基于改進分水嶺分割算法的致密熒光微滴識別

劉 聰，董文飛，蔣克明，周武平，張 濤，黎海文*

(1.中國科學院 蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學院大學,北京 100039)

1 引 言

微滴數字PCR是近年來發展十分迅速的新一代定量PCR技術[1]。目前微滴數字PCR中常見的信號檢測方法為流式檢測法。流式檢測法利用流式細胞儀的原理，將一個個液滴依次經過光學或電子探測器，通過檢測標記的熒光信號逐個分析液滴，具有背景熒光強度低，識別算法簡單等優點。但是，該方法光路復雜、成本高昂，而且難以與儀器前端的微滴生成模塊、PCR擴增模塊集成，在數字PCR集成化和低成本化的趨勢下顯得后繼乏力[2]。近年來，數字影像技術的發展讓人們能獲取高質量的熒光圖像，這使得基于數字熒光圖像進行微滴識別的平面探測法越來越受到人們的歡迎。

目前，基于平面探測法的微滴識別存在以下難點。首先，由于激發熒光的強度較弱，通常需要較長的曝光時間才能獲得可用于識別的圖像，即便如此，微滴熒光圖像的亮度和對比度與明場圖像相比明顯偏低。其次，圖像中微滴可以分為含有目標核酸分子的陽性微滴和不含目標核酸分子的陰性微滴兩類。陽性微滴的熒光強度較強，可以輕易地與背景分開，但陽性微滴會對周圍背景區域和陰性微滴產生干擾，例如多個陽性微滴包圍一個陰性微滴，則有可能造成該陰性微滴熒光強度的被動提高；陰性微滴的熒光強度較弱，微滴內部的熒光強度僅略高于背景，具有低亮度、低信噪比的特點。這些特點對識別微滴提出了挑戰，因此，有必要對熒光圖像中的微滴識別方法進行研究。

現有的針對圓形物體的圖像識別方法通常分為以下3步：(1)通過預處理盡可能地去除圖像中存在的偽跡或噪聲；(2)將圖像分割為背景和前景；(3)將重疊或黏連的顆粒區分開。文獻[3-6]報道了一些基于顯微圖像的顆粒計數方法，但均為對可見光源下的圓形顆粒圖像進行識別，無法直接應用到含有大量陰性微滴、圖像信噪比低的熒光圖像中，因此有必要對熒光圖像中的微滴識別方法進行研究。本文提出一種基于自適應閾值分割和改進分水嶺分割的熒光微滴自動識別方法，針對圖像中含有的大量陽性和陰性熒光微滴進行準確、快速、高通量的識別，從而提高檢測精度。

2 基于距離變換的改進分水嶺分割方法

2.1 圖像增強

為了改善圖像的視覺效果，通常需要對圖像進行一系列調整以增強圖像的整體或局部特性，增大圖像中不同信息之間的差別，滿足后續分析的需要。圖1為微滴熒光圖像示例，分辨率為320×240。從圖中可見，整張圖像的亮度明顯偏暗。雖然陽性微滴可以比較清楚地看到，但陰性微滴僅比背景值略高，整體灰度值較低，這使得常見的閾值分割方法難以奏效。因此，圖像增強的目的主要在于提高暗部的對比度。

圖1 微滴熒光圖像示例 Fig.1 A droplets fluorescence image

本文利用直方圖均衡化對圖像進行非線性拉伸，擴大暗部的灰度差別，增強陰性微滴與背景的對比度，達到對比度增強的效果。直方圖均衡化無需確定變換函數系數，計算量小，結果簡單可靠，缺點是可能會出現因灰度級合并造成圖像部分細節信息丟失的情況，導致背景噪聲強度增加，有用信號的對比度降低，此時，需要使用平滑濾波器對圖像進行平滑[7]。

目前使用較多的空間域平滑濾波器可以分為線性濾波器和非線性濾波器兩類，前者包括高斯濾波、均值濾波等濾波器，后者以中值濾波器為代表。微滴熒光圖像具有兩個特點：(1)圖像中的背景噪聲主要為高斯噪聲；(2)微滴間的填充部分受到微滴熒光強度的直接影響。中值濾波是應用廣泛的非線性濾波器，但其效果依賴于濾波窗口的大小，其本質上犧牲了圖像分辨率。近年來出現了一些基于中值濾波的改進算法，如但唐仁等人[8]的極值中值濾波器。這些濾波器較傳統中值濾波器有所改進，但在實際應用中仍有各自的局限性。受熒光的影響，中值濾波還可能擴大陽性微滴周圍背景噪聲的范圍，導致微滴黏連，這就決定了中值濾波并不適合處理微滴熒光圖像。高斯濾波是一種根據高斯函數的形狀來選擇權值的線性平滑濾波器，掩模中心的權重比其他任何像素的權重都大，而距離掩模中心較遠的像素就顯得不太重要。相比較于均值濾波，高斯濾波在較好地處理高斯噪聲的同時，減小了平滑對邊緣的模糊效應，更適用于對熒光微滴圖像平滑處理。圖2是圖像經高斯濾波后的結果。

圖2 預處理后的示例圖像(a)及其灰度分布(b) Fig.2 Preprocessed sample image(a) and its gray distribution(b)

2.2 圖像分割

基于微滴熒光圖像進行微滴識別時，圖像分割是需要解決的重要問題，其目的是將微滴從圖像背景中分離出來。目前，常用的圖像分割方法主要有基于閾值的分割方法、基于區域的分割方法、聚類分割法和基于模型的分割方法[9]等。其中基于閾值的圖像分割法具有簡單、易實現、性能穩定的特點，是目前應用最廣泛的分割方法[10]。

從預處理后的示例圖像的灰度直方圖中可以看到，預處理后圖像的灰度分布為三峰分布，分別對應于陽性微滴、陰性微滴和背景。如果直接使用傳統的二分法分割閾值，由于陽性微滴和陰性微滴的比例無法確定，將有較大幾率導致算法將陰性微滴和背景噪聲一起忽略。為此，通過二次分割法將微滴從背景中識別出來。首先，盡可能地去除背景噪聲。統計經過預處理后的圖像Iprep的灰度分布曲線，平滑處理后查找其波谷中灰度值最低的TH1。使用TH1作為熒光背景與陰性微滴的分界，將所有低于TH1的像素置零，得到一次分割后的圖像Ith1。經過一次分割后，絕大部分背景噪聲被去除。然后，使用局部自適應閾值法將Ith1再次分割，得到二值化的圖像Ith2。局部自適應閾值法僅對指定像素周圍鄰域內的灰度值進行比較，減少了鄰域外光照不均勻等圖像退化的干擾，對密集液滴的區分效果較基于全局灰度分布分割的Otsu法更好。

圖3是經過二次閾值分割后得到的微滴二值化圖像，其中(a)為本文方法結果,(b)為Otsu法，可見Otsu法雖然能夠較好地去除背景噪聲，但是微滴之間存在大量黏連，這給下一步的識別造成了困難；本文方法能夠排除絕大部分噪聲，但微滴之間仍存在一些黏連，在下面的識別過程中將進一步將黏連的微滴區分開。

圖3 本文方法分割后的示例圖像(a)和Otsu法分割的示例圖像(b) Fig.3 Segmented sample images obtained by proposed method(a) and Otsu method(b)

2.3 改進的分水嶺分割算法

經過閾值分割后微滴基本上與背景噪聲分離開，但由于熒光間的相互影響，二值化圖像中仍大量存在微滴黏連現象，對黏連微滴的分割也是熒光微滴圖像分割中最棘手的問題。目前，已有多種有效的黏連顆粒分割方法，包括邊緣檢測分割法、分水嶺分割法、主動輪廓模型法及形態學分割法等[11]。邊緣檢測法分割圖像時，通常利用梯度信息顯示目標邊緣的線條，但在圖像質量退化嚴重的情況下這些線條往往不能準確地描繪目標的輪廓?；谛螒B學的黏連分割，通常釆用腐燭、膨脹等操作，這對于黏連比較嚴重的目標分割效果并不是特別理想?；跀祵W形態學的分水嶺分割算法[12]具有單像素寬、輪廓位置準確、連通封閉、計算量小的優點，是目前使用最為廣泛的一類分割方法。

傳統分水嶺分割算法直接使用梯度圖像或者距離變換后的二值圖像中的區域極小值作為標記點，實現目標分割。由于二值化后的形狀不規則或細胞黏連等原因，標記點可能無法與每個微滴一一對應，導致過分割或欠分割現象。為了降低錯誤分割的幾率，本文對傳統的基于距離變換的分水嶺分割方法做了如下改進：首先，基于熒光微滴形狀類圓、尺寸較均勻這一先驗假設，定義一個表征圖像黏連程度的函數如下：

(1)

其中，連通域的區域面積為Ai，周長為Pi連通域所占的長度和寬度分別為hi、wi，α,β為系數，r0為預設的有效微滴半徑。黏連度函數fi根據hi、wi的不同將黏連的可能性表示為[0,1]間的實數值，fi越接近1，表示連通域越可能為黏連微滴；越接近0表示越不可能為黏連微滴。若hi、wi均小于βr0，則連通域小于單個有效微滴尺寸，因此可以肯定并非黏連微滴；如果fi、wi均大于αr0，則連通域顯著超出了單個有效微滴尺寸，可能為黏連微滴或尺寸過大的無效微滴，根據連通域面積與外接圓面積之比確定fi；如果hi、wi的取值在二者之間，那么說明連通域所占據的空間小于兩微滴直接相連，可能為黏連嚴重的多個微滴或有效微滴。由于黏連嚴重的多個微滴矩形度更高，使用連通域面積與外周長的平方之比作為fi的參數值。根據隸屬度函數值區分連通域是否為黏連的微滴，若為黏連微滴，則對連通域采用距離變換。利用先驗知識事先區分連通域，可以減少由于噪聲導致二值化后非黏連微滴在分水嶺算法作用下的誤分割。

其次，對距離變換后的地形圖Idist進行H-minima變換。H-minima變換是一種利用先驗知識抑制噪聲的有效方法，通過抑制地形圖中小于參數h的局部極小值點去除局部極小值中較低點引入的偽標記[13]。H-minima方法中h值的選擇非常關鍵，如果h過小，虛假標記點無法得到有效抑制，將產生過分割現象；h過大，某些真實標記點也被抑制掉，從而產生欠分割現象。本文中根據Idist中局部極小值的統計特性，選取Idist中最大值的20%作為H-minima變換中的h值。

通過上述兩種方式的改進，可以增加對偽標記的抑制?；谏鲜鲇懻?，改進的分水嶺分割算法流程如下：

①統計待分割圖像中的連通域集合S={Si|i=1,2,…,n}，n為連通域總數；

②取第i個連通域，將同時滿足下述條件的連通域Si認為是包含多個黏連微滴的區域：

(2)

fi>0.5 ,

(3)

③重復步驟(2)直到不含任何多微滴連通域；

④計算所有黏連微滴的歐式距離地形圖Idist；

⑤對Idist進行H-minima變換，利用距離地形圖的局部極小值作為前景標記；

⑥使用分水嶺算法分割Si；

⑦將滿足以下條件的區域識別為有效微滴，其他所有區域被認為是無效的微滴碎片而去除：

hi∈[Rmin,Rmax] ,

(4)

wi∈[Rmin,Rmax] ,

(5)

fi<0.4 .

(6)

2.4 熒光微滴自動識別算法

綜上所述，如圖4所示，熒光微滴自動識別算法的整體流程可分為如下幾步：

圖4 熒光微滴自動識別算法流程圖 Fig.4 Workflow of fluorescent droplet automatic recognition algorithm

①預處理，對圖像進行增強和平滑，以提高圖像對比度，降低圖像噪聲。

②閾值分割，將微滴從圖像背景中分離。

③黏連微滴分割，將圖像中重疊的微滴區分開來。

④微滴識別，基于文獻[14]中的方法將微滴分類為陽性和陰性兩類。

圖5為示例圖像的最終識別結果。

圖5 最終識別結果 Fig.5 Final recognition result

3 實驗和討論

為了驗證算法對熒光微滴的識別效果，本文在Python3.5中基于python-opencv3.4.0實現上述算法，硬件配置為Intel i5-6500 3.2GHz CPU,4GB RAM；操作系統為Windows 7 Professional。作為比較，本文將使用人工分割的熒光微滴圖像結果作為基準，與經典的基于距離變換的分水嶺分割算法[15]進行對照。

為減少PCR擴增反應引入的退化誤差，在自制的微滴生成芯片上分別生成陽性微滴和陰性微滴。其中陽性微滴使用濃度為30μg/mL的EvaGreen熒光染料與PCR預混液混合后經十字聚焦結構的微滴生成芯片生成，陰性微滴為直接使用PCR預混液經十字聚焦結構的微滴生成芯片生成。二者按照3:2的比例混合后使用熒光顯微鏡(Leica Axio Observer A1，物鏡5X)觀察并獲取熒光微滴圖像，平均微滴直徑為100.4 μm。圖6為分別對陰性液滴和陽性液滴集中區域進行識別的結果。圖6(a)為原始圖像，圖6(b)為直方圖均衡化后的結果，圖6(c)為本文算法識別出的液滴，圖6(d)為對照算法識別出的液滴。

圖6 熒光微滴的圖像識別結果 Fig.6 Image recognition results of fluorescent droplets

從圖6中可見，兩種方法對陽性微滴的識別效果都較好，但當陰性微滴周圍存在陽性微滴時會受其發射熒光的影響，對照方法更容易忽略受影響的陰性微滴。此外，經過距離變換后使用H-minima變換可較好地抑制偽標記點，因此本文方法和對照方法對于圖像中的過分割現象處理得都比較好。

對10幅微滴熒光圖像進行同樣的圖像增強和兩步閾值分割，分別考察兩種分割算法對10幅圖像的陽性微滴和陰性微滴的平均欠分割率、過分割率及識別正確率，結果如表1所示。

表1 微滴分割算法性能對照Tab.1 Performance comparison of different droplet segmentation methods

從表1中可以看到，兩種方法對陽性微滴的識別效果都較好，欠分割率和過分割率小于1%。陰性微滴在第一步的圖像分割中部分形變較嚴重，距離變換后對應連通域的極小值小于h值，導致對應標記點被去除，降低了對照方法的欠分割率，而本文方法在分水嶺分割前將無需分割的大量獨立微滴分離，大大降低了欠分割的可能性。本文算法識別陰性微滴的欠分割率為5.32%，遠低于對照方法的21.59%。

總體而言，本文方法的平均正確率為97.34%，高于傳統的基于距離變換的分水嶺分割法的85.9%，顯示出本文算法對熒光微滴具有良好的識別效果。

4 結 論

微滴熒光圖像具有低亮度、低對比度等特點，而傳統的圖像分割方法的識別正確率較低。因此，本文提出一種改進的熒光微滴分水嶺識別算法。該方法利用局部自適應閾值分割提取目標，以降低對圖像灰度信息的依賴，并結合微滴形狀類圓、尺寸較均勻的特點，定義了黏連度函數從而降低分水嶺分割中的錯誤分割，最后通過一系列實驗驗證了本文算法的有效性，并與傳統的距離變換分水嶺分割法進行了性能比較。結果表明，本文算法在保證陽性微滴分割準確性的基礎上，大大降低了陰性微滴的欠分割率，本文方法的平均正確率為97.34%，高于傳統的基于距離變換的分水嶺分割的85.9%，顯示出本文算法對熒光微滴良好的識別效果。

本文算法中各參數較多，在保證識別準確度的前提下盡可能設計參數自適應的識別方法，降低陰性微滴的欠分割率，提高算法對多種異常微滴圖像的適應性，同時利用其他先驗信息進一步提高識別準確度將是今后工作的研究重點。