一株犬種布魯氏菌的鑒定及毒力測定

張 賀，徐 磊，王苗苗，王 楠，張金亞，丁家波，朱良全，周桂蘭，毛開榮*, 周雙海

(1.北京農學院，北京102206；2.中國獸醫藥品監察所，北京100081；3.北京市畜牧獸醫總站，北京100107)

一株犬種布魯氏菌的鑒定及毒力測定

張 賀1,2，徐 磊2，王苗苗2，王 楠2，張金亞2，丁家波2，朱良全2，周桂蘭3，毛開榮2*, 周雙海1*

(1.北京農學院，北京102206；2.中國獸醫藥品監察所，北京100081；3.北京市畜牧獸醫總站，北京100107)

對分離到的一株疑似犬種布魯氏菌進行生物特性和基因型鑒定，并用宿主實驗動物(比格犬)測定了最小感染量和脾含菌量。形態與染色特性、培養特性、血清學特性、生化特性鑒定以及Multi-PCR和16S rRNA測序結果表明，該分離株為犬種布魯氏菌，其對比格犬的最小感染劑量為105CFU/mL，對應的脾含菌量為4×105～3×106CFU/g。

犬種布魯氏菌；分離鑒定；最小感染劑量；脾含菌量

Correspondingauthor:MAOkai-rong,E-mail:kairongmao@sohu.com;ZHOUShuang-hai,E-mail: 13522630832@163.com

Abstract: In this study, an isolated strain ofBrucellawas identified by biological feature and genotype, and determined the minimum infected dose (MID) and bacteria content of spleen in experimental animals (beagle). This isolated strain isBrucellacainswhich was identified by dyeing properties, culture characteristics, serological characteristics, biochemical characteristics, and further identified by Multi-PCR and 16S rRNA. The MID is 105CFU/mL in beagle, and the content is 4×105～3×106CFU/g in spleen.

Keywords:Brucellacanis; isolation and infection; minimum infected dose (MID); the content of becteria in spleen

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是由布魯氏菌引起的一種嚴重的人畜共患病。布魯氏菌屬分為10個種，即牛種、羊種、豬種、綿羊附睪種、犬種、沙林鼠種、海洋種(鯨型和鰭型)、田鼠型、湖浪型[1]。其中牛種、羊種和豬種布魯氏菌屬于光滑型布魯氏菌，均可以引起人感染布病[2]；犬種布魯氏菌屬于粗糙型菌株，主要引起犬類動物發病[3]，臨床癥狀表現為母犬流產、公犬附睪炎等。1966年L.E.Carmichael等[4]首次在患病犬的組織和陰道分泌物中發現了犬種布魯氏菌，1987年林錦光等[5]首次在福建省分離到1株犬種布魯氏菌。犬種布魯氏菌對人的毒力較低[6]，但由于犬也是光滑型布魯氏菌的易感動物，所以當光滑型布魯氏菌感染犬后同樣會對人類健康和公共衛生安全構成威脅。本研究對新分離到的一株疑似犬種布魯氏菌(命名為BJ1601株)進行了形態特性、培養特性、血清學特性和生化特性鑒定，采用Multi-PCR和16S rRNA測序方法進行了基因型鑒定，確定該菌株為犬種布魯氏菌，并測定了該菌株對比格犬的最小感染劑量。

1 材 料

1.1 參考菌株、對照菌株的來源 參考菌株為B.canisRM6/66，對照菌株包括B.abortusA19、B.melitenisisM5和B.suisS2，均由國家獸醫微生物菌種保藏中心保存。

1.2 實驗動物 150日齡的比格犬12只，母犬，購自維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 主要試劑、儀器、材料及培養基 pH8.9 Menzel 緩沖液(蒸餾水100 mL、碳酸鈉0.795 g、碳酸氫鈉7.14 g、氯化鈉5 g、苯酚5 g)； 2×Taq Master Mix 購自北京康為世紀公司；DNA Marker DL2000購自TAKARA公司；生化特性鑒定試劑購自北京陸橋技術有限責任公司；硫堇和堿性品紅染料購自北京鼎國生物技術發展中心；單因子血清A、M、R均由本實驗室保存。

2 方 法

2.1 細菌的鑒定

2.1.1 形態特性鑒定 將分離到的BJ1601菌株37 ℃培養72 h，挑取單菌落涂抹于玻璃片上，火焰固定后進行革蘭氏染色，觀察；將BJ1601用戊二醛固定后做電鏡觀察。

2.1.2 培養特性與布魯氏菌S/R型鑒定 將BJ1601分別在TSA和普通瓊脂培養基上培養，觀察菌落生長情況。將結晶紫染色液覆蓋長滿單個菌落的TSA平板，染色大約20 s后觀察，并用光滑型B.abortusA19作對照。粗糙型菌落邊緣著色，界限不清晰。光滑型菌落邊緣不著色，整齊，圓潤[7]。

2.1.3 生化特性鑒定 按照文獻[3]的方法操作。CO2需求試驗：將BJ1601分別置于5% CO2和大氣環境中培養，48 h后觀察是否生長。H2S生成試驗：將BJ1601接種于H2S生化反應管內，觀察生化反應管是否有褐色沉淀生成。染料抑制試驗：將BJ1601分別接種于硫堇和堿性品紅培養基中，48 h觀察是否生長。

2.1.4 血清學特性鑒定 取布魯氏菌單因子血清A、M和R，與等體積的BJ1601懸液充分混合，1～2 min內觀察結果。

2.1.5 Multi-PCR鑒定 以滅活后的BJ1601、B.abortusA19、B.melitenisisM5、B.suisS2、B.canisRM6/66菌株為模板，各1 μL，反應體系為50 μL。參照文獻[8]合成Multi-PCR引物序列(表1)。PCR反應程序為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物進行凝膠電泳分析。

表1 Multi-PCR引物序列Tab 1 The sequence of primers for Multi-PCR

2.1.6 測序比對 將BJ1601的凝膠條帶膠回收后送測序，把測序結果進行BLAST比對。

2.1.7 16S rRNA測序鑒定 參考文獻[9]合成的16S rRNA一對引物F3-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和R3-ACGGCTACCTTGTTACGACTT對樣品進行基因擴增。以滅活BJ1601和滅活B.canisRM6/66為模板，各1 μL，反應體系為20 μL。反應條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，進行30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小正確后送測序。

2.2 脾含菌量和最小感染劑量測定

2.2.1 感染動物 用TSA扁瓶培養基繁殖分離菌株，用生理鹽水將細菌洗下來，細菌計數后用生理鹽水稀釋成103、105、107、109CFU/mL四個菌液濃度，比格犬肌肉注射，3只/組，1 mL/只，依次編為1～12號，飼養30 d后剖殺。

2.2.2 脾含菌量及其他組織含菌量測定 無菌剖殺，分別取脾臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結和頜下淋巴結，各稱取1 g研磨混懸，將研磨液接種TSA培養至少72 h，根據生長的菌落數，計算各個組織的含菌量(CFU/g)。

2.2.3 全血及組織分離菌Multi-PCR鑒定 無菌剖殺后取全血涂板培養，接種TSA培養至少72 h。挑取全血及各組織培養皿上的單菌落，滅活后做模板，同時設立B.abortusA19、B.melitenisisM5、B.suisS2、B.canisRM6/66菌株對照，1 μL/株，反應體系為50 μL。引物及反應程序按照2.1.5方法進行，PCR產物進行凝膠電泳分析。

2.2.4 抗體效價測定 參考《中華人民共和國獸用制品規程》的方法用B.canisRM6/66制成試管凝集抗原。將采集的犬血分離血清按照參考文獻[6]方法進行微量試管凝集試驗測定抗體效價。

3 結 果

3.1 細菌的鑒定結果

3.1.1 形態特性 革蘭氏染色結果表明，BJ1601為革蘭氏陰性菌；掃描電鏡(4000×)觀察表明，BJ1601為球桿狀，無莢膜、無芽孢。結果見圖1。

圖1 革蘭氏染色100×(A)和掃描電鏡照片4000×(B)Fig 1 Photograph of Gram’s(A)and SEM 4000×(B)

3.1.2 培養特性與細菌S/R型鑒定結果 BJ1601能夠在TSA培養基上生長，呈透明、圓形、隆起的小菌落，培養時間至少72 h。結晶紫染色后用放大鏡觀察菌落邊緣著色情況：BJ1601與粗糙型B.canisRM6/66菌落邊緣著色，界限不清晰；光滑型菌株B.abortusA19邊緣不著色，整齊，圓潤，表明BJ1601為粗糙型布魯氏菌。

3.1.3 生化特性和血清學特性鑒定結果 BJ1601與B.canisRM6/66的生長都不依賴CO2且都不產生H2S。在加入硫堇染料(1︰50000)的培養基上仍能生長，在復紅染料(1︰50000)的培養基上不能生長。單因子血清凝集試驗只與R血清產生凝集現象。結果詳見表2。

表2 布魯氏菌生物分型結果Tab 2 Result of typing of Brucella strain

“-”表示結果為陰性；“+”表示結果為陽性

"-"means the result is negative；"+"means the result is positive

3.1.4 Multi-PCR鑒定結果 BJ1601與B.canisRM6/66均有一條272 bp的條帶，牛、羊均只有一條591 bp的條帶，豬分別有272 bp、591 bp兩條條帶，與參考文獻[8]的鑒定結果一致，結果詳見圖2。將PCR產物膠回收后測序，測序結果顯示該片段為預期大小272 bp，通過BLAST分析顯示，BJ1601與NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中與BrucellacanisRM6/66株、BrucellacanisHSK株以及BrucellacanisSVA13等菌株的核苷酸序列基本一致。

M:Marker 2000; 1：BJ1601；2：B.canis RM6/66；3：B.abortus A19；4：B.suis S2；5：B.melitenisis M5圖2 BJ1601的Multi-PCR鑒定Fig 2 Multi-PCR identification for BJ1601

3.1.5 16S rRNA比對結果 用16S rRNA引物擴增分離菌株的基因序列，結果顯示得到一條大小約為1400 bp的片段(圖3)。測序結果顯示，該分離株的16S rRNA基因序列與預期大小一致，該菌株與NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中與BrucellacanisRM6/66株、BrucellacanisHSK株以及BrucellacanisSVA13等菌株核苷酸相似性為100%。上述結果表明BJ1601為犬種布魯氏菌，正式命名為BrucellacanisBJ1601株。

M:Marker 2000;1-2：BJ1601 3：B.canis RM6/66；圖3 BJ1601的16S rRNA-PCR鑒定Fig 3 16S rRNA-PCR identification for BJ1601

3.2 脾含菌量與最小感染劑量測定結果

3.2.1 脾含菌量及其他組織分離到的細菌數 脾菌落分離結果顯示，脾含菌量最高為4×105～3×106CFU/g，超過了布魯氏菌強毒(脾含菌量2×105CFU/g以上)的判定標準[10]，表明BJ1601為布魯氏菌強毒株。其他菌落分離結果表明：淋巴結分離到的菌量相對較多，肝臟次之，腎臟分離到的菌量最少，且隨著感染劑量的增加，各組織中分離到的菌量也逐漸增加。感染劑量為103CFU/mL組的1/3只犬所有組織和全血中均未分離到菌，105CFU/mL組的3/3只犬各組織全部分離到菌，因此將105CFU/mL確定為最小感染劑量，結果詳見圖4 。

圖4 各組織分離到的細菌數(CFU/g)Fig 4 The number of bacterias isolated from different organs

3.2.2 全血及組織分離菌的Multi-PCR鑒定結果

對4組試驗犬的組織分離培養結果表明，除了103CFU/mL組3號犬的組織分離物培養皿中沒有長出菌落，其他組犬的肝、脾、腎、腸系膜淋巴結、頜下淋巴結分離物培養皿中均長出菌落，通過Multi-PCR檢測結果為陽性(圖5)。全血培養發現2、4、7、10、11、12號犬也分離到了陽性菌BJ1601，表明犬的布病能夠引發犬出現菌血癥。結果詳見圖6。

M:Marker 2000;1-11: 犬1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12； 12：B.canis RM6/66；13：B.abortus A19；14：B.suis S2；15：B.melitenisis M5圖5 脾臟分離菌的Multi-PCR鑒定Fig 5 Multi-PCR identification for tissue

M:Marker 2000;1-7: 犬2、4、7、10、11、12； 8：B.canis RM6/66；9：B.abortus A19；10：B.suis S2；11：B.melitenisis M5圖6 全血分離菌的Multi-PCR鑒定Fig 6 Multi-PCR identification for whole blood

3.2.3 抗體效價測定結果 各組試驗犬的血清都有抗體效價，隨著BJ1601感染劑量的增加，試驗犬血清的抗體效價也上升。結果見表3。

表3 抗體效價測定結果Tab 3 Result of Micro tube agglutination test

抗體效價為血清稀釋倍數

The serum dilution times indicated the titer of the antibody

4 討 論

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，犬的飼養量也大幅度增加，更多的人選擇犬作為寵物飼養。同時犬的疫病流行也隨之變得嚴重和復雜，其中犬布病在我國廣泛流行[10]，由于犬布病不容易察覺，只在出現流產癥狀的時候才被懷疑感染布病，因此采用主動檢測是發現犬布魯氏菌病的有效途徑。本實驗室從北京的幾只同群寵物犬身上分離到3株疑似布魯氏菌菌株，通過對其中一株菌株的全面鑒定，顯示其具有典型的犬種布魯氏菌的特性，證實為犬種布魯氏菌，并命名為BJ1601。進一步的毒力測定顯示，其具有較強的毒力，符合強毒布魯氏菌的特性，并測得其對比格犬的最小感染劑量為105CFU/mL，對建立犬布魯氏菌病感染研究模型具有一定參考價值。本次試驗直接用比格犬是考慮到其他動物不是犬種布魯氏菌的敏感動物，但受條件所限，本次感染試驗共采用12只比格犬，分為4個試驗組，其中103CFU/mL組有一只犬的血清中測出了抗體效價，但組織器官及全血中沒有分離到菌，105CFU/mL組中三只犬的抗體水平不均一，考慮可能是由于樣本數量不足導致個體差異明顯，有待進一步的探究。

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(編輯：李文平)

IsolationandIdentificationforaVirulentStrainofBrucellacains

ZHANG He1,2，XU Lei2, WANG Miao-miao2, WANG Nan2, ZHANG Jin-ya2, DING Jia-bo2, ZHU Liang-quan2, ZHOU Gui-lan3, MAO Kai-rong2*, ZHOU Shuang-hai1*

(1.BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 3.TheAnimalHusbandryandVeterinaryStationofBeijing,Beijing100029,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.01

2017-06-07

A

1002-1280 (2017) 09-0001-06

S852.61

張 賀，碩士研究生，從事布魯氏菌病疫苗研究。

毛開榮，E-mail：kairongmao@sohu.com；周雙海，E-mail：13522630832@163.com