重組質粒pcDNA3.1/C-sis對大鼠FHF的影響

蔡鵬程，元文峰，丁 浩△

(1.南昌大學第二附屬醫院消化內科，南昌 330006；2.樂安縣人民醫院內二科，江西撫州 344300)

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重組質粒pcDNA3.1/C-sis對大鼠FHF的影響

蔡鵬程1，元文峰2，丁 浩1△

(1.南昌大學第二附屬醫院消化內科，南昌 330006；2.樂安縣人民醫院內二科，江西撫州 344300)

目的 探討重組質粒pcDNA3.1/C-sis導入大鼠對暴發性肝功能衰竭(FHF)的影響。方法 利用流體力學的方法將重組質粒pcDNA3.1/C-sis導入大鼠肝臟，48 h后用內毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)誘導大鼠FHF；利用熒光定量PCR及蛋白質印跡法(Western blotting)檢測C-sis表達；利用蘇木精-伊紅(HE)染色及測定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性檢測凋亡；利用Western Blotting檢測Bcl-2和Bax的表達變化；計算大鼠24 h觀察期內的死亡率。結果 FHF+C-sis質粒組的C-sis mRNA和蛋白表達水平較正常對照組和FHF+空載質粒組明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。與正常對照組相比，FHF+林格液注射組和FHF+空載質粒組肝臟細胞凋亡增多；與FHF+空載質粒組相比，FHF+C-sis質粒組肝臟細胞凋亡減少。與正常對照組相比，FHF+林格液注射組大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達增多(P<0.01)；與FHF+空載質粒組相比，FHF+C-sis質粒組大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達減少(P<0.05)。與正常對照組相比，FHF+林格液注射組大鼠肝臟組織中Bcl-2表達明顯減少(P<0.01)，Bax表達明顯增多(P<0.01)；而與FHF+空載質粒組相比，FHF+C-sis質粒組大鼠肝臟組織中Bcl-2表達增多(P<0.05)，Bax表達減少(P<0.05)。在24 h觀察期內，正常對照組大鼠均存活，FHF+林格液注射組及FHF+空載質粒組大鼠死亡率分別為70.0%和80.0%；而FHF+C-sis質粒組大鼠僅20.0%死亡。結論 C-sis基因可減弱LPS+D-GalN誘導的大鼠FHF。

原癌基因蛋白質C-sis；重組質粒；大鼠；肝功能衰竭，急性

原癌基因參與調控細胞的正常分裂、增殖、成熟及分化過程，以及組織穩態維持過程的調控[1]。因此，原癌基因對細胞的正常生長及組織修復具有關鍵性作用。而原癌基因C-sis是血小板源生長因子B鏈(platelet-derived growth factor B chain，PDGF-B)的編碼基因[2]，它具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用，并能增強組織修復功能[3]。暴發性肝功能衰竭(fulminating hepatic failure，FHF)是以急性嚴重肝損傷為特征的一種臨床綜合征[4]，缺乏有效的治療手段，病死率很高。所以，需研究其他治療FHF的有效方法。筆者假設C-sis能在受損肝臟組織的修復及FHF的治療中發揮積極作用。為此，本研究將C-sis基因導入大鼠肝臟，并用內毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)誘導大鼠建立FHF模型，檢測大鼠肝臟的凋亡情況，且計算大鼠死亡率，以探索C-sis是否可以成為FHF治療的分子作用靶點，為治療FHF提供新的思路或切入點。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗大鼠購自江蘇常州凱文實驗動物有限公司；空載質粒pcDNA3.1和重組質粒pcDNA3.1/C-sis由本實驗室保存；總RNA快速提取試劑盒購自上海Generay生物；反轉錄試劑盒購自Thermo Scientific Fisher公司；引物購自上海Invitrogen生物公司；qPCR試劑盒購自Tiangen公司；GAPDH的Ⅰ抗購自Bioworld公司，C-sis的Ⅰ抗購自Abcam公司，Bcl-2和Bax的Ⅰ抗購自Santa Cruz公司；DNA相對分子質量標準及蛋白低相對分子質量標準購自上海捷瑞生物工程有限公司；蘇木精購自Sigma公司；免疫組織化學半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及重組質粒的導入 質量(200±10)g的SD大鼠保持每只1籠，于室溫24～25 ℃飼養，每12小時晝夜循環，并能自由獲取食物及水。本研究獲得南昌大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準(編號：研臨審[2013]第42號)。重組質粒pcDNA3.1/C-sis導入大鼠體內是通過流體動力學的方法[5-6]：即大鼠吸入乙醚麻醉后，溶于15 mL林格液的800 μg裸質粒在15 s內被快速注射進入大鼠尾靜脈。

1.2.2 FHF的造模和分組 將大鼠分為4組，每組至少8只大鼠。其中1組設為正常對照組，其余3組大鼠均通過腹腔內注射溶于1 mL無菌生理鹽水的相應質量的LPS和D-GalN(按50 μg/kg LPS+300 mg/kg D-GalN乘以大鼠體質量得出)誘導FHF[7]，再分別用林格液、空載質粒pcDNA3.1和重組質粒pcDNA3.1/C-sis進行預處理(如前所述)，即FHF+林格液注射組、FHF+空載質粒組、FHF+C-sis質粒組。于質粒注射后48 h腹腔內注射LPS+D-GalN。腹腔注射LPS+D-GalN 8 h后，提取肝組織和血液標本。另有40只大鼠如上所述分組，在腹腔注射LPS/D-GalN 24 h后計算動物死亡率。

1.2.3 熒光定量PCR 肝組織總RNA抽提及反轉錄參照說明書操作。C-sis的上游引物5′-ATG ACC CGA GCA CAT TCT GG-3′，下游引物5′-ACA CCT CTG TAC GCG TCT TG-3′；β-actin的上游引物5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游引物5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。PCR反應體系：2×SuperReal premix plus 10 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA(加去離子水稀釋成一致濃度)8 μL。并按如下條件進行PCR擴增：95.0 ℃ 15 min，95.0 ℃ 10 s，60.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 20 s模板閱讀，共39個循環，融合曲線70～95 ℃，增量0.5 ℃ 10 s模板閱讀。最終使用熒光定量PCR分析軟件即BIO-RAD CFX Manager實施計算及分析。

1.2.4 蛋白質印跡法(Western blotting) 用放射免疫沉淀試驗(RIPA)提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質水平，取100 μg獲得的蛋白質進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質。蛋白質轉印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用脫脂奶粉溶液4 ℃封閉過夜；再分別以相應比例稀釋的Ⅰ抗孵育，4 ℃過夜，用Ⅱ抗孵育NC膜2 h，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色照相。采用Quantity One 4.62軟件進行分析,結果以目的條帶/3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的灰度值表示。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測 肝臟組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，然后按4 μm切片，并通過蘇木精和伊紅染色，最終用光學顯微鏡觀察分析。

1.2.6 免疫組織化學檢測Caspase-3活性 將肝臟組織固定，石蠟包埋、切片和脫蠟。切片用內源性過氧化物酶阻斷和滅活后，用Caspase-3的Ⅰ抗(抗體工作濃度為1∶100)孵育，再用相應的Ⅱ抗孵育。切片用DAB染色，最后用蘇木精復染。顯微鏡下觀察，陽性表達呈棕黃色或棕褐色，每張免疫組織化學切片選擇3個不同的視野(×200)觀察，并判讀陽性表達強度和陽性率。染色結果按試劑說明書進行，采用半定量分析方法：評分以染色強度結合陽性細胞數百分比進行乘積[8]。染色強度以多數細胞呈現的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色記為0分，淡黃色或輕微黃色記為1分，深黃色或棕黃色記為2分，棕褐色或黑褐色記為3分。陽性細胞百分比即每張免疫組織化學切片選擇5個不同的視野(×200)觀察，每個視野計數100個細胞中陽性細胞數，計算陽性細胞平均數：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比乘積評分，以陽性細胞百分比與染色強度的乘積進行評分：0分判為陰性，1～6分判為弱陽性，7～12分判為強陽性。

2 結 果

2.1 C-sis表達升高的鑒定 與正常對照組和FHF+空載質粒組比較，FHF+C-sis質粒組的C-sis mRNA(圖1A)和蛋白質(圖1B)表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。

*：P<0.01，與正常對照組和FHF+空載質粒組比較

圖1 熒光定量PCR和Western Blotting檢測大鼠肝臟組織C-sis的表達

2.2 HE染色檢測結果 正常對照組：大鼠肝組織肝細胞結構正常，肝細胞排列緊密，細胞核呈圓形，無脂滴、炎癥、壞死等病變，肝小葉結構正常，肝細胞、血竇圍繞中央靜脈呈放射狀排列；FHF+林格液注射組：可見炎性細胞浸潤，細胞類型以中性粒細胞為主，9只大鼠肝組織內可見散在肝細胞凋亡，1只大鼠

A:正常對照組(n=8,×100);B:正常對照組(n=8,×200);C:FHF+林格液注射組(n=10,×100);D:FHF+林格液注射組(n=10,×200);E:FHF+空載質粒組(n=14,×100);F:FHF+空載質粒組(n=14,×200);G:FHF+C-sis質粒組(n=13,×100);H:FHF+C-sis質粒組(n=13,×200)

圖2 HE染色檢測結果

肝組織廣泛性壞死，肝臟組織結構消失，肝竇內可見大量瘀血；FHF+空載質粒組：可見炎性細胞浸潤，細胞類型與FHF+林格液注射組相同，其中12只大鼠肝組織內可見散在肝細胞凋亡，2只大鼠肝組織廣泛性壞死，肝竇內可見大量瘀血；FHF+C-sis質粒組：肝組織內可見以中性粒細胞為主的小灶性炎，4只大鼠肝細胞凋亡，細胞核固縮，部分細胞結構破壞，1只大鼠肝組織廣泛性壞死，肝竇內可見大量瘀血。具體結果見圖2。

2.3 Caspase-3活性檢測結果 與正常對照組比較，FHF+林格液注射組Caspase-3表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與FHF+空載質粒組比較，FHF+C-sis質粒組Caspase-3表達水平降低，差異亦有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖3。

表1 大鼠肝臟組織中Caspase-3表達比較

*：P<0.01，與正常對照組比較；#：P<0.05，與FHF+空載質粒組比較

A:正常對照組;B:FHF+林格液注射組;C:FHF+空載質粒組;D:FHF+C-sis質粒組

圖3 免疫組織化學法檢測大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達(×200)

*：P<0.01，與正常對照組比較；#：P<0.05，與FHF+空載質粒組比較。A：正常對照組(n=8)，B：FHF+林格液注射組(n=9)，C：FHF+空載質粒組(n=9)，D：FHF+C-sis質粒組(n=9)

圖4 Western Blotting檢測大鼠肝臟組織Bcl-2與Bax的表達

2.4 動物死亡率 24 h觀察期內各組大鼠死亡情況見表2。正常對照組大鼠均存活，FHF+林格液注射組和FHF+空載質粒轉染組24 h內大鼠死亡率分別為70.0%、80.0%；FHF+C-sis質粒組在24 h的觀察期內僅2只大鼠死亡，死亡率為20.0%。

表2 觀察時間內動物死亡情況

2.5 Bcl-2和Bax的表達 與正常對照組比較，FHF+林格液注射組的Bcl-2表達水平明顯降低，Bax表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與FHF+空載質粒組比較，FHF+C-sis質粒組Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

原癌基因能促進正常細胞和組織增殖，并抑制其凋亡，對細胞正常生長及組織修復起到了非常重要的作用。原癌基因C-sis的基本功能是誘導有絲分裂信號向細胞內轉導且能誘導細胞的增殖[9-10]。C-sis編碼蛋白PDGF-B是一種較強的化學誘導劑和促有絲分裂源，能誘導間葉組織來源細胞分裂及增殖，促進血管的再生及創傷愈合[11-12]。以上提示C-sis有誘導細胞增殖與抑制細胞凋亡，從而促進組織修復的功能。因此，筆者假設C-sis可能在受損的肝臟組織修復及針對FHF的治療中起到積極作用。FHF是由多種病因引起的，突然出現大量肝細胞壞死和嚴重肝功能損傷，且在首發癥狀出現后的8周內發生肝性腦病的一種臨床綜合征。其臨床特點為起病急、進展快，肝細胞廣泛壞死，且病情危重、癥狀表現多樣。病毒感染，尤其是乙型肝炎病毒感染為我國FHF最常見病因[13]。當前針對FHF缺乏有效的治療手段，病死率高。所以，仍需研究其他治療FHF的有效方法。本研究結果表明，LPS/D-GalN成功誘導大鼠發生FHF，導致大鼠急性死亡，而C-sis基因表達的上調能抑制FHF誘發的肝臟細胞凋亡，降低大鼠死亡率。這與預期的實驗結果一致，即證實：C-sis基因具有抑制FHF的肝損傷作用。此外，用LPS/D-GalN處理后8 h大鼠才開始出現死亡，所以在LPS/D-GalN處理大鼠后8 h這個時間節點獲取大鼠肝臟。

有研究發現，將人骨髓間充質干細胞移植進入FHF豬體內有助于FHF的恢復[14]。還有研究表明，人骨髓間充質干細胞導入豬的肝臟內，可用于治療D-Gal誘發的FHF[15]。骨髓間充質干細胞及其分泌的分子能誘導FHF大鼠模型的肝細胞增殖并抑制其凋亡，下調巨噬細胞的浸潤，將CD4+T淋巴細胞系統轉換成抗炎狀態，并促進肝星狀細胞死亡，因此能改善FHF的肝損傷程度及肝硬化[16]。由此可見，目前針對FHF治療的研究多數集中在干細胞對受損肝臟的修復方面。干細胞是人體中保留的未成熟細胞，具有分化形成其他細胞和組織器官的潛力，可將其運用于包括FHF在內的多種臟器疾病的治療。然而，首先由于成體干細胞產量很低，難以應用于FHF的治療[17]；其次，當FHF發生時，干細胞的獲取困難；此外，外來的干細胞輸入體內后產生免疫排斥反應限制了干細胞的異體移植。而將C-sis應用于FHF的治療沒有上述問題的限制。

另外，C-sis編碼的蛋白PDGF-B能誘導間葉組織來源細胞分裂和增殖，對于血管再生和創傷愈合具有良好的促進作用[11-12]。PDGFB能刺激人纖維細胞源性外質體釋放，后者能加速糖尿病小鼠潰瘍愈合[18]。有研究使用納米技術制作生物可降解膜，該膜能釋放重組人PDGF-B用于促進糖尿病并發的創面愈合[19]。PDGF-B能誘導血管平滑肌細胞的可溶性環氧化物水解酶表達水平升高，而后者被抑制可明顯減弱大鼠大動脈損傷模型的新生血管形成[20]。以上提示C-sis具有促進上述組織或細胞增殖并抑制細胞凋亡的功能。但C-sis是否能促進肝臟組織或細胞的生長并抑制其凋亡，國內外鮮有相關報道。本研究發現，C-sis基因表達的上調能抑制LPS+D-GalN誘導的FHF大鼠發生肝細胞凋亡，并降低大鼠死亡率，表明C-sis基因具有抑制FHF的肝損傷作用。

綜上所述，C-sis基因可能成為治療FHF的分子作用靶點，為FHF的治療提供了新的可能途徑。而且本研究可為包括FHF在內的肝臟損傷的基因治療提供理論和實踐基礎。

[1]Dunn S，Cowling VH．Myc and mRNA capping[J]．Biochim Biophys Acta，2015，1849(5)：501-505．

[2]Charbonneau M，Lavoie RR，Lauzier A，et al．Platelet-derived growth factor receptor activation promotes the prodestructive invadosome-forming phenotype of synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis[J]．J Immunol，2016，196(8)：3264-3275．

[3]Chen W，Baylink DJ，Brier-Jones J，et al．PDGFB-based stem cell gene therapy increases bone strength in the mouse[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112(29)：E3893-3900．

[4]高莉，石小楓．乙型肝炎相關慢加急性肝衰竭抗病毒治療的研究進展[J]．重慶醫學，2016，45(7)：980-982．

[5]Liu LM，Zhang JX，Wang XP，et al．Pim-3 protects against hepatic failure in D-galactosamine (D-GalN)-sensitized rats[J]．Eur J Clin Invest，2010，40(2)：127-138．

[6]Maruyama H，Higuchi N，Nishikawa Y，et al．High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection[J]．J Gene Med，2002，4(3)：333-341．

[7]Sayed RH，Khalil WK，Salem HA，et al．Sulforaphane increases the survival rate in rats with fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide[J]．Nutr Res，2014，34(11)：982-989．

[8]Kara S，Gencer B，Karaca T，et al．Protective effect of hesperetin and naringenin against apoptosis in ischemia/reperfusion-induced retinal injury in rats[J]，Scientific World J，2014，2014：797824．

[9]Lee JY，Yun M，Paik JS，et al．PDGF-BB enhances the proliferation of cells in human orbital fibroblasts by suppressing PDCD4 expression via up-regulation of microRNA-21[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci，2016，57(3)：908-913．[10]Sun Q，Liu L，Mandal J，et al．PDGF-BB induces PRMT1 expression through ERK1/2 dependent STAT1 activation and regulates remodeling in primary human lung fibroblasts[J]．Cell Signal，2016，28(4)：307-315．

[11]Takahashi J，Orcholski M，Yuan K，et al．PDGF-dependent β-catenin activation is associated with abnormal pulmonary artery smooth muscle cell proliferation in pulmonary arterial hypertension[J]．FEBS Lett，2016，590(1)：101-109．

[12]Jiang Z，Zhong G，Wen L，et al．The role of platelet-derived growth factor-B/platelet-derived growth factor receptor-β signaling in chronic atrial fibrillation[J]．Cardiology，2016，133(4)：242-256．

[13]陳勇，韓小勇．核苷類似物治療乙型肝炎患者發生慢加急性肝衰竭短期預后的生存狀況研究[J]．重慶醫學，2015，44(7)：955-957．

[14]Xin J，Ding W，Hao S，et al．Human bone marrow mesenchymal stem cell-derived hepatocytes Express tissue inhibitor of metalloproteinases 4 and follistatin[J]．Liver Int，2015，35(10)：2301-2310．

[15]Shi D，Zhang J，Zhou Q，et al．Quantitative evaluation of human bone mesenchymal stem cells rescuingfulminant hepatic failure in pigs[J]．Gut，2017,66(5):955-964.

[16]Huang B，Cheng X，Wang H，et al．Mesenchymal stem cells and their secreted molecules predominantly ameliorate fulminant hepatic failure and chronic liver fibrosis in mice respectively[J]．J Transl Med，2016，14：45．

[17]Li J，Tao R，Wu W，et al．3D PLGA scaffolds improve differentiation and function of bone marrow mesenchymal stem Cell-Derived hepatocytes[J]．Stem Cells Dev，2010，19(9)：1427-1436．

[18]Geiger A，Walker A，Nissen E，et al．Human fibrocyte-derived exosomes accelerate wound healing in genetically diabetic mice[J]．Biochem Biophys Res Commun，2015，467(2)：303-309．

[19]Lee CH，Liu KS，Chang SH，et al．Promoting diabetic wound therapy using biodegradable rhPDGF-loaded nanofibrous membranes:CONSORT-compliant article[J]．Medicine (Baltimore)，2015，94(47)：e1873．

[20]Wang Q，Huo L，He J，et al．Soluble epoxide hydrolase is involved in the development of atherosclerosis and arterial neointima formation by regulating smooth muscle cell migration[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2015，309(11)：H1894-1903．

The effect of the recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis on FHF of rats*

CaiPengcheng1,YuanWenfeng2,DingHao1△

(1.DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China；2.theSecondDepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofLe′anCounty,Fuzhou,Jiangxi344300,China)

Objective To explore the effect of the recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis on fulminant hepatic failure (FHF) in rats.Methods 48 h after recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis being imported into rat liver by using the method of fluid mechanics,FHF in rats was induced by endotoxin (LPS)+D-galactosamine (D-GalN).With fluorescence quantitative PCR and Western blotting,C-sis expression was tested.The apoptosis of rat liver was detected by using HE staining and measuring Caspase-3 activity.The expression changes of Bcl-2 and Bax were examined through using Western blotting.The mortality rate of rats was calculated during 24 h observation period.Results Compared with the normal control group and FHF+empty plasmid group,C-sis mRNA and protein expression levels were increased significantly in the FHF+C-sis plasmid group,there were statistically significant differences(P<0.01).Compared with the normal control group,the apoptotic hepatocytes were increased in the FHF+Ringer′s solution injection group and FHF+empty plasmid group;compared with FHF+empty plasmid group,the apoptotic hepatocytes in the FHF+C-sis plasmid group were decreased.Compared with the normal control group,Caspase-3 expression level was increased in the FHF+Ringer′s solution injection group (P<0.01);compared with the FHF+empty plasmid group,Caspase-3 expression level in the FHF+C-sis plasmid group was decreased (P<0.05).Compared with the normal control group,Bcl-2 expression level was decreased significantly (P<0.01),and Bax expression level was increased significantly (P<0.01) in the FHF+Ringer′s solution injection group;compared with the FHF+empty plasmid group,the Bcl-2 expression level was increased (P<0.05),and Bax expression was decreased (P<0.05)in the FHF+C-sis plasmid group.During the 24 h observation period,all rats in the normal control group were alive;the mortality rates of the FHF+Ringer′s solution injection group and FHF+empty plasmid group were 70.0% and 80.0% respectively,while that of the FHF+C-sis plasmid group was only 20.0%.Conclusion C-sis gene could inhibit FHF in rats induced by LPS+D-GalN.

proto-oncogene proteins C-sis；recombinant plasmid；rats；liver failure,acute

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.004

國家自然科學基金資助項目(81300348)；江西省青年科學基金資助項目(20151BAB215006)；江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ150259)；江西省衛生計生委科技計劃項目(20165199)。 作者簡介：蔡鵬程(1990-)，住院醫師，本科，主要從事消化系疾病方面的研究?！?/p>

，E-mail：efydinghao@163.com。

R575.3

A

1671-8348(2017)19-2604-04

2017-02-07

2017-04-12)