微滴式數字PCR技術定量檢測發酵乳中金黃色葡萄球菌

周 巍，李月華，孫 勇，李永波，張 濤，劉 瓊，張 巖,*，王麗霞,*

微滴式數字PCR技術定量檢測發酵乳中金黃色葡萄球菌

周 巍1，李月華1，孫 勇2，李永波1，張 濤1，劉 瓊1，張 巖1,*，王麗霞1,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；2.北京食品科學研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

基于微滴式數字聚合酶鏈式反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術，建立發酵乳中金黃色葡萄球菌定量檢測方法。以金黃色葡萄球菌nuc基因為目的片段設計特異性的引物和探針，優化反應體系，通過活菌提取和ddPCR方法對靶標基因的檢測特異性和靈敏度進行實驗，并對定量結果進行分析。本研究建立了發酵乳中ddPCR技術定量檢測金黃色葡萄球菌的方法，檢測特異性良好，檢測靈敏度為3.3×101CFU/g，定量的偏差率為+10.18%，證明了ddPCR用于絕對定量檢測的可行性，為其他食品污染菌和致病菌標準化控制體系提供有益的示范作用。

微滴式數字聚合酶鏈式反應技術；發酵乳；定量檢測；金黃色葡萄球菌

發酵乳中污染菌和致病菌的質量控制需要精準的檢測技術體系作為支撐，發酵乳因其營養豐富的特性能夠滿足污染菌和致病菌的生長需求，單一的對終產品進行檢測容易造成原輔料等生產資源的浪費，因而增加了生產成本[1-5]。因此，不同生產環節的污染菌和致病菌數量的精準檢測是進行過程質控的關鍵[6-8]。

由林彩琴等[9]提出的數字聚合酶鏈式反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）作為第3代PCR的技術代表[10]，是把一個樣本的反應體系均勻分配到大量反應單元中，每個反應單元中不包含或包含一個到多個目的核酸序列，獨立地進行PCR擴增，檢測每個反應單元的熒光信號，最終根據泊松分布以及熒光信號陽性的反應單元數量占所有反應單元的比例來計算目的核酸序列的拷貝數，dPCR中熒光信號的產生過程基本與實時定量PCR相同[11]。微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）技術是利用油包水原理完成微滴信號檢測，具有應用范圍廣、操作簡便等特點[12-15]，目前，該技術已經在稀有突變檢測、動植物源性成分檢測、病原菌檢測、基因拷貝數變異分析和復雜樣本基因表達檢測等方面廣泛應用[16-25]。

本實驗旨在將ddPCR技術應用到發酵乳中常見污染菌和致病菌的檢測體系構建中，利用死細菌去除方法，結合ddPCR技術的精準定量，開發出發酵乳中污染菌和致病菌的檢測方法，為發酵乳生產企業的過程控制提供必要的技術保障，也為ddPCR技術在其他污染菌和致病菌檢測中推廣應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵乳 市購；實驗采用菌株詳見表1。所有菌株采購到貨后首先用各自的指示培養基進行活化，在適宜的溫度條件下培養，轉接傳代3 次后備用。

表1 實驗用菌株Table 1 Strains tested in this study

2×探針法數字PCR預混液、微滴發生專用油、微滴分析專用油 德國Bio-Rad公司；細菌處理液（Reagent D）、磁珠法提取細菌DNA試劑盒 美國Biotecon Diagnostics公司；引物（正向引物，反向引物）、探針由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器與設備

QX200 Droplet Reader、DG8 cartridge微滴生成卡、Holder微滴發生器、PCR基因擴增儀 伯樂生命醫學產品有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計、711全自動DNA提取儀 美國Thermo公司；1-14臺式高速離心機美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 活菌基因組的提取

1.3.1.1 Reagent D處理細菌培養液

將傳代3 次后的細菌培養液充分搖勻，吸取100 μL細菌培養液加入到2 mL的滅菌透明離心管中；將Reagent D從-20 ℃取出，室溫25 ℃放置融化，取400 μL的Reagent D溶液加入到上述離心管中，室溫條件下避光培養5 min；將離心管置于低溫離心管架中，放在500 W鹵素燈相距15～20 cm的正下方，曝光培養5 min后，8 000 r/min離心5 min；用移液器小心去除上清液，向離心管中加入100 μL無菌去離子水充分混勻，此菌懸液即可直接用于基因組的提取。

1.3.1.2 Food Proof磁珠提取法

1）取1 mL Reagent D處理后細菌培養液加入至2 mL試管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，添加700 μL的裂解緩沖液以及80 μL的蛋白酶K，65 ℃振蕩水浴30 min，12 000×g離心5 min，準備好上清液用于DNA提取。

2）準備儀器需要的加樣板、反應結合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板，并根據需要使用微量移液器或排式微量移液器將每種板對應的緩沖液添加至需要使用的樣品孔。

3）其中反應結合板每個樣品孔需添加250 μL的反應結合緩沖液和20 μL的磁珠顆粒且2 種液體需吹打混勻；洗滌板Ⅰ每個樣品孔需添加600 μL的洗滌緩沖液Ⅰ；洗滌板Ⅱ每個樣品孔需添加800 μL的洗滌緩沖液Ⅱ；洗脫板每個樣品孔需添加80 μL的洗脫緩沖液。

4）分別移取第1步前處理離心完畢500 μL裂解液轉移至已添加有反應結合緩沖液和磁珠顆粒的反應結合板相應樣品孔。

5）打開儀器電源開關，選擇所需的應用程序（細菌提取選擇MPKⅣ程序）。

6）重復按Start按鈕，根據屏幕指示分別將加樣板、反應結合板B、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板放置到指定位置。

7）當所有平板裝載完畢后，點擊Start按鈕儀器開始運行核酸自動提取程序，大約需要35～40 min。

8）程序運行完畢后，根據儀器屏幕指示開始逐步卸載已經完成核酸提取任務的加樣板、反應結合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板，注意此時DNA已經溶解于洗脫板可用于后續PCR實驗，及時將已經完成核酸提取任務的反應結合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ相應樣品孔的廢液使用微量移液器移除。

9）使用微量移液器將洗脫板上提取的DNA分別轉移至干凈的離心管中定容至80 μL，可直接用于PCR實驗或4～8 ℃保存幾天，或-20 ℃長期保存。

1.3.2 引物設計

金黃色葡萄球菌特異性檢測基因較少，選擇文獻報道較多的nuc基因為靶標基因[26-30]，從GenBank數據庫中公布的已知序列中選取特異性強且相對保守的序列進行引物設計，利用Primer Premier 6.0設計引物探針，并通過Oligo 7.37進行驗證，再進行BLAST在線比對后，經實驗驗證，最終確定上述菌株的引物探針，如表2所示。

表2 引物探針序列Table 2 Primer and probe sequences used in this study

1.3.3 單一污染菌和致病菌ddPCR檢測方法的建立

ddPCR檢測方法：步驟1：配制ddPCR體系，體系為2×探針法數字PCR預混液10 μL，將引物稀釋到10 μmol/L，取1.2 μL上下游引物和0.4 μL探針加入體系，加入4.4 μL的模板，最后用滅菌雙蒸水補足20 μL。步驟2：將充分混勻的PCR體系轉移到微滴發生卡中，并向微滴發生卡中加入70 μL微滴發生專用油，將微滴發生卡放到微滴發生器中進行反應。隨后將生成的微滴轉移到ddPCR的96 孔中，用封膜儀對96 孔板封膜，準備進行PCR。步驟3：ddPCR的反應程序：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火45 s；進行40 個循環，98 ℃延伸10 min。步驟4：ddPCR結束后將96 孔板放入QX200 Droplet Reader儀器中，依次錄入樣品信息，檢測開始后儀器按順序自動識別每個樣品的微滴，在微滴讀取油的配合下微滴依次通過雙色檢測器，根據微滴發出的熒光信號的強度判定陽性和陰性結果，并記錄每個樣品的陽性和陰性的微滴數。信號采集完畢后，采用Quantasoft軟件計算出最終結果并以圖像的形式給出。

1.3.4 ddPCR檢測方法的溫度優化

在設計ddPCR擴增的反應程序時，對ddPCR的退火溫度進行優化。對金黃色葡萄球菌設置退火約為52～63 ℃的溫度梯度ddPCR。根據微滴檢測儀生成的結果篩選出最佳反應溫度。

1.3.5 ddPCR檢測特異性驗證

分別提取表1中所列菌株的純培養物過夜菌液的DNA，將提取的DNA分別稀釋到濃度為103拷貝數，按照分別優化好的反應條件進行金黃色葡萄球菌的特異性驗證實驗。

1.3.6 ddPCR檢測靈敏度

發酵乳分別按照國標法檢測證實沒有被金黃色葡萄球菌污染。將其人工添加到發酵乳中，保證樣品中金黃色葡萄球菌的濃度依次為100～106CFU/g，隨后按照1.3.1節方法完成污染物中細菌的基因組DNA的提取工作，并用ddPCR方法檢測金黃色葡萄球菌污染酸奶的靈敏度。

1.3.7 ddPCR絕對定量

從NCBI上查找出金黃色葡萄球菌nuc相應的靶基因在該菌的全基因組中存在的理論拷貝數，根據ddPCR得出金黃色葡萄球菌的實測拷貝數的結果，計算出20 μL的體系中存在的拷貝數，最終的實測靈敏度和偏差率按公式（1）、（2）計算：

實測靈敏度=20 μL拷貝數×18.18

為了驗證ddPCR檢測方法的可行性，將不同濃度的金黃色葡萄球菌進行ddPCR檢測，分析計數結果與ddPCR檢測結果的線性關系。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測溫度優化結果

圖1 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測溫度優化結果Fig. 1 Optimization of ddPCR annealing temperature for detection of Staphyloccocus aureus

設置金黃色葡萄球菌的PCR程序的退火溫度為55 ℃，梯度差異為5 ℃，擴增反應結束后，將96 孔板轉移到微滴檢測儀中進行檢測，如圖1所示，50.2 ℃時微滴數量和質量都較好，所以金黃色葡萄球菌ddPCR的較適退火溫度為50.2 ℃。

圖2 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測特異性結果Fig. 2 Specificity of ddPCR for detection of Staphyloccocus aureus

2.2 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測特異性結果將表1所列的供試菌株提取DNA后，用金黃色葡萄球菌的引物進行PCR擴增，隨后用微滴檢測儀進行檢測，如圖2所示，3 株金黃色葡萄球菌被檢測為陽性微滴信號，而陰性和其他非金黃色葡萄球菌均未出現擴增，表明設計的金黃色葡萄球菌的引物特異性較強。

2.3 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測靈敏度結果

圖3 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測靈敏度結果Fig. 3 Sensitivity of detection of Staphylococcus aureus by ddPCR

金黃色葡萄球菌的活菌培養物的平板計數濃度為3.3×106CFU/g，如圖3所示，反應1的原始模板濃度太高，無陰性微滴，數據無效。當原始模板濃度為3.3×101CFU/g時，檢測出的拷貝數為0.20 copies/μL，所以，ddPCR方法檢測金黃色葡萄球菌的計數靈敏度為3.3×101CFU/g。

2.4 ddPCR絕對定量結果

根據金黃色葡萄球菌的理論拷貝數和實際檢測結果拷貝數計算出實測靈敏度，如表3所示。比較實測靈敏度和計數靈敏度的差值，當實測靈敏度大于計數靈敏度時，偏差率為正偏差；當實測靈敏度小于計數靈敏度時，偏差率為負偏差。結果顯示，金黃色葡萄球菌的實測靈敏度均略高于計數靈敏度，且經過偏差率計算，ddPCR的實測靈敏度與計數靈敏度偏差率均低于25%，保證了ddPCR進行絕對定量檢測實際應用的可行性。

表3 拷貝數和實測靈敏度關系Table 3 Relationship between copy number and measured sensitivity

圖4 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測靈敏度的線性關系Fig. 4 Standard curve for sensitivity of ddPCR detection of Staphylococcus aureus

為了驗證ddPCR檢測方法的可行性，將不同濃度的金黃色葡萄球菌進行ddPCR檢測，分析計數結果與ddPCR檢測結果的線性關系。如圖4所示，根據金黃色葡萄球菌的拷貝數和菌落濃度的對應關系所生成的標準曲線顯示R2大于0.99，說明ddPCR檢測酸奶中污染菌的靈敏度線性關系良好，進一步為ddPCR在絕對定量檢測中的實際應用范圍提供了保障。

3 討 論

Reagent D可以有選擇性地滲透進入死菌的細胞中，在鹵素燈的照射下使Reagent D的光敏基團轉化為自由基，并能和DNA分子發生共價交聯反應，從而阻斷死菌的DNA分子發生PCR擴增。本研究中采用Reagent D處理細菌培養液，并與ddPCR技術相結合從一定程度上排除了死菌對檢測方法的影響，實現了定量檢測活菌的ddPCR檢測。

ddPCR方法的結果判定是根據反應結束后微滴檢測儀收集的發出熒光信號的微滴數量，陽性為熒光信號值高于閾值的反應，陰性為熒光信號值低于閾值的反應，然后將陽性微滴數和陰性微滴數用泊松分布公式計算出DNA分子的拷貝數。所以微滴檢測儀最后收集到的熒光信號的強弱直接反映出ddPCR的準確性和PCR的擴增效率。影響PCR擴增效率的因素很多，例如引物和探針的濃度，引物的擴增效率，合適的退火溫度等。本研究對這些影響因素都進行了優化，最終篩選出每一株菌的最佳反應條件。

微滴發生器將配制好的PCR混合液打散并被包裹在微滴發生專用油中形成微滴，進行PCR擴增。模板DNA的濃度對ddPCR的檢測結果有很大的影響。如果模板中的拷貝數低于所生成的微滴數量，每一個微滴中有一個或沒有含有目標模板的DNA分子，在PCR完成后，含有目標模板的微滴發生擴增被微滴檢測儀檢測為陽性，不含目標模板的微滴沒有擴增被檢測為陰性，根據這2 種微滴的比例通過泊松分布可以準確地實現絕對定量。如果模板中的拷貝數高于或者接近拷貝數，該濃度條件下所有的微滴處于飽和狀態，無陰性微滴或者陰性微滴的數量太少，則不能滿足泊松分布的條件，絕對定量的結果與真實值相差太大，則無法準確實現ddPCR的絕對定量。

金黃色葡萄球菌對其數值的過程控制顯得尤為重要，通過分析計數結果與ddPCR檢測結果的線性關系（標準曲線R2均大于0.99），證明了ddPCR用于絕對定量檢測的可行性，進而為不同濃度污染菌對終產品造成危害的研究提供了保障，也為ddPCR技術在其他污染菌和致病菌的檢測推廣提供理論依據。

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Quantitative Detection of Staphylococcus aureus in Yogurt by Droplet Digital PCR Assay

ZHOU Wei1, LI Yuehua1, SUN Yong2, LI Yongbo1, ZHANG Tao1, LIU Qiong1, ZHANG Yan1,*, WANG Lixia1,*
(1. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

This study aimed to establish a new accurate quantitative method to detect Staphylococcus aureus in yogurt using droplet digital PCR (ddPCR). Specific primers and probes targeting the nuc gene of Staphylococcus aureus were designed, and the PCR reaction system was optimized. The specificity and sensitivity of ddPCR for detecting the target gene were tested using the DNA extracted viable bacterial cells, and the quantitative results were analyzed. The ddPCR method could be useful to quantitatively detect S. aureus in yogurt with good specificity. The limit of detection (LOD) of the method was 3.3 × 101CFU/g, and the quantitative deviation was +10.18%, which proved the feasibility of using ddPCR for absolute quantitation of S. aureus. It will provide a useful demonstration for standardized control systems of other food-contaminating bacteria and foodborne pathogenic bacteria.

droplet digital PCR; yogurt; detection; Staphylococcus aureus

10.7506/spkx1002-6630-201716046

TS201.3

A

1002-6630（2017）16-0287-05

周巍, 李月華, 孫勇, 等. 微滴式數字PCR技術定量檢測發酵乳中金黃色葡萄球菌[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 287-291. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716046. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Wei, LI Yuehua, SUN Yong, et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus in yogurt by droplet digital PCR assay[J]. Food Science, 2017, 38(16): 287-291. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716046. http://www.spkx.net.cn

2016-11-04

科技部公益性行業科研專項（201510208-08）；河北省科技計劃項目（16275506D；17275507D）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAK36B03）

周?。?983—），男，高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：zhouwei0311@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，正高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snowwinglv@126.com王麗霞（1963—），女，正高級工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測與風險評估技術。E-mail：lisawang9078@vip.sina.com