代謝工程合成5-氨基乙酰丙酸的研究進展

張雙虹，鄒亞蘭，宋 鑫，馮麗麗，陳 濤，王智文

(1．天津大學 化工學院，天津 300350;2．天津大學 系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300350;3．天津大學 化工協同創新中心，天津 300350;4．山東農業大學 林學院，山東泰安 271018)

代謝工程合成5-氨基乙酰丙酸的研究進展

張雙虹1，2，3，鄒亞蘭1，2，3，宋 鑫4，馮麗麗1，2，3，陳 濤1，2，3，王智文1，2，3

(1．天津大學 化工學院，天津 300350;2．天津大學 系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300350;3．天津大學 化工協同創新中心，天津 300350;4．山東農業大學 林學院，山東泰安 271018)

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是生物體內吡咯類物質生物合成的前體物質，在醫藥和農業領域顯示出廣闊的市場潛力。隨著代謝工程的發展以及對5-ALA生物合成途徑的研究，利用微生物合成5-ALA成為研究的新方向。與傳統的化學法合成相比，利用微生物合成5-ALA具有低污染、高產率和低成本等優勢。本文中，筆者介紹了5-ALA生物合成的最新研究進展，分析了5-ALA代謝途徑的關鍵影響因素，并對未來的研究方向進行了展望。

5-氨基乙酰丙酸;C4途徑;C5途徑;生物合成

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是一種非蛋白類氨基酸，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中，是生物體內合成卟啉、葉綠素和維生素B12(VB12)等吡咯類化合物的前體物質。5-ALA在環境中易降解無殘留，作為除草劑［1］和殺蟲劑［2］可以選擇性地殺死雙子葉植物的雜草，引起害蟲體內生化代謝失衡。此外，5-ALA具有類似于植物激素的生理活性，在植物生長過程中起調節作用，可作為植物生長調節劑［3］使用。在醫學領域，作為光動力治療藥物，5-ALA在惡性腫瘤治療、皮膚癌治療方面已經顯示出廣闊的市場前景［4］，在膀胱癌［5］、直腸癌［6］和黑色素瘤［7］治療方面有良好的效果?，F階段，5-ALA的生產方法包括化學法合成和生物法合成。傳統的5-ALA生產主要以乙酰丙酸、糠醛、嘧啶等為原料化學合成，然而化學合成法存在副產物多、產物分離困難和原料價格昂貴等問題，造成5-ALA得率低、生產成本較高［8］，這也是5-ALA市場價格高的原因。隨著生物技術的發展，以微生物為底盤細胞，通過代謝工程改造來進行生物法合成成為新的研究方向。本文中，筆者重點介紹5-ALA的生物合成途徑，并對近年來微生物合成5-ALA的研究進展進行綜述和展望。

圖1 5-ALA的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of 5-ALA

1 5-ALA的合成途徑

在自然界中，動物、植物和微生物等均可以生產5-ALA，其主要的合成途徑有兩條［8］：C4途徑(C4 pathway)和C5途徑(C5 pathway)。C4途徑主要存在于動物、真菌、原生動物和一些光合細菌中，如沼澤紅假單胞菌。C5途徑主要存在于高等植物、藻類和細菌中，如大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌［9］。但是，也有少數微生物同時具有C4途徑和C5途徑，例如 Euglena gracilis［10］。1.1 C4途徑

C4途徑如圖1所示，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinate synthase，ALAS)催化甘氨酸和琥珀酰CoA生成5-ALA，該反應的輔因子是磷酸吡哆醛。ALAS是C4途徑中的關鍵酶，由于光合細菌的ALAS具有較高的酶活，所以研究者主要針對光合細菌的ALAS進行研究，這些光合細菌主要包括類球紅細菌［11］和沼澤紅假單胞菌等［12］。

目前，利用C4途徑代謝工程合成5-ALA的研究主要集中在大腸桿菌。研究者們嘗試將不同來源的ALAS在大腸桿菌中表達以提高5-ALA的產量。早在1999年，Bolt等［11］在大腸桿菌中成功克隆了來源于類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的ALAS，測得其比酶活為0．22 U/mg，其對底物琥珀酰CoA和甘氨酸的Km值分別為17 μmol/L與1．9 mmol/L。Choi等［13］在大腸桿菌中克隆了來源于沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)KUGB306 的 ALAS，比酶活為 0．92 U/mg，對琥珀酰CoA與甘氨酸的 Km值分別為 50 μmol/L與 2 mmol/L。Lin等［14］在大腸桿菌表達了來源于放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)zju-0121的ALAS，比酶活為0．12 U/mg，對琥珀酰 CoA 與甘氨酸的 Km值分別為257 μmol/L與9．7 mmol/L。2013年，Zhang等［15］克隆了來源于沼澤紅假單胞菌的ALAS，ALAS的比酶活為 3．6 U/mg，這是目前報道的最高酶活ALAS，對琥珀酰CoA與甘氨酸的Km值分別為 11 μmol/L 與 3．8 mmol/L。2014 年，Lou等［16］將來源于類球紅細菌、放射形土壤桿菌和慢生型大豆根瘤菌的ALAS在大腸桿菌中成功表達，發現這幾個ALAS的最適pH均為7．5，最適溫度為37℃，在最適條件下，它們的比酶活分別為0．12、0．15和 0．2 U/mg。

1.2 C5途徑

在利用C5途徑合成5-ALA中，谷氨酸是5-ALA合成的前體物，由于該物質含有五個碳，因此，該合成途徑被稱為C5途徑，具體途徑見圖1。C5途徑需要經過三步反應：谷氨酰tRNA合成酶(GluRS，由gltx基因編碼)催化谷氨酸與相應的tRNA相連，生成谷氨酰tRNA;隨后，谷氨酰tRNA在谷氨酰tRNA還原酶(GluTR，由hemA基因編碼)的作用下還原為谷氨酰-1-半醛(GSA)［17］;最后，谷氨酰-1-半醛在谷氨酰-1-半醛氨基轉移酶(GSA-AM，由hemL基因編碼)的催化下，生成5-ALA［8］。

C5途徑合成5-ALA中，GluTR和GSA-AM(谷氨酰-1-半醛氨基轉移酶)是關鍵酶。GluTR是5-ALA生物合成的第一個關鍵酶，但是由于該酶蛋白對水解酶敏感，關于該酶蛋白分子結構的報道不多。GluTR受到終產物血紅素的調節，當血紅素的濃度足夠的時候，GluTR的水平會降低，而當限制血紅素濃度的時候，GluTR的蛋白量和活力會明顯的提高［18］。由 GluTR催化生成的谷氨酰-1-半醛(GSA)是一個不穩定的中間產物，會被迅速催化生成5-ALA，為了減少中間產物GSA的損失，并且加快反應速度，GluTR蛋白和GSA-AM蛋白會形成酶復合體［19］。因此，研究人員認為GSA-AM也是C5途徑中參與5-ALA生物合成的一個重要的酶。

表1 微生物生產5-ALA的研究Table 1 Production of 5-ALA by microorganism

2 代謝工程改造微生物合成5-ALA

表1列舉了不同微生物菌株合成5-ALA的情況。產生5-ALA的微生物包括光合細菌、大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等。近幾年，通過代謝工程改造微生物合成5-ALA成為了研究的熱點，其工程策略主要包括：不同來源ALAS酶基因的異源表達優化，提高前體物甘氨酸和琥珀酰CoA的供給，限速酶GluTR的穩定性改進，降低副產物的溢流代謝和強化5-ALA的胞外運輸等。

2.1 大腸桿菌代謝工程改造合成5-ALA

2．1．1 C4途徑代謝工程改造合成5-ALA

通過代謝工程方法合成5-ALA的研究主要集中在大腸桿菌中進行，提高ALAS的酶活是改造的關鍵。早在1996年，Vander Werf等［25］將來源于類球紅細菌(R．sphaeroides)的hemA基因克隆至大腸桿菌中，實現了hemA基因的活性表達，通過對發酵培養基以及發酵條件等進行優化，使得5-ALA的最終產量達到了2．88 g/L。為了提高ALAS的酶活，Fu等［27］分析了 ALAS 在 E．coli BL21(DE3)和E．coli Rosetta(DE3)(稀有密碼子優化菌株)中的表達差異，發現：來源于類球紅細菌(R．sphaeroides)的hemA基因在密碼子優化的菌株 E．coli Rosetta(DE3)中可以更好地表達，使5-ALA的產量提高至3．80 g/L。Jeong等［39］發現5-ALA 的生物合成可能與細胞內的氧化還原電勢有著密切的關系，當同時過表達依賴于NADPH的蘋果酸酶基因maeB和5-氨基乙酰丙酸合酶編碼基因hemA，能夠明顯提高ALAS的活力。琥珀酰CoA是5-ALA合成的前體物，為了解決前體物供應的問題，Kang等［40］將5-氨基乙酰丙酸合酶編碼基因導入到一株琥珀酸生產菌株中，5-ALA的產量較之前提高了4倍。Yang［33］等發現發酵過程中的溶氧水平對ALAS的活力有影響，菌體對數生長期中一定時間的厭氧控制對ALA產量的提高有促進作用，最終在15 L發酵罐中5-ALA 產量達 9．4 g/L。Ding［9］等在大腸桿菌中過表達優化來自光合細菌(Rhodobacter capsulatus)的hemA基因，將5-ALA的產量從20 mg/L提高到689 mg/L，進一步過表達輔酶A合成路徑相關基因，下調hemB基因的表達，最終ALA產量達2．81 g/L。

2．1．2 C5途徑代謝工程改造合成5-ALA

鑒于大腸桿菌自身能夠利用C5途徑進行5-ALA的合成，近幾年來，人們也開展了利用C5途徑進行5-ALA代謝工程合成的研究。Kang等［28］首先在大腸桿菌中分析了C5途徑中涉及的3個酶GluRS、GluTR和GSA-AM對5-ALA合成的影響，結果發現，GluTR是5-ALA生物合成過程中的限速酶。由于該酶的穩定性很差，將來自于鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Arizona)的hemA基因的N端編碼Thr-2和Leu-3氨基酸的密碼子之間插入了兩個編碼賴氨酸的密碼子：AAGAAG。進一步在大腸桿菌中過表達突變型hemAM基因，5-ALA的產量提高到0．18 g/L。此外，他們還發現GSA-AM和HemAM酶具有協同作用，在此基礎上過表達rhtA基因，5-ALA的產量提高到 4．13 g/L。2015 年，Zhang等［26］研究發現hemB、hemD、hemG和hemH是5-ALA下游代謝合成血紅素的關鍵基因，上調hemD和hemF基因的表達有利于5-ALA的積累，而過表達hemB、hemG和hemH基因并不利于5-ALA的積累。最終通過在大腸肝菌中組合過表達hemA、hemL、hemD和hemF基因，5-ALA 產量達到 3．25 g/L。Zhang 等［41］通過酶工程手段對GluTR進行改造，在GluTR的N末端插入賴氨酸或精氨酸殘基以提高GluTR的穩定性，5-ALA的產量較之前提高了1．76倍。研究人員還發現了離子平衡對于5-ALA的積累有影響，Li等［42］基于RyhB調節離子平衡的作用，通過表達ryhB基因，使5-ALA的產量提高16%，該研究對于利用非編碼RNA(Small RNA)調節5-ALA積累有指導意義。Zhang等［43］同樣發現了離子濃度對于5-ALA積累的影響，在優化離子添加濃度基礎上，過表達hemA、hemL、hemD和 hemF基因，分批發酵產量達4．05 g/L。

2.2 谷氨酸棒狀桿菌代謝工程改造合成5-ALA

谷氨酸棒狀桿菌是從土壤中分離得到的革蘭氏陽性菌，在工業上廣泛應用于生產氨基酸、胺類以及生物能源等，是一株食品安全菌株。5-ALA的C5合成途徑前體是谷氨酸，谷氨酸棒狀桿菌能天然分泌谷氨酸，無需外源添加其他前體物質，從而降低了生產成本。而且谷氨酸棒狀桿菌本身沒有甘氨酸裂解系統，可以有效避免甘氨酸在胞內的降解［36］。因此谷氨酸棒狀桿菌被認為是合成5-ALA的重要潛力菌株。

2．2．1 C4途徑代謝工程改造合成5-ALA

筆者所在的課題組在利用谷氨酸棒狀桿菌通過C4途徑代謝工程改造合成5-ALA方面進行了系列研究。2015年，Feng等［36］在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中引入類球紅細菌(R．sphaeroides)的hemA基因，敲除生成乙酸、乳酸的合成途徑基因，敲除編碼青霉素結合蛋白的pbp1b基因，過表達源自大腸桿菌的rhtA基因，5-ALA在5 L發酵罐中流加發酵時，產量達到了7．53 g/L。在此基礎上，Zou等［38］研究了絲氨酸及甘氨酸合成途徑對5-ALA合成的影響，結果表明，甘氨酸合成途徑是5-ALA合成的關鍵途徑。2016年，Yang等［37］比較了不同來源的 ALAS對5-ALA合成的影響，將來自Rhodobacter capsulatus SB1003的ALAS進行密碼子優化，兩階段發酵5-ALA產量達12．4 g/L，進一步過表達來自大腸桿菌的RhtA運輸蛋白，使得5-ALA產量達到14．7 g/L，為目前谷氨酸棒桿菌代謝工程合成5-ALA的最高產量。

2．2．2 C5途徑代謝工程改造合成5-ALA

通過C4途徑的代謝工程改造合成5-ALA，甘氨酸的供給是重要的限制因素，發酵過程中往往需要添加甘氨酸，從而造成成本提高。此外，一定濃度的甘氨酸對菌體的生長有抑制作用，也影響了發酵過程。而谷氨酸棒狀桿菌C5途徑合成5-ALA的過程中，谷氨酸棒狀桿菌的天然產物谷氨酸是5-ALA的前體物，顯示了可以直接利用葡萄糖進行代謝合成5-ALA的天然優勢。

最近，Yu等［34］鑒定了谷氨酸棒桿菌中利用C5途徑合成5-ALA的關鍵基因hemA和hemL，而且他們發現溶氧水平和Fe2+對5-ALA的發酵具有重要的影響，通過在谷氨酸棒桿菌中表達不同來源的hemA和hemL基因，5-ALA的最終產量達到了 1．79 g/L。2015年，Ramzi等［35］將 來 自 鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌(Salmonella typhimurium)的hemA基因定點突變后在谷氨酸棒狀桿菌中表達，同時表達hemL基因，經過發酵優化，5-ALA的最終產量達到了2．2 g/L。

3 展望

近年來，5-ALA的微生物合成已經取得了較大進步，顯示了微生物法工業化生產5-ALA的良好前景。在C4途徑中，ALAS的酶活是關鍵因素，前期研究多集中在不同宿主的hemA基因在模式菌株大腸桿菌中異源表達與選擇。隨著酶工程的發展，通過半理性/理性方法構建穩定的調控解除的ALAS酶，是代謝工程改造合成5-ALA的重要研究方面。到目前為止，通過C5途徑可以實現以葡萄糖為底物的5-ALA合成，然而C5途徑及其5-ALA下游代謝合成血紅素途徑，多為必需基因及其相關途徑，基因調控復雜，這對進一步理性代謝工程改造造成了阻礙，需要進一步加強相關途徑的酶及其基因表達調控的研究，為理性代謝工程改造合成5-ALA提供理論基礎。

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(責任編輯 荀志金)

Advances in 5-aminolevulinic acid microbial production

ZHANG Shuanghong1，2，3，ZOU Yalan1，2，3，SONG Xin4，FENG Lili1，2，3，CHEN Tao1，2，3，WANG Zhiwen1，2，3
(1．School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China;2．Key Laboratory of Systems Bioengineering of the Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China;3．Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China;4．College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

5-Aminolevulinic acid(5-ALA)is a common precursor of the tetrapyrrole biosynthesis pathway in organisms and has broad application potentials in medicine and agriculture．With the rapid development of metabolic engineering and biosynthetic pathway of 5-ALA microbial production，scientists have tried to produce 5-ALA by biosynthesis．Compared to its chemical synthesis，microbial production of 5-ALA has many advantages，including low pollution and high productivity．This review summarizes the recent progress in microbial production of 5-aminolevulinic acid，and analyzed the key factors in 5-ALA production，and discusses future directions of 5-ALA research．

5-aminolevulinic acid;C4 pathway;C5 pathway;biosynthesis

Q812

A

1672-3678(2017)05-0065-06

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．008

2017-07-06

天津市自然科學基金(15JCQNJC06000);國家自然科學基金(21576200、21621004、21390201)

張雙虹(1993—)，女，河北邢臺人，研究方向：發酵工程;王智文(聯系人)，副教授，E-mail：zww@tju．edu．cn