靈芝菌絲體液態發酵中生物質組分定量的研究

鄧偉偉，丁重陽，夏海鋒，顧正華，張梁，石貴陽(1.江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

靈芝菌絲體液態發酵中生物質組分定量的研究

鄧偉偉1，2，丁重陽1，2，夏海鋒1，2，顧正華1，2，張梁1，2，石貴陽1，2
(1.江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

靈芝全基因組的解析為靈芝代謝網絡模型構建提供了分子生物學基礎，為了獲取靈芝代謝網絡模型所必需的代謝與生物質組分詳細數據，在200 L發酵罐條件下對靈芝進行液體發酵，并對發酵過程中多種物質進行檢測。結果表明:發酵第6天，胞內多糖、胞外多糖及生物量達到最大值，分別為(2.57±0.08)g/L、(0.55±0.01)g/L和(8.45±0.23)g/L。同時確定了不同生物質組成的含量，其中總蛋白(34.02±2.34)%、粗纖維(8.33±0.10)%、總脂質(10.10±0.20)%、DNA(1.11±0.01)%、RNA(3.76±0.01)%、灰分(9.35±0.10)%。通過HPLC和GC-MS完成了氨基酸和脂肪酸絕對定量。在已有的數據基礎上，結合靈芝基因組計算預測出Gln、Asn及8種核苷酸含量，為后續的基于生物信息學的靈芝全局代謝網絡模型的構建、完善與分析以及以此為基礎的靈芝生物活性物質代謝調控的新策略等基礎研究提供有利的數據支撐。

靈芝菌絲體;多糖;生物質組分;液態發酵

靈芝屬于多孔菌目，靈芝科，擔子菌屬，是重要的白腐真菌［1］，含有抗腫瘤、免疫調節和抑制HIV/AIDS等藥理功能的活性物［2］。其中，多糖是靈芝的重要活性成分［3］，早在1989年就有首次提取出靈芝多糖的報道［4］。由于液態發酵更適用于現代生產方式，因此有較多學者關注與利用控制發酵成分和發酵條件提高靈芝多糖的產量［5］。但文獻檢索結果顯示，截止日前尚未有化學合成培養基的靈芝液態發酵放大的報道。生物質組分是微生物重要的組成部分，對于提高靈芝多糖產量和控制多糖活性等方面具有重要意義。目前已有對靈芝生物質的檢測見于報道，如Lv等［6］定量比較靈芝和紫芝子實體中的自由甾醇和自由脂肪酸的含量以及Stojkovic＇等［7］詳細地分析了西班牙靈芝和中國靈芝的化學和生物活性特征，但已有報道只是針對靈芝生物質中的一類或者幾類進行測定，并未有對靈芝生物質全面檢測結果的報道，且靈芝液態發酵菌絲體中生物質組分在實驗室水平和工業化大罐發酵水平方面存在一定的差異。目前關于靈芝多糖生物合成途徑尚不清晰，隨著靈芝基因組注釋的解析［8］，為靈芝多糖生物合成代謝網絡模型構建提供了分子生物學基礎，但是缺乏靈芝在化學成分明確培養基條件下的發酵特性數據以及生物質組分等詳盡實驗數據。

基于以上原因，采用200 L通風攪拌發酵罐，在化學合成培養基條件下探究靈芝液態發酵產胞內多糖和胞外多糖的發酵特性，對靈芝液態發酵中菌絲體的氨基酸、脂肪酸、灰分、粗纖維和總核酸等生物質組分進行定量分析，并結合靈芝基因組信息，對不穩定與不易測定的生物質組分預測，以期為基于生物信息學的靈芝全局代謝網絡模型的構建、完善與分析以及以此為基礎的靈芝生物活性物質代謝調控的新策略等基礎研究提供有利的數據支撐，并為靈芝菌絲體營養價值在化學成分差異方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

靈芝(Ganoderma lucidum)菌株，保存于江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室。

1.1.2 主要試劑

NaOH、濃H2SO4、三氟化硼乙醚、丙酮(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司;Trans Zol Plant試劑盒，TaKaRa公司;十九烷酸甲酯、甲醇、氯仿、正己烷(色譜純)，Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋，醫用恒溫設備廠;超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司;臺式高速離心機，德國Sigma公司;全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司;電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;回轉式恒溫調速搖床，上海新星自動化控制設備成套廠;SHI-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠;真空冷凍干燥機，美國LABCONCN公司;氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司;Agilent100型高效液相色譜系統，Agilent公司;氣相色譜-質譜聯用儀，美國Themo公司;15 L發酵系統(Bio Bench 15ltr)，捷克TENEZ公司;ABEC 200-1型200 L發酵罐系統，美國ABEC公司。

1.2 方法

1.2.1 液態發酵

一級培養基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨5，無氨基酵母氮源5，KH2PO43，MgSO4·7H2O 2。滅菌前將培養基調至pH 6.0，種子及發酵培養基滅菌條件為110℃滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌后加入培養基。

二級、三級培養基以及放大發酵培養基同上，后兩者進行原位滅菌。

從斜面上活化的種子在250 mL三角瓶培養得一級種子，一級種子轉接至500 mL三角瓶培養得二級種子，再轉接到15 L發酵系統培養得三級種子，最后轉入200 L發酵罐系統中發酵，每天取樣測定發酵液中還原糖濃度、胞外多糖(EPS)與胞內多糖(IPS)的產量以及生物量。

1.2.2 還原糖、EPS、IPS和生物量的測定

還原糖測定:采用二硝基水楊酸(DNS)法測定［9］。

EPS提取與測定:將發酵液與95%乙醇以體積比1∶4充分混勻，于4℃冰箱靜置過夜沉降，除棄澄清液，再將其置于烘箱中除去殘余乙醇，沉淀用蒸餾水溶解并定容，最后取一定量的靈芝胞外多糖水溶液，采用苯酚-H2SO4法測定［10］。

IPS提取與測定:將1.0 g樣品加入含有100.0 mL蒸餾水的試管內，于沸水浴中提取3 h，經抽濾后得胞內多糖浸取液。按照EPS的處理方法提取IPS，采用苯酚-H2SO4法測定［10］。

生物量測定:采用冷凍干燥法，將靈芝菌絲體發酵液減壓抽濾，低溫冷凍干燥至恒質量，稱取干燥的靈芝菌絲體質量。

1.2.3 灰分、粗纖維、總核酸、總蛋白和總脂質的測定

灰分測量采用灰分測定國標法［11］。

粗纖維測定采用粗纖維測量國標法［12］。

總DNA測定參照文獻［13］，分光光度法測定DNA含量。

總RNA用Trans Zol Plant試劑盒提取，分光光度法測定RNA含量。

總蛋白采用凱氏定氮法測定［14］:稱取一定質量的干菌絲體置于消化管中，加入消化劑高溫消化至澄清，消化完后加入水混勻。將含2%硼酸溶液三角瓶和消化管置于半自動凱氏定氮儀蒸餾，待三角瓶內溶液冷卻后，用鹽酸標準溶液進行滴定，計算總蛋白所占的比例。

總脂質采用索氏提取法［15］測定:用液氮充分研磨一定質量的干菌絲體成粉末，迅速稱質量后加入三氯甲烷和甲醇溶液(體積比1∶1)，搖勻超聲，靜置、加水混勻、離心，吸取三氯甲烷萃取液，重復上述提取步驟3次，合并粗脂質提取液，提取液中的三氯甲烷用氮氣吹干，低溫冷凍干燥至恒質量，計算粗脂質占菌絲體干質量的比例。

1.2.4 氨基酸的測定

酸水解:稱取一定干質量的靈芝菌絲體加入至水解管中，加入鹽酸溶液充入氮氣后封管于烘箱內酸水解，冷卻至室溫后，加入NaOH溶液中和酸解液，然后加入水定容。過濾離心后的澄清液用于測定靈芝菌絲體酸水解液中17種氨基酸(除色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺外)的含量。

堿水解:步驟同酸水解，加NaOH溶液水解，加入鹽酸溶液中和水解液，用于測色氨酸。

OPA柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測法:Agilent100高效液相色譜系統，Agilent Hypersil ODS柱(5μm，4.0 mm×250 mm)。采用梯度洗脫法，洗脫程序為進液量為1μL，0 min，8%流動相B (80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈，體積比1∶2∶2)+ 92%流動相A(27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃，體積比500∶0.11∶2.5);17 min，50%流動相B+ 50%流動相A;20.1 min，100%B;24 min，100%流動相A;流動相流速為1.0 mL/min;柱溫為40℃;紫外檢測器(VWD)檢測波長338 nm，脯氨酸以262 nm檢測，氨基酸含量以外標法定量。

1.2.5 脂肪酸的測定

將得到的粗脂質用脂肪酸甲酯制備［16］處理得甲酯化脂肪酸，加入十九烷酸甲酯做內標，用于氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀分析。

色譜條件:色譜柱為FAME wax石英毛細管(30 m×0.32 mm×0.25μm)，檢測器為氫火焰離子檢測器(FID)。進樣量1μL，進樣口溫度225℃，檢測器溫度250℃，分流比為10∶1，線速為30 cm/min，衰減16。程序升溫條件為維持柱溫190℃1 min后，以0.3℃/min升至191℃，再以4℃/min升至225℃，維持15 min。采集質量數范圍為50～600 m/z。

2 結果與討論

2.1 發酵產多糖的代謝特性

為了獲取靈芝在化學合成培養基條件下的代謝特性，在200 L發酵罐中進行液態發酵，其殘糖、生物量和靈芝多糖代謝參數變化見圖1。由圖1可知，從發酵第2天至第6天，靈芝迅速消耗碳源且殘糖消耗速率逐漸增大，靈芝菌絲體的生長速率也隨之增大，發酵第6天生物量達到最大，為(8.45± 0.23)g/L。發酵初期，靈芝胞內多糖出現了下降的情況(見圖1(b))，其原因是靈芝菌絲體處于生長適應期，胞內多糖以及胞外多糖基本不合成，且消耗自身的多糖，導致胞內多糖產量下降;進入發酵第2天，靈芝IPS和EPS隨著菌絲體的快速生長不斷被合成，其合成速率也隨之增大，在發酵第6天時，EPS和IPS均達到最大產量，分別為(0.55± 0.01)g/L和(2.57±0.08)g/L，均低于Tang等［17］對靈芝在200 L發酵罐中培養時的多糖產量。

圖1 靈芝菌絲體發酵過程中參數Fig.1 Parameters variation during the fermentated process of G.lucidum mycelium

圖2 靈芝菌絲體液體發酵生長擬合曲線Fig.2 Fitting curve of mycelial growth during the fermentated process of G．lucidum

為進一步了解靈芝的生長代謝特性，對殘糖消耗和生物量進行非線性生長擬合，結果見圖2。由圖2可知，在發酵第65小時時，靈芝的比生長速率μ達到最大值0.113 6 mmol/(g·h)，此時對應的糖消耗速率為7.1 mmol/(g·h)，與李平作等［18］對靈芝液態發酵時的最大比生長速率(μmax=0.12 mmol/(g·h))基本一致。此外，在發酵后期(第6天至結束)，發酵液中的酸度逐漸增大，靈芝生長緩慢甚至受到阻礙。此外，研究還發現，在發酵結束時發酵液的pH很低，靈芝菌絲體發生自溶現象，與Tang等［17］的靈芝液態發酵現象相一致。

2.2 靈芝菌絲體生物質組成定量分析

生物質組分是靈芝重要的物質組成，通常是一些基本的代謝物，如組成蛋白質的20種基本氨基酸，組成核酸的8種核苷酸等，是基于生物信息學的靈芝基因組代謝模型構建的關鍵元素，因此對靈芝在200 L發酵罐培養的發酵菌絲體進行生物質組分定量。

2.2.1 菌絲體粗成分含量分析

菌絲體粗成分含量分析結果如表1所示。表1結果表明，靈芝菌絲體中蛋白質的含量最高，其次為碳水化合物，其含量分別為(34.02±2.34)%和(33.33±2.17)%。Chan等［19］定量檢測靈芝(Ganoderma tsugae var.jannieae CBS-120304)菌絲體中的總蛋白和碳水化合物的含量分別為37%和50%。與之相比，本研究檢測到的靈芝菌絲體中總蛋白和碳水化合物均稍微偏低。Beluhan等［20］檢測了10種藥食用真菌的總蛋白含量為27.95%～38.89%，總碳水化合物含量42.62%～66.78%，總脂質含量1.34%～6.45%，可以看出，靈芝菌絲體總蛋白和脂質的含量與其測定值接近，而靈芝菌絲體中總碳水化合物含量則明顯偏低。Pedneault等［21］同樣檢測了10種藥食用真菌的脂質譜，含量為3.1%～16.0%，本研究測定的脂質含量也處于該范圍內。Stojkovic＇等［7］測得來自中國的靈芝子實體總蛋白(9.93±0.26)%、脂質(3.72±0.00)%和總碳水化合物(78.16±0.21)%，后者含量遠高于靈芝菌絲體。由此可以得出，靈芝與其他藥食用真菌主要在總碳水化合物的含量上存在較大的差異。此前已有藥食用真菌菌絲體生物質組分測定的類似報道，Hadar等［22］定量測定平菇菌絲體中總蛋白含量為(23.30±0.08)%，總脂質(1.50±0.05)%，總碳水化合物為(13.3±0.2)%，總RNA為(1.20±0.06)%，灰分為(5.80±0.14)%。與本研究測定的結果相比，靈芝菌絲體在總蛋白、脂質、總碳水化合物方面明顯高于平菇菌絲體。

表1 靈芝菌絲體中生物量成分Table 1 Biomass composition of G．lucidum mycelium

2.2.2 氨基酸組成分析

在藥食用真菌中，氨基酸是主要的功能化合物，靈芝菌絲體中18種氨基酸含量如表2所示。由于谷氨酰胺和天冬酰胺化學性質不穩定。通過靈芝基因組計算氨基酸比例并結合蛋白質含量進行預測［8］，結果顯示谷氨酰胺和天冬酰胺的含量分別占菌絲體的0.9%和1.18%。許多研究者將一些重要的的氨基酸作為靈芝的營養價值參數，如亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸［23］，本研究中靈芝菌絲體中這些重要氨基酸含有相對較高的含量。

表2 靈芝菌絲體氨基酸組分含量Table 2 Composition and content of amino acids in G．lucidum mycelium

由表2可知:每克靈芝菌絲體中(以干質量計)，必需氨基酸的含量為(91.59±0.93)mg，占總蛋白質含量的39.07%，與Chan等［19］測定的結果接近(39.9%)，然而各氨基酸的含量與之相比卻較低，但明顯高于Beluhan等［20］測得食用真菌氨基酸含量。在各氨基酸組成中，谷氨酸的含量最高，為(40.77±1.17)mg/g，占總蛋白質含量的(17.40± 0.34)%，是其他氨基酸含量的2倍以上。其次是同為酸性氨基酸的天冬氨酸，中性氨基酸總的含量雖高，但各氨基酸的含量卻低。由此可知，靈芝菌絲體中酸性氨基酸組分含量偏高。

2.2.3 脂肪酸組成分析

由前面的實驗結果可知，靈芝菌絲體中脂質的含量較低。有研究報道，在擔子菌中，棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)為主要的脂肪酸組分［24］。本研究測定靈芝菌絲體中的脂肪酸，結果見表3。由表3可知:在每克靈芝菌絲體中(以干質量計)，多不飽和脂肪酸亞油酸(C18∶2)含量高達(16.64±0.20)μg，占總脂肪酸的(65.81±0.45)%，為主要的脂肪酸組分，是其他所測脂肪酸組分總含量的2倍，與Lv［6］、Stojkovic＇［7］和Chan［19］所測結果一致，而Liu等［25］研究發現油酸(C18∶1)為靈芝脂肪酸的主要成分。其次是棕櫚酸(C16∶0)和油酸(C18∶1)，含量分別為(3.19±0.02)μg/g和(2.61± 0.05)μg/g，其他脂肪酸含量則很低。

表3 靈芝菌絲體脂肪酸組分含量Table 3 Constituent and content of FAs in G．lucidum mycelium

由表3可知，在碳原子數為20和22的脂肪酸尚未檢測到，Liu等［25］研究結果顯示，靈芝菌體中可能含有更多脂肪酸成分，可能是由于組分含量較低因而難于檢測。

2.2.4 核酸組分分析

核苷酸是核酸的主要組成物質，是生物質中不可或缺的部分。通過靈芝基因組［8］計算，對靈芝菌體中8種核糖核苷酸含量進行預測，結果見表4。由表4可知，在DNA組分中鳥嘌呤(C)和胞嘧啶(G)含量最高，在細胞干質量中G含量最高，而RNA組分中C和G的含量最高。核酸組成的預測結果為靈芝基因組代謝模型提供了重要數據支持。

表4 基因組計算預測靈芝菌絲體核酸組分Table 4 Nucleic acid composition of G．lucidum mycelium estimated by genome

3 結論

為了獲取靈芝代謝網絡模型所必需的代謝與生物質組分等實驗數據，在化學合成培養基條件下，對靈芝在200 L通風攪拌式發酵罐液態發酵過程中發酵液殘糖、EPS、IPS含量及生物量變化規律進行了研究，結果表明，在發酵第6天，EPS、IPS及生物量達到最高，分別為(0.55±0.01)g/L、(2.57± 0.08)g/L和(8.45±0.23)g/L;對靈芝發酵菌絲體中氨基酸、脂肪酸和粗纖維等化學組分進行了絕對定量，其中谷氨酸和亞油酸分別在蛋白質和脂肪酸組分中具有較高的含量。此外，還結合靈芝基因組預測出了2種化學性質不穩定的氨基酸和8種核苷酸的含量，為后續的基于生物信息學的靈芝全局代謝網絡模型的構建、完善與分析，以及以此為基礎的靈芝生物活性物質代謝調控的新策略等基礎研究提供了有利的數據支撐。

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(責任編輯管珺)

Determination of compounds in mycelium of Ganoderma lucidum in submerged fermentation

DENG Weiwei1，2，DING Zhongyang1，2，XIA Haifeng1，2，GU Zhenghua1，2，ZHANG Liang1，2，SHI Guiyang1，2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The annotation of whole genome from Ganoderma lucidum provides the molecular basis for the establishment of its genome-scale metabolic network.In order to obtain the detailed data of the metabolic and biomass components necessary for constructing metabolic network of G.lucidum，different biomass compounds were analyzed during submerged fermentation of G.lucidum in a 200-L fermentor.The highest production of endopolysaccharides(IPS)(2.57±0.08)g/L，exopolysaccharides(EPS)(0.55±0.01) g/L and biomass(8.45±0.23)g/L were obtained on day 6.Meanwhile，various compounds in myceliumof G.lucidum were determinated and showed as follows:total protein(34.02±2.34)%，crude fibre (8.33±0.10)%，total lipid(10.10±0.20)%，RNA(3.76±0.01)%，DNA(1.11±0.01)%，and ash (9.35±0.10)%.The quantitation of amino acids and fatty acids(FAs)were done by HPLC and GCMS，respectively.Based on obtained data，the contents of Gln，Asn and eight nucleotides were predicted after combining with G.lucidum genome.Gln，Asn and eight nucleotides content were predicted and the results in this study will be beneficial to provide favorable data support for the subsequent construction，refining and analysis of global metabolic model based on systems bioinformatics，and for new strategies for metabolic control of bioactive substances in G.lucidum.

G.lucidum mycelium;polysaccharide;biomass composition;submerged fermentation

TS219

A

1672－3678(2017)04－0015－07

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.003

2016－04－04

國家自然科學基金(31271918)

鄧偉偉(1989—)，男，江西撫州人，研究方向:發酵工學;丁重陽(聯系人)，教授，E-mail:zyding@jiangnan．edu．cn;夏海鋒(聯系人)，副教授，E-mail:hfxia@jiangnan．edu．cn