大腸桿菌合成羥基脂肪酸的研究進展

何喬飛，吳 輝

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

大腸桿菌合成羥基脂肪酸的研究進展

何喬飛，吳 輝

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

羥基脂肪酸(hydroxy fatty acids，HFAs)具備羥基和羧基功能團，是聚酯纖維和聚酰胺的前體，是當今綠色聚合物材料的理想單體之一，在醫療、工業和食品等方面有著廣泛應用。本文中，筆者對利用大腸桿菌生物催化合成羥基脂肪酸的不同策略、研究進展及其成果進行綜述，并介紹了大腸桿菌中利用代謝工程策略合成羥基脂肪酸的

研究方向與進展。

羥基脂肪酸;脂肪酸;生物催化;代謝工程;大腸桿菌

羥基脂肪酸(hydroxy fatty acids，HFAs)是由一個或多個羥基和一端具有羧基的長碳鏈組成的飽和或不飽和脂肪酸，根據其碳鏈長、羥基數和羥基位置的不同而種類繁多。羥基脂肪酸中的羥基使其具有特殊的性質，例如較高的熔點、沸點、黏度和反應活性;易傾向于形成二聚物;親水性高，但不溶于水［1］。這些特殊的性質都賦予了羥基脂肪酸重要的應用價值，如它可作為聚酯纖維和聚酰胺的前體，合成綠色環保的聚合物材料［2］;作為藥物中間體和合成前體［3］;作為化妝品成分、表面活性劑、泡沫改進劑、乳化劑和除臭棒原料等［4］;且具有很強的抗真菌活性，在食品生物防腐劑方面的應用十分廣闊［5］。

目前，羥基脂肪酸的生產方法主要有化學合成法和微生物合成法。但是化學合成法有生產成本高、反應過程和提取工藝復雜以及環境污染較為嚴重等缺點，導致該工藝的商業化生產困難。因此，探索操作簡便、成本低廉和綠色環保的生物合成路線是今后羥基脂肪酸發展的趨勢。生物催化技術是指利用微生物代謝過程中所產生的酶或生物有機體作為催化劑對外源化合物進行化學轉化的技術。該技術因綠色環保、操作簡便及特異性強等優點受到國內外學者的廣泛青睞。已有研究報道多種微生物能夠將脂肪酸催化合成羥基脂肪酸。目前，大多數羥基脂肪酸以野生菌發酵和工程菌生產為主。野生菌發酵主要有假單胞菌屬、芽孢菌屬、微菌屬、酵母菌和曲霉屬等多種類型，其中以芽孢菌屬生產羥基脂肪酸為主［6］。吳立新等［7］利用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)突變株M-F641發酵生產ω-羥基脂肪酸，對發酵條件進行優化，ω-羥基脂肪酸的產率達 22．3%。Durairaj等［8］選用來自尖孢鐮孢(FoCYP)的兩種細胞色素P450單加氧酶FoCYP539A7和FoCYP655C2與異源釀酒酵母CPR(ScCPR)和同源尖孢鐮孢CPR(FoCPR)還原酶系統重組，并敲除Saccharomyces cerevisiae的pox1基因以降低β-氧化，實驗發現，同源CYP539A7-FoCPR和 CYP655C2-FoCPR 重組系統分別產生 73．8、52．2 mg/L 的10-羥基癸酸以及72．2、51．9 mg/L的12-羥基十二烷酸和45．1 mg/L羥基辛酸。由于大腸桿菌具備遺傳背景清楚、操作簡便以及生長周期短等優點，已經被廣泛用于生產脂肪酸及其衍生物。本文中，筆者主要闡述大腸桿菌生物催化轉化生產羥基脂肪酸(HFAs)。近些年，代謝工程技術快速發展，利用代謝工程技術對大腸桿菌代謝途徑改造合成羥基脂肪酸也成為重要研究方向，因此，本文也對大腸桿菌代謝合成羥基脂肪酸的相關研究進行系統綜述。

1 羥基脂肪酸生物催化策略

羥基脂肪酸生物催化策略的核心是以脂肪酸為底物的羥化酶，現已經發現多種酶系可以使游離脂肪酸特定碳鏈位置發生羥基化(圖1)：①使用羥化酶和P450酶系(P450s)可直接在特定位置引入羥基;②減少特定位置雙鍵的產生并隨后用去飽和酶和水合酶在雙鍵中進行水合;③減少特定位置雙鍵的產生并隨后進行環氧化，然后使用去飽和酶、環氧化酶和環氧化物水解酶進行水解;④在(順式，順式)-雙鍵和雙鍵生成二羥基后使用脂氧合酶和二醇合酶［9］。

已知參與脂肪酸羥基化的酶有P450單加氧酶、水合酶、脂氧合酶、烷烴羥化酶和二醇合酶，總結于表1。

圖1 羥基脂肪酸合成代謝流程Fig.1 Schematic representation of the metabolic process of synthetic hydroxyl fatty acid

表1 脂肪酸羥基化酶系簡表Table 1 Summary of fatty acid hydroxylase system

1.1 P450酶系

在已開發的幾種策略中，P450酶系是最有效且應用最為廣泛的。細胞色素P450酶作用于底物的非活性甲基端的碳氫鍵，即主要作用于C12～C22的脂肪酸末端第2個碳的羥基化反應，其對底物有較強的專一性，并依賴于NADPH，且催化底物的速度與酶系統來源有很大的相關性［2］。Wang等［20］比較了3種不同的P450基因(LCR、YetO和P450BM3)在大腸桿菌中表達的差異，結果發現，含有LCR基因的菌株僅產生少量的羥基脂肪酸(HFAs)，而含有P450BM3基因的菌株產生了 60．5 mg/L的 HFAs，比含有YetO基因的菌株高1．2倍，產物大多為ω-3-羥基十二烷酸(ω-3-C12：0)、ω-2-羥基十二烷酸(ω-2-C12：0)、ω-1-羥基十二烷酸(ω-1-C12：0)、3-羥基十四烷酸(ω-3-C14：0)、ω-2-羥基十四烷酸(ω-2-C14：0)和ω-1-羥基十四烷酸(ω-1-C14：0)。由此可以證明，P450BM3基因具有最高的催化能力。

脂肪酸羥基化P450酶系可分為羧基末端羥化酶(α-羥化酶)和末端第二位羥化酶(ω-羥化酶)，α-羥化酶催化飽和脂肪酸(C12～C18)和不飽和脂肪酸羧基末端的α位和β位，分別轉化為2-羥基和3-羥基脂肪酸，具有高催化活性［21］。絕大部分P450酶系的催化位點為ω-位，而不同來源的同種酶的催化位點不盡相同，其中來自精氨酸單胞菌的CYP152僅在脂肪酸的 α-位催化羥基化［15］;然而，來自枯草芽孢桿菌的CYP152可同時催化脂肪酸中α-位(40%)和 β-位(60%)的羥基化［22］。目前，研究中最具有挑戰性的是控制長鏈游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)的末端位置羥基化，即 ω-羥基化。負責脂肪酸ω-羥基化的細菌單加氧酶已經從幾種芽孢桿菌屬中克隆出來，包括巨大芽孢桿菌(B．megaterium)［23］、枯草芽孢桿菌(B．subtilis)［24］、炭疽芽孢 桿 菌 (B．anthracis)［25］和 蠟 狀 芽 孢 桿 菌(B．cereus)［26］。其中，來自巨大芽孢桿菌的細胞色素P450BM3是這些酶中研究最透徹的成員。Scheps等［27］將來自 Marinobacter aquaeloei 的單加氧酶CYP153A與來自B．megaterium的P450BM3還原酶結構域融合，并在天然連接域前加上3xGly-Gly-Ser(GGS)，組成CPR2，同時對CYP153A(G307A)進行單點突變后得到CPR2mut，結果表明，與CPR2相比，CPR2mut具有更高的ω-羥化活性。

P450s不僅具有較高的催化活性，還可催化多種有機底物，其反應通常具有較高的區域和立體選擇性，因此，P450酶系具有高度的底物特異性。Munday等［28］比較了CYP102家族的兩種單加氧酶Krac0936和Krac9955的特性，結果發現：Krac0936使用NADPH作為輔因子，主要在直鏈飽和脂肪酸ω-1和ω-2位進行羥基化，且Krac0936對較短的不飽和脂肪酸活性較低，而Krac9955更傾向于氧化較短的脂肪酸，并在ω-4、ω-5和ω-6位進行氧化。

1.2 水合酶

水合酶(hydratase)作用于不飽和脂肪酸的雙鍵，將水分解成氫和羥基，形成羥基脂肪酸。目前已知10-羥基硬脂酸可通過腸球菌(Enterococcus gallinarum)、乳酸桿菌(Pediococcus acidilactici)、乳桿菌 屬 (Lactobacillus sp)［29］、化 膿 性 鏈 球 菌(Streptococcus pyogenes)［30］、大腸球菌(Macrococcus caseolyticus)［31］以及賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus fusiformis)［32］等的水合酶催化合成。來源不同的水合酶對不同底物具有不同的催化活性。雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)［33］和 植 物 乳 桿 菌(Lactobacillus plantarum)［34］對油酸具有最高水合活性，而嗜酸乳桿菌NBRC13951的脂肪酸雙鍵水合酶與亞油酸或γ-亞麻酸作用活躍［35］。在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和 NADH存在下，植物乳桿菌AKU1009a的亞油酸Δ9水合酶通過重組大腸桿菌可將亞油酸轉化為(S)-10-羥基-順式-12-十八碳烯酸(HYA)，轉化率達99%(mol/mol)。同樣地，可使得95%(mol/mol)的具有Δ9碳雙鍵的C18不飽和脂肪酸轉化成相應的10-羥基脂肪酸［36］?；撔枣溓蚓鶰49的肌球蛋白交叉反應性抗原(myosin cross reactive antigens，MCRA)是 FAD 酶，其作為 C16、C18非酯化脂肪酸的(9Z)-和(12Z)-雙鍵上的水合酶，可生產 10-羥基和 10，13-二羥基脂肪酸［30］。因此，水合酶對于10-羥基硬脂酸的生產是至關重要的。

1.3 脂氧合酶

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)催化具有一個或多個(1Z，4Z)-戊二烯的游離多不飽和脂肪酸(PUFA)，形成相應的氫過氧化脂肪酸后再還原成HFAs。脂氧合酶(LOX)在真核生物體中基本上是普遍存在的，并且已被證明存在于許多植物和動物的組織中。目前，作用于花生四烯酸特異性位置的LOX有5-LOX、8-LOX、12-LOX和 15-LOX等，而9-LOX、11-LOX和13-LOX催化亞油酸產生9-HODE、11-HODE和13-HODE。此外，LOX可以與其他蛋白融合，作為融合蛋白中的結構域發生其催化作用，第一個LOX融合蛋白被發現于珊瑚Plexaura homomalla中，在該珊瑚體內，生產8R-氫過氧二十碳四烯酸(8R-HpETE)的LOX結構域與含血紅素的過氧化物酶結構域連接，該融合蛋白將脂肪酸過氧化物轉化成氧化烯，這種不穩定的中間體可進一步轉化為環戊烯酮二十烷酸［17］。近年來，對脂氧合酶的探究已取得一定的進展，但對其結構和功能上仍有許多不確定因素還有待研究。

1.4 烷烴羥化酶

另一種催化脂肪酸及其衍生物ω-羥基化的重要酶系是來源于惡臭假單胞菌的烷烴羥化酶(即AlkBGT)。AlkB是膜結合型烷烴羥化酶，AlkG是紅素氧還蛋白，可將電子傳遞到AlkB以進行ω-羥基化，AlkT是紅素氧還蛋白還原酶。與脂肪酸相比，AlkBGT可以更加有效地ω-官能化脂肪酸甲酯，且外膜蛋白AlkL可促進ω功能化。Van Nuland等［37］研究發現，表達AlkBGT系統的大腸桿菌可以ω-氧化壬酸乙酯(NAEE);AlkBGT可以ω-氧化C6～C10脂肪酸的乙基、丙基和丁基酯。此外，增加烷基鏈的長度還可提高其對C6和C7脂肪酸酯的ω-氧化活性，且AlkBGT和AlkL的共表達使得NAEE的ω-氧化活性提高 1．7 倍［37］。

1.5 二醇合酶體系

二醇合酶(diol synthase，DS)通常也被稱為脂肪酸二羥基化酶，可以通過組合使用相同或不同的酶，包括P450、脂氧化酶、水合酶和羥化酶，形成多種類型的二羥基脂肪酸。Kaprakkaden等［38］通過使用3種不同類型的脂肪酸修飾酶，分別為來自S．cerevisiae的脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase，FAD)、來自Caenorhabditis elegance的環氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH)和來自 Stokasialaevis的環氧化酶(epoxidase，EPOX)，最終成功合成了 9，10-二羥基十六烷酸。在巨大芽孢桿菌中，發現環氧化的雙鍵可以被相同的P450單加氧酶催化生成長鏈ω-羥基脂肪酸，進一步利用水合酶可生成二羥基脂肪酸［39］。三羥基脂肪酸在脂肪?；溨斜榷u基脂肪酸多一個羥基，它們比其他HFAs具有更高的反應活性和特殊的生理功能。銅綠假單胞菌PR3也可以將蓖麻油酸轉化為7，10，12-三羥基油酸(7，10，12-THOD)，產率為約 45%［40］。曲霉屬菌能表達具有脂肪酸雙加氧酶活性的蛋白或非功能性氫過氧化物異構酶/細胞色素P450結構域融合蛋白，如5，8-亞油酸二醇合酶(LDS)和 10R-雙加氧酶(DOX)。7，8-LDS 和 5，8-LDS 的 N-末端氫過氧化物異構酶結構域顯示與P450酶系具有同源性［41］，表明其與P450的催化作用相似。來自Nostoc sp．的二醇合酶PCC7120由脂氧合酶和烯丙氧基合酶組成，它可將亞油酸轉化為9，14-二羥基亞油酸(9，14-diHODE)、9，10-diHODE、8，11-diHODE 和 9-HODE;將 α-亞麻酸轉化為 9，16-二羥基亞麻酸(9，16-diHOTE)和 9，13-diHOTE、9-HOTE;將 γ-亞麻酸轉化為9，14-diHOTE和9-HOTE;將花生四烯酸轉化為11，16-二羥基花生四烯酸(11，16-diHETE)和11-HETE［42］。

以上概述的是羥基脂肪酸合成途徑中的關鍵酶，這些酶的表達直接影響到最終產物羥基脂肪酸的種類及其產量，而影響最終產量的另一關鍵因素是前體脂肪酸的通量。因此，工程化整體代謝途徑將碳通量導向脂肪酸是非常重要的。

2 羥基脂肪酸的從頭生物合成途徑

利用代謝工程手段改造大腸桿菌生產脂肪酸及其衍生物也成為當今研究的熱點。大腸桿菌中羥基脂肪酸的合成途徑中涉及脂肪酸合成、脂肪酸β-氧化、α-氧化和ω-氧化等。大腸桿菌使用II型脂肪酸合成酶(FAS)催化脂肪酸生物合成途徑。II型FAS的直接產物是脂肪酰-ACP，其需要通過硫酯酶(thioesterase，TE)水解以釋放游離脂肪酸，并且隨后通過脂肪酰-CoA連接酶活化為脂肪?；?CoA。然而，野生型大腸桿菌并不能積累脂肪酸并進一步轉化為HFAs。為了實現工程大腸桿菌利用葡萄糖從頭轉化HFAs的目標，需要①通過過表達硫酯酶來過量產生游離脂肪酶(FFA)，表達外源性脂肪酸羥化酶將FFA轉化為HFAs;②直接利用脂肪酸生產途徑中的中間代謝產物，通過硫酯酶直接催化生產HFAs。圖2(a)為大腸桿菌利用葡萄糖合成羥基脂肪酸的整體代謝途徑。

2.1 增加前體脂肪酸的合成

基因工程大腸桿菌脂肪酸生物合成(FASII)途徑是生產脂肪酸衍生物的關鍵途徑。此途徑中的關鍵酶包括乙酰CoA羧化酶(ACCase)、丙二酰輔酶A-ACP轉酰酶(FabD)、β-酮?；?ACP合成酶 III(FabH)、β-酮?；?ACP 還原酶(FabG)、β-羥基?；?ACP脫水酶(FabA、FabZ)以及硫酯酶等。對以上幾個關鍵酶的組合表達是提高脂肪酸合成量的一個有效策略，如圖2(b)所示。其中，硫酯酶的表達對于在大腸桿菌中產生FFAs是最為關鍵的。首先，它是連接前體和脂肪酸的直接橋梁。其次，它消耗長鏈?；鵄CP，直接增加導向脂肪酸合成的通量，并降低由脂酰-ACP引起的反饋抑制。最后，硫酯酶的底物特異性決定了產物鏈長，大多數硫酯酶對C16～C18?；溇哂凶罡叩奶禺愋?。與此同時，在大腸桿菌天然體系中，脂肪酸會通過β-氧化循環進行降解，這顯然不利于脂肪酸的積累，可通過敲除或下調β-氧化循環中的關鍵基因fadD和fadE以阻止或減緩脂肪酸的降解，從而提高總脂肪酸產量。Zhang等［43］過表達來自4種不同生物的 fabD基因，最終提高中長鏈游離脂肪酸產量約11%。Jawed等［44］過表達 FabZ、ACCase和硫酯酶，同時抑制FabR的表達后，得到總短鏈游離脂肪酸產量為17．5 g/L。Cao 等［45］過表達硫酯酶基因 tesA’后，合成了大約108．5 mg/L的脂肪酸，為了增加脂肪酸前體的供應，其共表達TesA和ACCase后，脂肪酸產量達到188．6 mg/L;在搖瓶條件下，過表達E．coli BL21(DE3)硫酯酶(TesA)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)，同時敲除fadD，并插入細胞色素P450酶(P450BM3)，最終產生 58．7 mg/L 的 HFAs。Xu等［46］通過表達tesA’，脂肪酸產量與親本菌株相比，增長了近90%。Bowen等［47］選用了2種不同的硫酯酶(UcFatB2和TesA)，最終分別得到230 mg/L C14 FFA和367 mg/L C12 FFA。不同物種的?；?ACP硫酯酶具有不同程度的鏈長特異性。Zhang等［48］研究了來自 Diploknema butyracea、Gossypiumhirsutum，R．communis和 Jatropha curcas的?；?ACP硫酯酶基因過表達對游離脂肪酸產量的影響，結果表明：脂肪酸的積累量很大程度上取決于所選用的硫酯酶，其中來自 R．communis和 J．curcas的?；?ACP硫酯酶產生FFA超過2．0 g/L，且主要產物為C14、C16：1和C16 直鏈FFA。Zhang等［49］通過調整工程化大腸桿菌宿主中FadR的表達，將脂肪酸質量濃度增加 7．5倍，達到了 5．2 g/L。大腸桿菌FadL為外膜游離脂肪酸轉運蛋白，它可由橫向擴散通過外膜轉運外源性游離脂肪酸。Jin等［50］研究過表達fadL以增加膜內游離脂肪酸的量，結果發現：與沒有過表達fadL的菌株相比，過表達fadL菌株的ω-羥基棕櫚酸產量增加了80．7%，該結果表明fadL的過表達增強了棕櫚酸轉運到細胞中的能力。Tan等［51］發現OmpF蛋白作為三聚體存在于外膜中，并參與外膜上的糖、離子、抗生素和蛋白質的轉運。外膜蛋白基因ompF的缺失可以顯著增加膜完整性，脂肪酸耐受性，同樣可以提高脂肪酸產量。實驗數據表明，與僅過表達 fadL的菌株相比，敲除ompF的同時過表達fadL菌株的脂肪酸產量高出20%。Shin等［52］將弗氏藤桿菌丙酸桿菌的甲基丙二酰CoA羧基轉移酶(methylmalonyl CoA carboxytransferase，MMC)基因導入大腸桿菌中表達，可繞過調節乙酰CoA羧化的復合體系，引入MMC旁路將碳通量從TCA循環重新導向到FFA合成，減少細胞生長抑制并減少乙酸鹽形成，最終FFA產量提高2．5 倍［52］。

圖2 大腸桿菌合成脂肪酸及羥基脂肪酸的代謝途徑(a)及代謝工程改造策略(b)Fig.2 Schematic representation of the metabolic pathway of fatty acid and hydroxyl fatty acid biosynthesis in Escherichia coli(a)and strategies of metabolic engineering(b)

此外，奇數鏈 FFA合成的研究也為奇數鏈HFAs創造了可能。Wu等［53］通過表達?；鵄CP硫酯酶(TE)，丙酰 CoA合成酶(PrpE)和 β-酮?；?ACP合成酶III(FabH)，最終工程大腸桿菌利用葡萄糖和丙酸鹽產生奇數直鏈FFA的最高總質量濃度達1 205 mg/L，其中85%為C15 FFA。另外，特定的硫酯酶可以直接催化脂肪酸合成循環中的中間代謝產物 β-羥?；?ACP 生成 HFAs。Zheng 等［54］利用PhaG，以葡萄糖底物生產了196 mg/L的3-羥基癸酸。Wang等［55］也證明了PhaG可作為β-羥?；?ACP硫酯酶，將β-羥?；?ACP直接催化為β-羥基脂肪酸。

最近有報道提出逆β-氧化循環(r-BOX)可作為合成中鏈脂肪酸及其衍生物(medium chain fatty acids，MCFA)的潛在平臺。與傳統的脂肪酸合成途徑不同的是，r-BOX直接利用乙酰CoA進行延伸，通過硫解酶、羥?；鵆oA脫氫酶和硫酯酶等關鍵酶形成反轉β-氧化循環。Wu等［56］通過表達硫解酶(bktB)、羥?；?CoA脫氫酶/烯酰 CoA水合酶(fadB)、反式-烯醇CoA還原酶(ter)、硫酯酶(ydiI)和乙酰CoA合成酶(acs)基因，得到MCFA產量為2．8 g/L。Clomburg 等［57］結合反轉 β-氧化循環和ω-氧化途徑，選擇硫解酶(bktB)、硫酯酶(ydiI)和來自惡臭假單胞菌的烷烴羥化酶系AlkBGT，產生大于0．8 g/L 的 C6～C10 ω-HFAs。r-BOX 循環已被證明可用于脂肪酸及其衍生物的生產，該循環的建立將有助于進一步擴展代謝工程策略來從頭合成羥基脂肪酸。

此外，隨著合成生物學的發展，近年來新興的一種基因編輯技術CRISPR/Cas系統因其快速、簡單、高效的優點受到廣泛青睞。Xia等［58］利用CRISPR/Cas系統敲除了β-氧化循環的第一個關鍵酶基因fadD和催化丙酮酸進入蛋白質合成途徑的基因ppc，結果顯示，敲除fadD基因的菌株產生835．4 mg/L脂肪酸，相對于野生型來說，脂肪酸含量增長了4．9%，而ppc基因的敲除對于脂肪酸合成并無顯著影響。CRISPR/Cas系統在大腸桿菌合成脂肪酸領域中的這一應用為脂肪酸合成策略拓寬了思路。

2.2 減少副產物的形成

在構建從頭合成羥基脂肪酸代謝途徑中，消除或減少途徑中代謝副產物的積累是增強代謝通量的關鍵一步，脂肪酸合成途徑以乙酰CoA為起始單位、丙二酰-ACP為擴增單位進入循環。在大腸桿菌中，丙酮酸可通過多條代謝途徑產生乳酸、乙酸等代謝副產物，可通過對相關基因的敲除或下調以實現副產物通路的阻遏，以此來增加目標產物的積累。途徑中形成的乙酸鹽是一種有毒副產物，也是最主要的代謝副產物，可抑制細胞生長，在大腸桿菌中主要的兩種乙酸鹽生產途徑是通過乙酸激酶/磷酸轉乙酰酶(AckA-Pta)和丙酮酸氧化酶(PoxB)。Li等［59］研究了 fadD 突變菌株(ML103)、ack-pta 和poxB雙突變株(ML112)以及fadD、ack-pta和 poxB三突變株(ML115)中乙酸鹽途徑的阻遏對FFA產量及其組成的影響，結果發現：fadD的缺失對FFA產量的影響很小，消除乙酸鹽生產途徑確實使乙酸鹽濃度降低，但卻幾乎沒有改善FFA的產量，這可能是由于從乙酸“回收”的一些碳被轉移到了丙酮酸鹽。Lin等［60］將敲除pta基因的菌株與未敲除pta基因的菌株相比，乙酸濃度降低約30%，FFA產量達84．9 mg/g(以細胞干質量計)，增加約26%，且總脂肪酸組分中C12和C14脂肪酸的比例明顯提高。由于敲除乙酸鹽生成途徑可能導致產物特異性發生變化，因此，可以考慮是否通過乙酸鹽利用途徑中乙酰CoA合成酶的過表達將碳通量重新導向乙酰CoA以改善FFA產量。Wu等［56］研究發現，過表達acs的菌株中，乙酸鹽的濃度明顯降低，且細胞中乙酰CoA的量增加了271．3%。該結果證明，過表達乙酸鹽利用途徑是增加FFA合成起始單位乙酰CoA的有效策略。另外，他們利用CRISPRi系統抑制乙醇脫氫酶(adhE)、磷酸轉乙酰酶(pta)、丙酮酸脫氫酶(poxB)、乳酸脫氫酶(ldhA)和琥珀酸脫氫酶(frdA)的基因，觀察各靶基因對應的副產物濃度發現，CRISPRi系統確實起到控制基因表達的作用，抑制 adhE、pta、poxB、ldhA和 frdA基因表達，分別提高中鏈 FFA 產量 11．5%、20．4%、5．6%、7．9%、10．7%，其中抑制pta基因的菌株表達產量最高達3．2 g/L。

3 總結與展望

羥基脂肪酸(HFAs)在各領域內都有廣泛的應用，包括聚合材料、食品添加劑、化妝品、表面活性劑和藥品等，具有較高的商業價值，因此也越來越受到人們的關注。羥基脂肪酸種類眾多，利用微生物法合成可以增加產物特異性，降低產物分離純化的成本，在制備工藝上具有一定的優勢。目前，大多數微生物合成羥基脂肪酸的研究主要集中于對催化酶系的開發，轉化外源脂肪酸。本文中，筆者針對大腸桿菌中采用生物催化與代謝工程合成羥基脂肪酸的不同策略、研究進展及其成果進行綜述，而通過大腸桿菌利用葡萄糖等底物從頭生產羥基脂肪酸的探索還不成熟，對其進行代謝工程改造以適應大規模、高產率的工業化生產仍是今后研究的主要方向之一。

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(責任編輯 荀志金)

Advances in biosynthesis of hydroxy fatty acids by Escherichia coli

HE Qiaofei，WU Hui
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai，200237，China)

Hydroxy fatty acids containing hydroxyl and carboxyl functional groups are ideal precursors of green polymer materials，poly ester fibers and poly amides．They are widely used in medical，industrial and food fields．We review here the research progress of hydroxy fatty acid biosynthesis by Escherichia coli．Metabolic engineering strategies to improve hydroxy fatty acid synthesis in engineered Escherichia coli are also reviewed．

hydroxy fatty acids;fatty acid;biocatalysis;metabolic engineering;Escherichia coli

Q819

A

1672-3678(2017)05-0071-09

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．009

2017-07-23

國家自然科學基金青年基金(21406065)國家自然科學基金面上基金(21776083);國家重點研發計劃(2017YFB0309302);上海市“科技創新行動計劃”基礎研究領域項目(17JC1404800);工業生物催化教育部重點實驗室開放課題(2015101);中央高?；究蒲袠I務費探索研究基金(222201313007、22A201514042);生物反應器工程國家重點實驗室開放課題

何喬飛(1994—)，女，浙江臺州人，研究方向：生物催化與生物轉化;吳 輝(聯系人)，副教授，E-mail：hwu@ecust．edu．cn