miR-205通過靶向調控caspase-3表達調節神經膠質瘤的生物學行為

王 瀟

(四川友誼醫院腫瘤科，四川 成都 610000)

·論著·

miR-205通過靶向調控caspase-3表達調節神經膠質瘤的生物學行為

王 瀟

(四川友誼醫院腫瘤科，四川 成都 610000)

目的探討微小RNA-205、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cyserinly aspartate-specific protease,caspase-3)表達水平對神經膠質瘤生物學行為的影響及其可能的作用機制。方法采用實時熒光定量PCR檢測30例神經膠質瘤組織及正常腦組織中miR-205表達水平；采用脂質體轉染技術分別將miR-205 模擬物(miR-205 mimics)、對照(control mimics)、miR-205抑制物(miR-205-inhibitor)導入至U251細胞中，以Transwell實驗觀察細胞侵襲能力；采用生物信息學及熒光蛋白報告基因實驗驗證miR-205對caspase-3的靶向調控作用；采用RNA干擾技術研究U251細胞中caspase-3蛋白表達水平及細胞克隆數量變化。結果神經膠質瘤組織miR-205表達值低于正常腦組織(P<0.05),30神經膠質瘤組織中28例miR-205下調2倍以上。將miR-205模擬物或miR-205抑制劑轉染入U251細胞中發現，在miR-205的表達水平上，miR-205模擬物顯著高于對照，miR-205抑制物低于對照，差異有統計學意義(P<0.05)。miR-205模擬物轉染U251細胞后caspase-3蛋白表達高于對照轉染后細胞(P<0.05)。miR-205模擬物+pcDNA3-Wt共轉染組熒光值顯著高于對照及miR-205模擬物+pcDNA3-Mut(P<0.05)。轉染miR-205模擬物組，其細胞克隆形成明顯少于對照組及空白組，而轉染miR-205 inhibitor后，其細胞克隆形成則多于空白組(P<0.05)。結論多數神經膠質瘤存在miR-205表達下調現象，而miR-205可能通過靶向調控caspase-3影響膠質瘤細胞的侵襲、增殖、克隆形成能力，這將為進一步認識及治療神經膠質瘤提供有力依據。

神經膠質瘤；微RNAs；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

神經膠質瘤是顱內最常見的一種腦腫瘤，在我國發病率占顱內腫瘤的40%～50%[1]。由于神經膠質瘤浸潤性生長的特點，手術無法完全切除，而放化療又易對神經系統產生毒性，該病一直處于高復發率、高病死率及低治愈率的局面[2]。因此，從分子機制角度對疾病進行干預或許可為目前的治療困境提供新的思路。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤發生及發展中占有重要調控作用，如miR-205在肺癌[3]、乳腺癌[4]、腎癌[5]等惡性腫瘤中呈現低表達，且對癌癥的增殖、侵襲、凋亡具有調控作用。但目前miR-205在神經膠質瘤中的研究涉及較少。因此，本研究將從組織及細胞水平對miR-205在神經膠質瘤中的作用及相關機制進行初步探討，以期為神經膠質瘤治療提供新的藥物靶點。報告如下。

1 資料與方法

1.1 細胞及主要試劑U251神經膠質瘤細胞系購自中國科學院上海細胞庫；30例神經膠質瘤[男性18例，女性12例，年齡13～72歲，平均(44.6±14.6)歲；腫瘤部位：額葉12例，顳葉10例，頂葉8例；根據神經系統腫瘤分類：Ⅰ～Ⅱ級11例，Ⅲ～Ⅳ19例]及其配對組織miRNAs的cDNA文庫、pcDNA3/綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)來自本實驗室；DMEM基礎培養基及胎牛血清購自Gibco；miRNAPCR試劑盒、U6及miR-205特異性引物、miR-205模擬物、miR-205-抑制物、對照QIAGEN、Trizol、逆轉錄試劑盒、Lipofectamine2000均購自Invitrogen；實時熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司；PCR引物及DNA片段由大連Takara公司合成；Transwell板購自BD；caspase-3siRNA及control、鼠抗人caspase-3一抗及β-actin一抗購自Abcam公司；羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 購買的U251是神經膠質瘤細胞，屬于傳代細胞系，可穩定傳代并用于實驗研究。將含有U251細胞的凍存管從液氮中拿出，并迅速放入37℃水浴鍋中搖晃至完全溶解，隨后按1∶9體積比加入無血清培養基DMEM，以500r/min離心8min，去上清，加入1mL完全培養基(DEME+10%血清)重懸，將細胞懸液轉移入T25細胞培養瓶中，補加5mL完全培養基，搖勻，放入37 ℃ 5%CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%～90%時傳代。細胞傳代2～3次后，用于后續實驗。

1.2.2 細胞轉染 取上述培養的U251細胞，按5×103cell/孔接種至6孔板中，待細胞長滿至60%～70%時，將完全培養基替換成無血清DMEM培養基，并根據Lipofectamine2000試劑使用說明書，將miR-2015及對照品、caspase-3siRNA及對照品轉染入U251細胞中，轉染5～8h時，將無血清培養基替換成完全培養基，繼續培養2d。收集細胞，提取RNA、蛋白進行相關分子實驗以及Transwell細胞遷移實驗和軟瓊脂實驗。

1.2.3RT-PCR取Trizol抽提的總RNA1μL,按FermentasRevertAid逆轉錄說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以RT-PCR驗證miR-205的表達情況，其步驟按照SYBRPrimeSCrpitmiRNART-PCR說明書添加試劑。Caspase-3引物序列：上游5′-GGCATGGAGAACACTGAAAAC-3′；下游5′-GCGAATCTGTTTCTTTGCATG-3′。其反應條件為：95 ℃ 5min，95 ℃ 10s，62 ℃ 20s，35個循環。U6為內參引物序列：上游5′-CTCGCTTCGG-CAGCACA-3′；下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。

1.2.4 載體構建 依據生物信息學預測結果，將合成的含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點以及miR-205結合位點的caspase-3正反鏈DNA片段和缺失結合miR-205位點的正反鏈DNA片段，重組至熒光報道載體pcDNA3/EGFP中，從而獲得野生型報告載體(pcDNA3-Wt)及突變型報告載體(pcDNA3-Mut)。野生型正反鏈序列為：上游5′-CTAGCTAGCACGGGCCGCATTTAAAGTAAAG-3′;下游5′-CCGCTCGAGGAAGCACGCACCGAGA-CG-3′。PCR擴增程序為：95 ℃ 5min，95 ℃ 30s，67 ℃ 30s，35 個循環。突變型引物序列：上游5′-CTAGCTAGCACGGGCCGCATTTAAAGTAA-3′；下游5′-CTAGTCTAGATATATGGTCCAT-GATATT-3′。PCR擴增程序為：95 ℃ 5min，95 ℃ 30s，66 ℃ 30s，35個循環。

1.2.5 靶基因檢測 將合成的miR-205模擬物、對照模擬物分別與構建的熒光報告載體或空載體(pcDNA3/EGFP)共轉染U251細胞，轉染48h，用RAPI裂解細胞對蛋白進行定量分析。在507nm下測定樣品中EGFP的熒光值。

1.2.6Westernblot實驗 設置miR-205單轉染組、miR-205+野生型報告載體(pcDNA3-Wt)組及miR-205+突變型報告載體(pcDNA3-Mut)組。將其轉染U251細胞后24h,收集細胞，用RAPI低溫裂解細胞30min，吸取裂解液，以4 ℃ 12 000r/min離心20min，取上清，測定總蛋白濃度，并以每孔30μg進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉，分別加入caspase-3一抗(1∶2 000稀釋)及β-catin一抗(1∶2 500稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后加入HRP標記二抗，室溫孵育1h，PBST洗滌3次，ECL底物顯色。

1.2.7Transwell細胞遷移實驗 將Transwell小室從-20 ℃冰箱中取出室溫平衡30min后，取出小室放入24孔板中，上下室分別加入500μL完全培養基，放入細胞培養箱中水化2h，隨后棄去上下室培養基。往小室中加入密度為1×107/mL細胞懸液500μL后，將小室放置到含有完全培養基的24孔板中。放入細胞培養箱培養24h，吸棄上下室液體，用干凈棉簽擦凈Transwell膜上室內細胞后，PBS洗滌3次，并用預冷的甲醇固定Transwell下室細胞，以1%結晶紫染色8～10min后，以流水清洗多余結晶紫，吸水紙吸干后放于顯微鏡下觀察。

1.2.8 軟瓊脂克隆實驗 設置miR-205模擬物組、miR-205inhibitor組、對照組及空白細胞組。4組均按照“1.2.2”項細胞轉染步驟轉染U251細胞，培養24h后，分別與0.6%低熔點瓊脂糖按等比例混合，并以1×105cell/mL濃度接種至培養皿中，每組3個板，37 ℃ 5%CO2培養。記錄培養2周后各組克隆形成數量。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0統計軟件分析數據。計量資料比較分別采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miR-205在神經膠質瘤中的表達水平 以正常腦組織中miR-205表達值1.00±0.03為參照，30例神經膠質瘤組織miR-205表達值為0.27±0.04，差異有統計學意義(t=9.545,P=0.000)。30例神經膠質瘤組織中28例miR-205下調2倍以上。

2.2miR-205在U251細胞中的表達 將miR-205模擬物或miR-205抑制劑轉染入U251細胞中發現，在miR-205的表達水平上，miR-205模擬物組顯著高于對照組和miR-205抑制物組，且miR-205抑制物組低于對照，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Transwell結果顯示，隨著miR-205表達量上調，U251遷移能力及數量均顯著下降，而當轉染miR-205inhibitor時，細胞遷移能力及數量則有所增加(圖1)。

組別 miR-205表達水平miR-205模擬物組6.43±0.32對照組 1.15±0.42*miR-205抑制物組0.78±0.33*# F 5.234 P 0.005

*P<0.05與miR-205模擬物組比較 #P<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

圖1 細胞遷移結果A.對照組;B.miR-205模擬物;C.miR-205抑制物Figure1 Resultsofcellmigration

2.3 miR-205靶向調控caspase-3的表達 生物信息學預測結果分析顯示，caspase-3 mRNA 3′-UTR的134-145區域與miR-205存在互補(圖2)。Western blot驗證,miR-205模擬物轉染U251細胞后caspase-3蛋白表達(0.95±0.08)高于對照轉染后細胞(0.36±0.07)，差異有統計學意義(SNK-q=8.135,P<0.05)(圖3)。熒光報告實驗顯示，miR-205模擬物+pcDNA3-Wt共轉染組熒光值(0.94±0.04)顯著高于對照(0.32±0.04)及miR-205模擬物+pcDNA3-Mut(0.55±0.03)，差異有統計學意義(SNK-q=8.183、6.284,P<0.01)。證明miR-205能夠特異性結合Caspase-3的3′-UTR區域，從而使熒光蛋白表達水平顯著增加，而Caspase mRNA的3′-UTR結合區域突變后，則無此現象，提示caspase-3是miR-205的靶基因。

圖2生物信息學預測結果

Figure2Resultsofbioinformaticsprediction

圖3 Western blot結果

Figure3ResultsofWesternblot

2.4 軟瓊脂實驗 轉染miR-205 模擬物組，其細胞克隆形成明顯少于對照組和空白組；而轉染 miR-205 抑制物后，其細胞克隆形成則多于對照組和空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4,表2。

圖4各組U251細胞克隆形成結果

A.空白;B.對照模擬物;C.miR-205模擬物;D.miR-205抑制劑

Figure4U251cellcolonyformationineachgroup

組別 克隆數空白組 134.3±16.8miR-205模擬物組18.4±4.3*#對照組 128.5±15.9miR-205抑制物組178.4±18.5*#F 7.285P 0.002

*P<0.05與空白組比較 #P<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.5 caspase-3表達對U251生物學功能的影響 為進一步觀察caspase-3是否參與神經膠質瘤細胞克隆的形成，采用siRNA技術成功降低caspase-3表達水平后，通過Western blot檢測轉染miR-205模擬物、miR-205模擬物+pcDNA3-Wt、miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA、miR-205模擬物+pcDNA3-Mut的U251細胞，并以單轉染miR-205模擬物的caspase-3表達量為標準(1.00±0.12)。caspase-3蛋白表達上調可導致細胞克隆數量明顯減少。見表3。

組別caspase-3灰度值克隆數miR-205模擬物1.00±0.1215.32±6.27miR-205模擬物+pcDNA3-Wt3.24±0.34*3.67±1.25*miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA0.48±0.13*#25.82±5.91*#miR-205模擬物+pcDNA3-Mut2.25±0.29*#△10.28±2.26*#△F804.377129.424P0.0000.000

*P<0.05與miR-205模擬物比較 #P<0.05與miR-205模擬物+pcDNA3-Wt比較 △P<0.05與miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

3.1 神經膠質瘤、microRNA研究現狀 目前，我國神經膠質瘤成人發病率約為6/10萬，但5年病死率高達80%，其中以高度惡性的多形膠質母細胞瘤病死率最高，其患者中位數生存期<1年[6]。然而，腫瘤的發生及發展常涉及多種機制，且關于神經膠質瘤的病因及發病機制存在多種學說，如細胞凋亡抑制、細胞過度增殖等。因此，通過調節某種特點蛋白或mRNA的表達來觀察細胞增殖、凋亡等將有助于進一步了解神經膠質瘤的發病機制。

miRNA在腫瘤中的作用機制是目前研究的熱點之一。其主要是一類高度保守，經轉錄后可發揮調控的非編碼小RNA，其通過與下游靶基因mRNA3′-UTR序列配對，抑制或降解靶基因mRNA，并最終導致蛋白翻譯失敗。近年來，關于miRNA在神經膠質瘤中報道顯著增加。如Quintavalle等[7]發現敲除miR-21后，可抑制膠質瘤細胞生長，促進其細胞凋亡及減弱侵襲力。孫利波等[8]則發現miR-10b高表達可促使膠質瘤細胞體外增殖能力增強，并使處于S期的細胞增多。Gao等[9]發現miR-34a作用與以上2種miRNA截然相反，轉染miR-34a的U251細胞其細胞增殖減弱，而凋亡細胞明顯增多。由此可見，不同的miRNA對于神經膠質瘤的作用存在差異[10]。本研究結果顯示,miR-205表達上調可抑制神經膠質瘤細胞遷移及細胞克隆的形成。

3.2 miR-205在神經膠質瘤中的表達意義 本研究結果顯示，miR-205在神經膠質瘤中的表達水平顯著低于正常腦組織，而通過轉染技術提高miR-205在U251細胞中的表達后發現，U251細胞侵襲能力明顯下降，給予miR-205 inhibitor后，其侵襲能力恢復甚至高于空白組。提示miR-205在神經膠質瘤中起到抑癌作用。目前已經證實，miR-205可調控血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、E2F1、Bcl-2等表達。其中VEGF-A是促腫瘤微血管生產的重要蛋白，高表達VEGF-A可激活酪氨酸激酶，促發信號傳導，并誘導內皮細胞增殖及遷移，從而引起新生血管生成[11]；而E2F1則可調控細胞周期，使膠質瘤細胞由G1向S期進展加快[12]；Bcl-2則是細胞凋亡途徑中的重要調控蛋白。

3.3 caspase-3在神經膠質瘤中的表達意義 caspase家族是一類細胞凋亡的重要執行蛋白，而caspase-3更是該家族中的核心蛋白，且一直被認為是細胞凋亡中最后的共同通道[13]。其對于腫瘤凋亡的作用也已有大量文獻報道，如在胃癌、肝癌、前列腺癌等中均出現表達下調現象[14]。本研究通過軟瓊脂克隆實驗證實，當caspase-3表達上升時，其細胞克隆數量明顯下降，而采用siRNA干擾技術阻斷caspase-3的表達，其細胞克隆數量明顯增多。結合caspase-3在細胞凋亡中的關鍵作用，可能由于大部分細胞出現凋亡，從而使細胞侵襲、增殖及成瘤作用受到影響[15]。

3.4 miR-205通過靶向調控caspase-3表達調節神經膠質瘤的生物學行為 通過生物信息學預測及構建熒光蛋白報告系統證實，當miR-205與野生型caspase-3同轉染后，熒光蛋白表達水平顯著高于miR-205與突變型caspase-3，且干擾caspase-3的表達后細胞克隆形成數量及侵襲性趨勢與下調miR-205結果相似。由此推測caspase-3是miR-205的靶向蛋白之一，并且高表達caspase-3有助于抑制神經膠質瘤細胞的侵襲及增殖。

綜上所述，miR-205或可作為神經膠質瘤治療或診斷的新指標。上調miR-205表達有利于降低神經膠質瘤細胞的侵襲及細胞增殖能力，caspase-3作為miR-205的靶向基因，下調caspase-3的表達水平也可獲得上調miR-205表達的相同效果。

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(本文編輯：趙麗潔)

Effect of miR-205 on the biological behavior of glioma via targeting caspase-3

WANG Xiao

(DepartmentofOncology，theFriendshipHospitalofSichuanProvince,Chengdu610000，China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofmicroRNA-205andaspartate-specificcaspase-3expressiononthebiologicalbehaviorofgliomaanditspossiblemechanism.MethodsTheexpressionofmiR-205in30casesofgliomatissueandnormalbraintissuewasdetectedbyreal-timefluorescencequantitativePCR.ThemiR-205mimics,controlmimics,miR-205inhibitor(miR-205-inhibitor)wasintroducedintoU251cellsandtheinvasiveabilityofthecellswasobservedbyTranswellassay.TheeffectofmiR-205oncaspase-3wastestedbybioinformaticsandfluorescentproteinreporterassay.Theexpressionlevelofcaspase-3proteinandthenumberofcellclonesinU251cellswerestudiedbyRNAinterferencetechnique.ResultsTheexpressionofmiR-205ingliomatissuewaslowerthanthatinnormalbraintissue(P<0.05),and28casesofgliomatissuewere28timeslowerthanthatofmiR-205.ThemiR-205mimeticormiR-205inhibitorwastransfectedintoU251cellsandfoundthatmiR-205mimicsweresignificantlyhigherthanthoseofcontrolatmiR-205expressionlevels,andthatofmiR-205waslowerthanthatofcontrol.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Theexpressionofcaspase-3proteininU251cellstransfectedwithmiR-205mimicswashigherthanthatincontroltransfectedcells(P<0.05).ThefluorescencevalueofmiR-205mimics+pcDNA3-Wtco-transfectiongroupwassignificantlyhigherthanthatofcontrolandmiR-205mimics+pcDNA3-Mut(P<0.05).ThemiR-205mimeticgroupwastransfectedintomiR-205mimeticgroup,anditscellcloneformationwassignificantlylessthanthatofthecontrolgroupandtheblankgroup.AftertransfectionofmiR-205inhibitor,thecellcloneformationwasmorethanthatintheblankgroup(P<0.05).ConclusionMostofthegliomashavemiR-205expressiondownregulation,andmiR-205mayinfluencetheinvasion,proliferationandclonalabilityofgliomacellsbytargetingcaspase-3,whichwillprovideapowerfulbasisforfurtherunderstandingandtreatmentofglioma.

glioma；microRNAs；caspase-3

2016-03-15；

2016-05-02

王瀟(1978-)，男，江蘇南京人，四川友誼醫院主

R730.264

A

1007-3205(2017)09-1024-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.008

治醫師，醫學學士，從事腫瘤的化療與分子靶向治療研究。