1657459.0978苦杏仁苷苦杏仁M4256.9875228.3469228.1242甘草苷甘草M5284.9987284.3568284.2594毛蕊異黃酮甘草M6131.0681146.6874146.6287桂皮酸桂枝M7823.2468823.2468823.1986甘草酸甘草M8471.2966471.2966471.2894甘草次酸甘草

2.10.2 麻黃湯水煎液色譜圖 如圖2所示,麻黃湯水煎液指紋圖譜分離出31個化合物。

圖2 麻黃湯水煎液指紋圖譜

2.10.3 麻黃湯水煎液藥物成分分析 麻黃湯水煎液藥物成分分析獲得的31種化合物中以第28種2,3,7-三甲基吲哚和第29種乙酸麻黃堿屬于麻黃湯水煎液特殊成分,其余29種均可歸屬于明確藥物來源,所有藥物的化合物實際質荷比和計算質荷比的誤差均在正負100以內,結果為真。

圖3 麻黃湯水煎液藥物成分化合物結構式

編號實際質荷比(m/z)計算質荷比(m/z)誤差(ppm)化合物來源1148.3245148.29681.35495,6,7,8-四氫-4-甲基喹啉麻黃2190.0566190.049915.67734-羥基-2-喹啉羧酸麻黃3331.1137331.097865.3512小麥黃素麻黃4103.1201103.097262.13652-甲基丁酸杏仁5152.1188152.108070.0313左旋去甲基麻黃堿麻黃6152.1188152.108070.0313左旋去甲基偽麻黃堿麻黃7165.0629165.053653.3546對-香豆酸桂枝8143.3566143.2987-24.3564r-辛內酯杏仁9121.0732121.0612-29.1353苯乙酮麻黃/桂枝10313.3078313.3110-10.5678花生油酸苦杏仁11287.0947287.091219.6875甘草查耳酮B甘草12431.3569431.298549.3498芒柄花苷甘草13137.0567137.0584-10.1237苯甲酸甲酯麻黃14141.0202141.018314.1568香豆酸麻黃/桂枝15122.1025122.093430.1356芐基甲胺麻黃16135.0867135.0968-8.2345苯丙醛桂枝17183.3568183.365431.6642丁香醛桂枝18387.3354387.362186.4531膽甾醇杏仁19229.1325229.2341-86.2100豆蔻酸杏仁20237.3540237.4012-32.9854雌二醇杏仁21132.0834132.103211.6849桂皮醇桂枝22107.0868107.080120.54131,2/3/4-二甲基苯甘草23134.0647134.059768.2135扁桃腈杏仁24153.3541153.354818.6984香蘭素麻黃/桂枝25123.0867123.080170.8647苯乙醇桂枝26137.2416137.2465-32.18872,3,5,6-四甲基吡嗪麻黃27139.3541139.352853.16452-戊基呋喃杏仁28160.1324160.165468.78442,3,7-三甲基吲哚麻黃湯29208.1345208.27862.4339乙酸麻黃堿麻黃湯30285.3310285.321461.1263硬脂酸杏仁31122.0538122.0601-75.7411肟苯甲醛麻黃

3 討論

在麻黃湯藥物提取溶劑的選擇中,考慮到ESI(Electrospray Ionization,電噴霧電離技術)屬于軟電離質譜離子化技術,受試樣品最常用的溶劑是甲醇、水和乙腈[10],本課題組前期研究中在以甲醇、水和乙腈作為提取劑對麻黃湯水煎液進行藥物提取之前,嘗試直接將麻黃湯水煎液高速離心去掉藥渣過濾上清液進樣分析,結果顯示這一方法殘留較多雜質離子等,鑒于UPLC-Q-TOF/MS的高度靈敏性,殘留雜質離子形成了干擾峰影響色譜峰的定性分析。本課題組前期研究中發現在甲醇、水和乙腈中以甲醇-乙腈(1∶1)的提取率最高,分離度最好,雜質離子最少,這一結果與相關研究以甲醇-乙腈(1∶1)作為萃取劑結果相吻合[11-12],由此本實驗以甲醇-乙腈(1∶1)作為麻黃湯水煎液的萃取劑。在指紋圖譜研究中流動相條件至關重要,一般在ESI的研究中其接口多采用同軸夾套液流,接口中的液體常常為甲醇、甲酸-水溶液、乙腈加入不同量的甲酸、或其他銨鹽類緩沖溶液[13-15],本研究結果發現當流動相條件為0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈溶液(B),在混合對照品指紋圖譜中,各對照品的峰形對稱且基線分離度最高最清晰,獲得了獨立清晰的各個藥物色譜峰,即使是對同分異構體化合物如麻黃堿與偽麻黃堿、去甲基麻黃堿與去甲基偽麻黃堿也能夠分離清楚。

在穩定的麻黃湯萃取方法和流動相條件下,本研究進行了多次重復性實驗對方法學的嚴謹性進一步考察,結果表明UPLC-Q-TOF/MS對麻黃湯水煎液藥物成分分離分析方法穩定,由此我們進一步將麻黃湯水煎液供試品溶液進行指紋圖譜分析,結果從麻黃湯水煎液中分離鑒定出31個主要藥物的化學成分,其中23.08%生物堿類成分來源于麻黃,如苯丙胺類生物堿麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿,以及喹啉類生物堿5,6,7,8-四氫-4-甲基喹啉、4-羥基-2-喹啉羧酸等;10.27%黃酮類成分來源于甘草;20.52%有機酸類成分來源于桂枝和杏仁,僅有3.2%是來源于苦杏仁的其主要成分為脂肪酸類。此外,在本次實驗研究中也分離鑒定出第29種乙酸麻黃堿和第28種2,3,7-三甲基吲哚2個麻黃湯配伍后新產生的化合物,這2個化合物可能是麻黃湯復方中特有的成分[16-17]。

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(2016-10-25收稿 責任編輯：王明)

Study on Components of Mahuang Decoction Based on Fingerprint

Yu Xinhua1, Zhou Hong2, Shao Yongsheng3, Han Chunsheng1, Hu Yonggu1, Yao Lianqing1, Wang Jun1, Yang Jie1

(1XinyangThirdPeople′sHospital,Xinyang464000,China; 2The154thHospitalofPLA,Xinyang464000,China; 3XinyangCentralHospital,Xinyang464000,China)

Objective:To analyze the components of Mahuang Decoction based on fingerprint analysis and to explain the scientific connotation of favourable compatibility of Chinese herbal medicine. Methods:The mixed standard solution and Mahuang Decoction sample solution were prepared with the mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution (A)-acetonitrile-0.1% formic acid (B). Gradient elution was 0～30 min, 3%～5% B, 30～35 min, 55%～95% B, 35～40 min, 95% B. Column temperature was set at 40 C and the flow rate was 0.5 mL/min. Sample volume 5 L was set as chromatographic condition and similarity analysis was conducted based on fingerprint similarity evaluation system 2004A proposed by the Chinese Pharmacopoeia Commission. Data processing and statistics were analyzed by MATLAB software. Results:1) The relative retention time and relative peak areaRSDof all spectral peaks were less than 5%, which indicated that the reproducibility of the experimental method was good. 2) Fingerprints of mixed control solution including eight hybrid compositions showed no interference peaks, the baseline was stable and the actual Z and Z error calculation were less. 3) Fingerprint of Mahuang Decoction isolated 31 compounds. 4) In 31 compounds obtained from Mahuang Decoction, 2, 3, 7-3-methylindole and acetic acid ephedrine were special components of Mahuang Decoction and the rest 29 kinds were attributed to specific drug sources. Actual error Z and Z calculated of all drug compounds were±100 and the result was true. Conclusion:In 31 compounds obtained from Mahuang Decoction, 2, 3, 7-3-methylindole and acetic acid ephedrine are special components, which are mainly alkaloids from ephedra, organic acids from bitter almond and cassia twig and flavonoids from licorice.

Fingerprint; Mahuang Decoction; Component analysis; Study

國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2014AA22304)

王俊(1974.12—),女,大學本科,副主任中藥師,信陽市臨床藥學質量控制中心副主任,研究方向:臨床藥物合理應用,E-mail:wjun777@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.045