孕乳期補充維生素D對仔鼠生長發育及細胞免疫功能的影響

黃利華，胡慶蘭，李偉明，柳國勝，李宜花

(1.廣東省清遠市婦幼保健院科教科 511500；2.暨南大學附屬第一醫院兒科，廣州 510630)

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孕乳期補充維生素D對仔鼠生長發育及細胞免疫功能的影響

黃利華1，胡慶蘭1，李偉明1，柳國勝2，李宜花2

(1.廣東省清遠市婦幼保健院科教科 511500；2.暨南大學附屬第一醫院兒科，廣州 510630)

目的 研究孕乳期補充維生素D(VitD)對仔鼠生長發育及細胞免疫功能的影響。方法 選用120只小鼠依據VitD治療劑量不同分為高、中、低劑量組(各30只)，分別給予VitD滴劑3.44、1.72、0.86 IU，并設置對照組(30只)不給予VitD。觀察幼鼠體質量、外周血25-羥維生素D3[25-(OH)D3]，分別測定細胞免疫功能(遲發性變態反應實驗)、體液免疫功能[包括抗體生成細胞數和半數溶血值(HC50)測定]、單核-巨噬細胞吞噬功能(包括小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗和碳廓清實驗)，并進行T淋巴細胞亞群流式細胞術測定。結果 隨著VitD劑量的增加，子鼠外周血中25-(OH)D3及鈣離子水平逐漸升高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；體質量及體長逐漸增加，各劑量組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，高劑量組、中劑量組足趾腫脹度、吞噬百分率、抗體生成細胞數、血清溶血素HC50均增加，吞噬指數均減低，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨VitD劑量的增加，CD4+、CD8+T淋巴細胞數量和CD4+/CD8+逐漸增加。結論 孕乳期補充 VitD可促進子代小鼠的生長發育，具有增強機體免疫功能的作用。

維生素D；免疫功能；小鼠

維生素D(Vitamin D，VitD)是一類具有生物活性的維生素，其生物學功能表現為維持血鈣磷穩定和保持骨骼的生長。近年來大量研究證實，VitD具有神經內分泌激素功能，可以調節組織細胞的免疫功能[1]。最近學者越來越重視母體VitD狀況對子代生長發育和免疫功能影響的研究。有臨床研究證實，小于胎齡的胎兒其母親孕期VitD水平顯著低于正常人群，這提示母親孕期VitD水平可能與胎兒的生長發育有關[2]。關于不同劑量母體VitD對子代生長發育及免疫功能的影響鮮見文獻報道?；诖?，本研究觀察了母體接受不同劑量VitD干預對小鼠生長發育及細胞免疫功能的影響，從而為VitD的合理使用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 120只清潔級ICR小鼠，8周齡，雄鼠體質量為32～34 g，雌鼠體質量為28～30 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物合格證批號：SCXK(京)2012-0001]。小鼠飼養于第三軍醫大學實驗動物飼養中心，分籠飼養，溫度(20±2)℃，濕度(55±5)%，人工光照，明暗各12 h/d，24 h自由取食和飲水。

1.2 主要儀器與試劑 含小牛血清的細胞培養液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、綿羊紅細胞(SRBC)、補體、雞紅細胞、瑞氏染液、文齊氏液、異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠CD4及CD8( FITC-CD4、FITC-CD8)單克隆抗體(武漢博士德生物有限公司)、25-羥維生素D3[25-(OH)D3]測定試劑盒 (上海生工生物有限公司 )、紫外分光光度儀(美國BD公司)、FAC sort流式細胞儀(美國BD公司)、二氧化碳培養箱(上?；敼?、離心機 (上?；敼?、倒置顯微鏡 (日本Nikon公司)、恒溫水浴鍋、細胞計數板、游標卡尺、全自動生化分析儀等。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將雌鼠分成A、B、C、D 4組，每組30只，A、B、C組分別給予VitD滴劑，A組為高劑量組(VitD滴劑3.44 IU)，B組為中劑量組(VitD滴劑1.72 IU)，C組為低劑量組(VitD滴劑0.86 IU)，D組為對照組不給予VitD。常規飼養3 d后，按雌雄比例2∶1將大鼠合籠，從第2天清晨開始觀察，查到陰栓者單籠飼養，并記錄為孕 0 d。實驗期從孕19 d 至哺乳期第22天，在常規給予普通飼料的基礎上，將上述實驗藥物灌胃。觀察雌鼠的一般情況，至雌鼠分娩期及哺乳第22天，分別測定母鼠、仔鼠各實驗室指標。每組取20只孕鼠于孕18周剖殺，稱量活胎體質量，測量活胎鼠身長，并對胎鼠免疫功能進行評價。

1.3.2 外周血25-(OH)D3及鈣離子水平檢測 分娩期與哺乳第22天分別抽取母鼠、仔鼠鼠尾靜脈血，于30 min內，3 500 r/min離心5 min，采用放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)檢測外周血25-(OH)D3水平，步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作。采用全自動生化分析儀測定血鈣水平。

1.3.3 細胞免疫功能檢測 采用足跖增厚法，每只子鼠靜脈注射0.2 mL 2%(v/v)SRBC。免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20 μL 20%(v/v)SRBC，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。

1.3.4 小鼠體液免疫功能檢測 采用腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞及碳廓清實驗方法：給子鼠腹腔注射1%的雞紅細胞懸液1 mL，然后處死小鼠，用毛細吸管吹吸混勻腹腔內液體，制作涂片，瑞氏染液染色5 min。計數巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況，計算吞噬百分率。吞噬百分率=吞噬有雞紅細胞的巨噬細胞數/總巨噬細胞數。按0.1 mL/10 g劑量給于小鼠墨汁，注入墨汁后2、10 min分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加入到體積總數為3 mL的0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度計在600 nm波長測定的吸光度(A)值，以0.1%Na2CO3溶液作空白對照。k=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)。

1.3.5 小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能檢測 采用半數溶血值(HC50)和抗體生成細胞數測定方法：小鼠處死后無菌條件下取出脾臟，制成細胞懸液，2 000 r/min離心15 min，加入裂解液裂解紅細胞，反復離心去除血小板。用培養液調整細胞濃度為5×106/mL。取1 mL細胞懸液，加入10%SRBC 0.5 mL，補體1.00 mL，設生理鹽水為空白組。37 ℃水浴30 min，冰浴終止反應。分光光度儀測定A值。將小鼠血清1.00 mL，5%SRBC 0.50 mL，補體1.00 mL混合，另設生理鹽水為空白組。37 ℃水浴30 min，冰浴終止反應，2 000 r/min離心15 min，取上清液1.00 mL加文齊氏液3.00 mL，靜置10 min，分光光度儀測定A值。另取5%SRBC 0.25 mL，加入文齊氏液4 mL，分光光度儀測定A值，即為實驗中所用SRBC半數溶血時的A值。血清溶血素HC50=(樣品的A值/SRBC半數溶血時的A值)×稀釋倍數。

1.3.6 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群變化 制備淋巴細胞懸液1×106/mL，分別加入FITC-CD4、FITC-CD8單克隆抗體20 μL。4 ℃溫浴30 min。PBS溶液洗滌3次，采用流式細胞儀檢測陽性率。

2 結 果

2.1 一般情況 各劑量組吸收胎數、平均每窩吸收胎數與對照組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)；而各劑量組死胎數和平均每窩死胎數均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著VitD注射劑量的增加，子鼠外周血中25-(OH)D3及鈣離子水平逐漸升高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

*：P<0.05，與對照組比較

圖1 各組小鼠外周血25-(OH)D3及鈣離子水平比較

2.2 VitD對子鼠體質量及體長的影響 與對照組比較，各劑量組子鼠的體質量及體長均不同程度的增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著VitD劑量的增加，體質量及體長逐漸增加，各劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 VitD對子鼠體質量及體長的影響

*：P<0.05，與對照組比較

2.3 VitD對遲發型變態反應及吞噬功能的影響 與對照組比較，高劑量組、中劑量組足趾腫脹度、吞噬百分率均增加，碳廓清實驗吞噬指數均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨VitD劑量的增加，足趾腫脹度、吞噬百分率逐漸增加，吞噬指數逐漸減低，各計量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 VitD對小鼠遲發型變態反應及吞噬功能的影響

*：P<0.05，與對照組比較

2.4 VitD對體液免疫功能的影響 與對照組比較，高劑量組、中劑量組抗體生成細胞數、血清溶血素HC50均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨VitD劑量的增加，抗體生成細胞數、血清溶血素HC50逐漸增加，各劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 VitD對小鼠抗體生成細胞數的影響

*：P<0.05，與對照組比較

2.5 VitD對T淋巴細胞亞群的影響 與對照組比較，各劑量組CD4+、CD8+T淋巴細胞數量和 CD4+/CD8+升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨VitD劑量的增加，CD4+、CD8+T淋巴細胞數量和CD4+/CD8+逐漸增加，且高劑量組增加較為明顯，見表4。

表4 VitD對小鼠T淋巴細胞亞群的影響

*：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

VitD作為一種微量元素，可以促進鈣從腸道內吸收?；钚訴itD完全缺乏的小鼠具有明顯的低血鈣現象。除了調節鈣磷平衡和骨代謝作用外，其在胚胎和胎兒發育過程中發揮著至關重要的作用，眾所周知，胚胎與胎兒發育所需VitD主要通過胎盤由母體轉運到胎兒循環，因此孕乳期補充VitD對子代的生長發育具有決定性作用[3]。本次實驗筆者觀察了孕前和孕期母體補充VitD對胎鼠生長發育的影響，同時本次實驗設置了3種劑量的VitD3，分別為高劑量組(VitD滴劑3.44 IU)、中劑量組(VitD滴劑1.72 IU)、低劑量組(VitD滴劑0.86 IU)，對大鼠進行為期4周的補充干預。結果顯示，隨著VitD注射劑量的增加，子鼠外周血中25-(OH)D3及鈣離子水平逐漸升高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。進一步觀察發現，與對照組比較，各劑量組子鼠的體質量及體長均不同程度的增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，隨著VitD劑量的增加，體質量及體長逐漸增加。這些結果提示，母體補充VitD對維持子代的正常生長發育起到至關重要的作用。對于VitD在維持胎兒生長發育中的機制，有大樣本的調查提示VitD缺乏能夠引起HIV-肺結核混合感染者的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平顯著性升高[4]。動物實驗結果發現，VitD通過下調Toll樣受體下游的酪氨酸蛋白激酶-1/信號轉導激活轉錄因子-3(JAK1/STAT3)信號通路，來抑制TNF-α的產生[5]。另外研究表明，TNF-α與胎兒生長發育遲緩密切相關。故筆者認為，孕期VitD可能通過一定的通道引起子代TNF-α改變，進而影響胎兒的生長發育，導致生長發育遲緩[6]。

VitD作為一種新型的免疫調節激素，在細胞免疫調節中發揮著重要的作用，VitD對免疫系統的影響可以從以下幾方面得到證實[7-8]：(1)VitD受體存在于活化炎性細胞中；(2)1,25-二羥基維生素D3[1，25-(OH)D3]可以抑制T淋巴細胞增值；(3)激活巨噬細胞，使之產生1，25-(OH)D3。在T淋巴細胞分類中，CD4具有T淋巴細胞輔助功能，而CD8則抑制、殺傷T淋巴細胞。另外，CD4能產生一些細胞因子協助B淋巴細胞抗體的產生，調節免疫反應的活性，而CD8則可以抑制免疫功能和損傷細胞。CD4/CD8是反映T淋巴細胞活性的重要指標，正常人群其比值相對穩定，比值增加提示免疫增強，反之則減弱[9]。有研究結果表明，VitD缺乏可以降低小鼠外周血白細胞數量，淋巴細胞CD4、CD8陽性率，而對體液免疫(B淋巴細胞)改變不大[10-13]。本次實驗筆者觀察了不同劑量的VitD對T淋巴細胞亞群分化的影響。結果提示，隨VitD劑量的增加，CD4+、CD8+T淋巴細胞數量和 CD4+/CD8+逐漸增加，且高劑量組增加較為明顯。隨后筆者按照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)關于增強免疫功能檢驗方法從細胞免疫、體液免疫等多角度進行了實驗，結果表明，與對照組比較，不同劑量的小鼠足趾腫脹度、吞噬百分率顯著增加，碳廓清實驗吞噬指數顯著減低，抗體生成細胞數、血清溶血素HC50顯著升高。對細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫可能具有增強作用。同時筆者發現，隨著VitD補充劑量的增加，其免疫能力的增加幅度無明顯差異，提示加大VitD補充劑量并不能進一步改善及促進免疫調節作用。

雖然宮內胎兒生長發育遲緩、免疫功能低下與母體微量營養素缺乏密切相關，為圍產期胎兒的VitD補充、減少圍產期并發癥提供了依據。但由于VitD和宮內胎兒發育的相關激素與基因的多重性及生理調控關系微妙，該過程相當復雜。為進一步詳細了解和掌握VitD對宮內發育遲緩的作用機制，控制胎源性成年疾病的發生，提供新思路、新方法，筆者將繼續對VitD在宮內發育遲緩、免疫功能低下中的相關途徑進行研究。

綜上所述，孕乳期補充VitD可以促進仔鼠生長發育，提高子代的免疫功能。因此，孕期可補充足量的VitD添加劑，尤其會為冬季妊娠孕婦帶來更多益處。但加倍補充VitD并不能成比例的增加其效果，尚需進一步確定更為合理的補充劑量，為VitD的合理補充提供科學依據，為臨床及預防應用提供指導。

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Effects of Vitamin D on growth and immune function in neonatal mice*

HuangLihua1，HuQingLan1，LiWeiming1，LiuGuosheng2，LiYihua2

(1.DepartmentofScienceandEducation,MaternalandChildHealthcareHospitalofQingyuanCity,Qingyuan,Guangdong511500,China；2.DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510630,China)

Objective To study the effects of Vitamin D (VitD) supplementation on growth and immune function in neonatal mice.Methods A total of 120 mice were divided into four groups (30 mice in each group) according to dose of VitD.The high-dose group,medium-dose group and low-dose group was given 3.44,1.72,0.86 IU VitD drops,respectively.The control group was not treated with VitD drops.Rat body weight,level of peripheral blood 25-(OH)D3were observed.The cellular immune function (determined by using delayed hypersensitivity reaction experiment),humoral immune function (assessed by antibody producing cells counts and HC50determination) and mononuclear-macrophage phagocytic function (assessed by mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken red blood cells test and carbon clearance test) were detected.The flow cytometry assay was carried out to differentiate T lymphocyte subsets.Results With the increase of dose of VitD,levels of peripheral blood 25-(OH)D3and calcium ion were gradually increased,there were statistically significant differences when compared with the control group(P<0.05);the body weight and body length were gradually increased,while no statistically significant difference was found among the groups treated with VitD(P>0.05).Compared to the control group,the toes swelling,phagocytic percentage,number of antibody producing cells,serum soluble HC50in the high-dose group and medium-dose group were increased significantly,while carbon clearance test phagocytic index were decreased significantly (P<0.05).With the increase of dose of VitD,the number of CD4+,CD8+T lymphocytes and the CD4+/CD8+ratio were gradually increased.Conclusion VitD could promote the growth and development of offspring mice,and enhance the immune function of the body.

Vitamin D；immune function；mice

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.007

清遠市產業技術研究與開發資金項目(2013A014)。 作者簡介：黃利華(1975-)，副主任中醫師，博士，主要從事血液病及其免疫機制方面的研究。

R720.5

A

1671-8348(2017)19-2615-03

2017-02-09

2017-04-14)