阿魏蘑與膠紅酵母共培養中促進產漆酶物質的初步研究

郭超林，丁重陽，陸健，顧正華，張梁，石貴陽(1．江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 2．江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

阿魏蘑與膠紅酵母共培養中促進產漆酶物質的初步研究

郭超林1，2，丁重陽1，2，陸健1，2，顧正華1，2，張梁1，2，石貴陽1，2
(1．江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 2．江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

阿魏蘑在液態發酵過程中經膠紅酵母共培養后，漆酶的產量得到提高，但對其起促進作用的物質尚不清楚。本文中，筆者首先考察阿魏蘑和膠紅酵母發酵上清液混合對漆酶酶活測定的影響，發現膠紅酵母并沒有表達漆酶的能力，同時，發酵上清液的混合會導致漆酶酶活的下降。因此，排除了兩種微生物發酵液之間發生的協同或促進作用對漆酶酶活的影響。在分別添加高溫滅活和70℃滅活的膠紅酵母后發現，添加30 g/L的70℃滅活的膠紅酵母，阿魏蘑漆酶酶活增加至6 605 U/L，而高溫滅活未有相應的促進效果。因此，在共培養中促進漆酶合成的活性物質存在于酵母中并對溫度敏感。通過比較70℃滅活膠紅酵母的添加時間和添加量后，在阿魏蘑培養第2天添加50 g/L膠紅酵母獲得最高漆酶產量7 579 U/L。通過研究發現了膠紅酵母中某種對熱敏感的物質促進了阿魏蘑漆酶表達量的提高，此結果對研究漆酶及其他發酵產物在共培養中表達量的提高有重要意義。

漆酶;共培養;促進物質;熱處理酵母細胞;Pleurotus ferulae;Rhodotorula mucilaginosa

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶蛋白家族［1］，被廣泛應用于污廢水處理［2］、生物制漿［3］和染料脫色［4］等領域。在自然界中，白腐真菌是漆酶主要合成菌，但是白腐真菌漆酶產量一般較低，尚不能滿足工業需求?；瘜W誘導［5－6］以及重組表達［7］等方式可以提高漆酶產量，但是當下已發現的有效誘導劑一般價格昂貴或其本身具有毒性［8－9］，后續要進行脫毒處理;重組表達則存在前期投入大、穩定性稍差等問題。近年來，有越來越多的研究者報道了通過微生物共培養來提高漆酶產量［10－13］。相較于前兩種方法，共培養作為一種促進產漆酶的溫和技術，具有廣闊的開發和應用前景。

課題組之前的研究中［14］，發現阿魏蘑與膠紅酵母通過共培養，漆酶酶活達到約8 000 U/L，較單培養提高了1.2倍左右，但促進酶活提高的物質尚不清楚。在本研究中，筆者嘗試從發酵上清液的協同作用、生物量、促進因子等方面的變化，初步探究阿魏蘑與膠紅酵母共培養促進產漆酶的物質與機制，為進一步通過共培養促進產漆酶的研究提供一定的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿魏蘑(Pleurotus ferulae)JM30X與膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JB401，保存于江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室。

1.1.2 培養基

PDA斜面培養基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。用于阿魏蘑菌種保藏。

YPD液體培養基(g/L):蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，pH自然。用于膠紅酵母種子培養。

麩皮基本培養基(g/L):葡萄糖20，玉米粉10，麩皮粉10，K2SO40.174 2，初始pH 9.0。用于阿魏蘑的種子培養和液體發酵培養。

1.1.3 主要試劑

酵母膏、蛋白胨，英國Oxoid公司;葡萄糖、K2SO4等，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司;2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，BBI生命科學有限公司;麩皮粉、玉米粉、馬鈴薯，購自當地市場。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

阿魏蘑種子培養:取2塊0.5 cm2大小的菌塊，接種于80 mL種子培養基中，150 r/min、25℃培養7 d。

膠紅酵母種子培養:用接種環劃取適量膠紅酵母，接種于80 mL YPD液體培養基中，200 r/min、30℃培養48 h。

阿魏蘑單培養:向150 mL基本培養基中加入體積分數3%的種子培養基，150 r/min、25℃培養7 d。

阿魏蘑與膠紅酵母共培養:在阿魏蘑單培養48 h后，接種體積分數3%的膠紅酵母種子，繼續培養5 d。

1.2.2 發酵上清液的制備

阿魏蘑單培養、膠紅酵母單培養、阿魏蘑與膠紅酵母共培養結束后，得到的發酵液在8 000 r/min條件下離心5 min，即可獲得實驗所用的阿魏蘑上清液、膠紅酵母上清液和共培養上清液;需要無菌處理的，再經過0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2.3 生物量的測定

在發酵至第7天分別收獲單培養和共培養菌體，先用粗紗布過濾以除去培養基殘渣和共培養發酵液中的膠紅酵母細胞，然后用濾紙蘸吸水分。獲得的菌絲體置于提前干燥至恒質量的濾紙上，在80℃烘干24 h后再次稱質量。

1.2.4 滅活及熱處理膠紅酵母的獲得

培養并收集大量膠紅酵母菌體，將膠紅酵母在121℃高溫滅菌20 min，即獲得滅活膠紅酵母。通過溫度梯度實驗，研究不同溫度下熱處理1 h膠紅酵母的致死率，以確定能殺死所有酵母的最低溫度。培養并在無菌條件下收集膠紅酵母菌體，然后將膠紅酵母細胞在該溫度下熱處理1 h，即獲得熱處理膠紅酵母。

1.2.5 漆酶酶活測定方法

以ABTS為底物［15］，在1 mL反應體系中，含有880μL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)，100μL終濃度1 mmol/L的ABTS底物和20μL稀釋一定倍數的粗酶液(須使最終的吸光值在0.2～0.8之間)，在30℃下反應5 min后，在420 nm下測定其吸光值(以熱滅活的酶液為空白對照)。定義每分鐘氧化1μmol ABTS底物所需要的酶量為1個酶活單位(U)。酶活按式(1)計算。

式中:A1代表空白對照的吸光值;A2代表反應后的吸光值;t代表反應的時間;ε代表ABTS的摩爾吸光系數，3.6×104L/(mol·cm)。

2 結果與討論

2.1 阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后的酶活水平變化

漆酶的酶活水平除了跟表達量有關外，還受到反應體系中溫度、pH、促進劑和抑制劑等的影響，其中已確定Cu2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子對漆酶的活性有明顯的促進作用［16－17］。之前研究發現阿魏蘑的漆酶活力經與膠紅酵母共培養后提高了約1.2倍，而促進其提高的物質和機制尚不清楚，因此，本文中，筆者首先探究在共培養過程中，兩種發酵上清液之間是否存在協同或促進作用，從而致使漆酶酶活水平的提高。

將阿魏蘑和膠紅酵母發酵上清液按一定的比例混合后，30℃振蕩溫育10 min，測定漆酶酶活變化，結果如表1所示。

表1 阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后的漆酶酶活Table 1 Enzyme activity of supernatant mixture of Pleurotus ferulae and Rhodotorula mucilaginosa

由表1可知:膠紅酵母并不能分泌漆酶，當阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液以不同比例混合后，漆酶酶活隨著加入膠紅酵母上清液體積的增多，混合液的漆酶酶活呈線性降低的趨勢。以上結果說明阿魏蘑與膠紅酵母共培養過程中，并不是兩種微生物發酵液之間發生的協同或促進作用導致漆酶酶活的提高，而應該是膠紅酵母細胞與阿魏蘑菌絲體之間或者是某些物質與阿魏蘑菌絲體之間的相互作用，最終促進阿魏蘑漆酶表達量的提高。

2.2 單/共培養過程中阿魏蘑生物量的變化

對于組成型的微生物漆酶，其表達量一般跟漆酶生產菌的生物量呈正相關的關系。將阿魏蘑菌體干燥后稱質量，得到單培養時阿魏蘑菌體干質量為15.1 g/L，共培養時阿魏蘑菌體干質量為14.3 g/L。即共培養時阿魏蘑菌體質量并沒有增加，且較單培養略少，但相差不大。結果說明共培養時漆酶產量的提高不是阿魏蘑生物量增加所致，推斷有可能是培養體系中的某些活性物質作用于阿魏蘑細胞，促進了其單個細胞表達和分泌漆酶的能力，最終表現為漆酶酶活的提高。

2.3 不同發酵上清液對阿魏蘑產漆酶的影響

將制備的膠紅酵母和共培養發酵上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌，然后在第2天時添加到阿魏蘑發酵培養基中繼續培養5天，發酵完成后進行酶活測定，結果見圖1。由圖1可知，單純添加膠紅酵母上清液會抑制阿魏蘑漆酶的合成，酶活降至2 559 U/L，而添加共培養上清液后，漆酶酶活與阿魏蘑單培養時酶活相近，但也稍有降低，說明在發酵液中不存在促進阿魏蘑產漆酶的物質。因此，膠紅酵母促進阿魏蘑產漆酶的物質可能存在于酵母細胞中。

圖1 添加膠紅酵母與共培養上清液對漆酶酶活的影響Fig.1 Effects of adding the supernatant of coculture and Rhodotorula mucilaginosa on laccase production

2.4 不同溫度滅活的膠紅酵母菌體對阿魏蘑產漆酶的影響

為排除膠紅酵母生長和代謝對阿魏蘑產漆酶的影響，酵母經高溫滅活后添加于單培養48 h的阿魏蘑中，結果如圖2所示。由圖2可知:經高溫滅活的膠紅酵母不同添加量下，漆酶酶活與阿魏蘑單培養酶活相近，并未顯示相應的漆酶產量促進作用。這可能是由于酵母中的共培養促進物質對高溫較敏感，因此應當嘗試在較溫和的溫度下熱處理膠紅酵母一定時間后，再添加至阿魏蘑培養基中，既保證能殺死酵母細胞，又能在一定程度上減少對膠紅酵母菌體中活性物質的破壞。

圖2 添加不同濕質量高溫滅菌膠紅酵母菌體對漆酶酶活的影響Fig.2 Effects of adding different wet weight Rhodotorula mucilaginosa after high temperature sterilization on laccase production

圖3 不同熱處理溫度對膠紅酵母的滅活效果Fig.3 Inactivation effects of different heat-treated temperature on Rhodotorula mucilaginosa

將膠紅酵母菌體分別在55、60、65和70℃下水浴處理1 h后，以平板涂布的方式考察不同熱處理溫度的滅活效果，結果如圖3所示。由圖3可知:經55℃熱處理1 h后，膠紅酵母菌落數減少50%以上，且隨著溫度的升高，菌落數迅速降低，當70℃熱處理1 h后，可以完全實現膠紅酵母細胞的滅活。在70℃下熱處理膠紅酵母1 h后，添加30 g/L的滅活酵母菌體于培養48 h的阿魏蘑，并繼續培養5 d后進行酶活測定，發現漆酶酶活提高至6 605 U/L。此結果表明，在阿魏蘑和膠紅酵母共培養中，阿魏蘑漆酶表達量的提高主要是由于膠紅酵母細胞中的某種活性物質，同時此活性物質對溫度敏感，且高溫下該物質容易失活。之前的研究中也有類似的結果，在L.plantarum NC8與一些革蘭氏陽性菌共培養產細菌素NC8的研究中，發現添加55℃熱處理的革蘭氏陽性菌菌體可以誘導產生細菌素NC8，而添加高溫滅菌和無細胞上清液則不能誘導產生細菌素［18］。

2.5 熱處理膠紅酵母最佳添加時間和添加量的研究

為進一步提高阿魏蘑的漆酶產量，筆者首先研究了70℃熱處理膠紅酵母的添加時間對漆酶產量的影響，結果見圖4。由圖4可知:在不同時間添加30 g/L的酵母后，阿魏蘑繼續培養至第7天后發現，隨著添加時間的往后推移，漆酶酶活呈現先升高后降低的趨勢，在第2天時酶活水平達到最高，漆酶酶活約為6 500 U/L，因此選擇在阿魏蘑培養至第2天進行熱處理膠紅酵母的添加。

圖4 熱處理膠紅酵母添加時間對漆酶酶活的影響Fig.4 Effects of the time of adding Rhodotorula mucilaginosa after heat treatment at 70℃

在阿魏蘑培養至第2天時，向其培養基中添加不同質量的熱處理膠紅酵母，結果如圖5所示。由圖5可以看出，隨著滅活膠紅酵母添加量的提高，漆酶酶活先是呈逐漸升高的趨勢，當添加50 g/L的滅活膠紅酵母菌體時，漆酶酶活達到最高水平，添加量繼續提高時漆酶酶活開始有所下降。最終確定非活性膠紅酵母最佳添加時間為阿魏蘑培養至第2天，添加量50 g/L，漆酶酶活可達到7 579 U/L，約為對照組的2.1倍，基本達到了阿魏蘑與膠紅酵母共培養時的酶活水平。

圖5 熱處理膠紅酵母添加量對漆酶酶活的影響Fig.5 Effects of the amount of adding Rhodotorula mucilaginosa after heat treatment at 70℃

3 結論

阿魏蘑上清液與膠紅酵母上清液混合后，隨著膠紅酵母上清液比例的增加，漆酶活力呈線性降低的趨勢，且共培養后阿魏蘑生物量較單培養略少，因此上清液之間的協同促進作用和阿魏蘑生物量變化都不是致使阿魏蘑漆酶酶活提高的原因。經過70℃熱處理，膠紅酵母菌體對阿魏蘑產漆酶有顯著的促進作用，而經高溫滅菌的膠紅酵母則沒有促進作用，說明膠紅酵母菌體中含有某種能促進阿魏蘑產漆酶的促進因子，且該促進因子是一種對熱不穩定的物質。此外，筆者對70℃滅活膠紅酵母的添加時間和添加量進行了優化，發現在阿魏蘑培養至48 h時，添加50 g/L的熱處理膠紅酵母，漆酶酶活提高至7 579 U/L。研究結果為進一步明確共培養過程中具有促進作用的物質及其促進機制奠定了基礎。

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(責任編輯管珺)

Compound to enhance laccase production in co-culture of Pleurotus ferulae and Rhodotorula mucilaginosa

GUO Chaolin1，2，DING Zhongyang1，2，LU Jian1，2，GU Zhenghua1，2，ZHANG Liang1，2，SHI Guiyang1，2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Laccase production of Pleurotus ferulae was enhanced by the co-culture with Rhodotorula mucilaginosa and the compound enhancing laccase production was not clear．In this study，no laccase activity was detected in R．mucilaginosa culture broth and no enhanced laccase production was found after mixing culture broth of P．ferulae and R．mucilaginosa．Therefore，enhancement of laccase production in coculture was not brought by simply mixing broth of Pleurotus ferulae and R．mucilaginosa．The results showed that the addition of 30 g/L R．mucilaginosa cells heat-treated by 70℃improved laccase production，which was improved to 6 605 U/L，whereas sterilized cells had no influence on laccase production．The possible compound，which was responsible for enhancing effect in co-culture，was sensitive to temperature．After optimizing adding time and adding amount，the highest laccase production wasobtained by adding 50 g/L treated yeast cells to 2-day cultured P．ferulae，which was 7 579 U/L．Depending on this study，some compounds sensitive to temperature enhanced laccase production of P．ferulae and will be investigated in further research.

laccase;coculture;promoting factor;heat-treated cell;Pleurotus ferulae;Rhodotorula mucilaginosa

Q815

A

1672－3678(2017)04－0040－05

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.007

2016－03－31

國家自然科學基金(31571822)

郭超林(1990—)，男，河南周口人，研究方向:發酵工學;丁重陽(聯系人)，教授，E-mail:zyding@jiangnan．edu．cn;陸健(聯系人)，教授，E-mail:jlu@jiangnan．edu．cn