FTIR對酒燉熟地黃炮制終點的量化分析

樊克鋒，趙建平，湯法銀，孫素琴，周 群

(1.河南牧業經濟學院，鄭州 450046; 2.清華大學，北京100084)

FTIR對酒燉熟地黃炮制終點的量化分析

樊克鋒1，趙建平1，湯法銀1，孫素琴2，周 群2

(1.河南牧業經濟學院，鄭州 450046; 2.清華大學，北京100084)

利用紅外光譜(FTIR)對酒燉熟地黃進行炮制過程和炮制終點評價分析。通過對熟地黃炮制過程中其整體紅外特征吸收峰的變化趨勢和變化規律來表征熟地炮制過程中其化學成分、生物形態(色味變化)及藥學性質等的變化特點，最終利用熟地黃紅外特征吸收峰(如1058、1026、817、797、777、1819、800及778 cm-1等)和相關峰面積比(A1/A2)等多因素指標來量化熟地黃“黑如漆，甜如飴”之傳統炮制經驗，制定酒燉熟地黃“炮制終點”紅外標準，規范熟地炮制工藝，保證熟地質量品質。

FTIR;酒燉熟地黃;過程分析;相關峰面積比(A1/A2);炮制終點

Abstract: Evaluation and analysis on the processing and the processing end-point of wine stewed Rehmannia by FTIR. Through the whole process of characteristic IR absorption peaks of Radix Rehmanniae and Radix Rehmanniae changes in trends and changes in the law to characterize the processing of Radix Rehmanniae and its chemical composition and biological morphology (color taste change) change characteristic and pharmaceutical properties etc., Finally, useding multi factor index of infrared absorption characteristics(e.g.1058、1026、817、797、777、819、800 and 769 cm-1etc.) and correlation-peak-area ratio(A1/A2) of Radix Rehmanniae to quantify the traditional processing experience of "Black like paint, sweet as maltose" of Radix Rehmanniae, making infrared standard of wine stewed Rehmannia of “processing end-point”, specificating of processing technology of Radix Rehmanniae, ensuring the quality of Radix Rehmanniae.

Keywords: FTIR; wine stewed Rehmannia; process analysis; correlation-peak-area ratio(A1/A2); processing end-point

地黃系玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥塊根，始載《神農本草經》，為上品。生地，性涼味甘苦，功用清熱涼血、養陰生津；熟地，性溫味甘，功用滋陰補血、益精填髓，二者藥性及功效不同。因此，生地炮制加工成熟地，其炮制質量對保證其藥性及功效非常重要。傳統熟地加工炮制“各地各法”甚多，《中國藥典》收載兩種：清蒸和酒燉。熟地傳統經驗標準(“黑如漆，甜如飴”)和《中國藥典》規定(酒燉加工至酒吸盡，表面和斷面呈烏黑，有光澤，味甜等)都沒有客觀確切的量化標準，難以滿足熟地炮制工藝規范化和飲片質量標準化的要求和臨床應用要求。研究利用紅外光譜法宏觀快速跟蹤熟地整個炮制過程，通過分析紅外譜圖整體特征變化趨勢和變化規律，來量化熟地加工最佳“炮制終點”。

紅外光譜(FTIR)檢測分析復雜混合體系的中藥，其光譜特征具有化學信息整體綜合性特點與優勢，其指紋性如同單一組分一樣，光譜中的峰位、峰形、峰強度代表著體系中所含相應各種基團的譜峰，它反映的是一個混合體系中各種成分的疊加譜，不同混合體系其相應的化學組成不同，會引起分子光譜整體譜圖的變化，因此便構成譜圖的宏觀整體 “指紋”性。憑借這些宏觀整體“指紋”特征，可以直接地或者借助數學處理進行中藥的鑒定與質量評價。針對紅外光譜分析中藥復雜混合體系，清華大學孫素琴教授根據混合物紅外光譜整體宏觀特征建立了一系列針對性方法，即“多級紅外光譜宏觀指紋分析法”[1-2]，其分析原則是“從整體分析到特征分析，先定性分析再量化分析”。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器設備：Spectrum GX型付里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin-Elmer)；生地黃：購于河南武陟縣飲片廠(統貨)，河南中醫藥大學生藥學教研室鑒定；酒燉地黃炮制樣品：由上述生地黃樣品炮制加工而成，即參照《中國藥典》及《河南中藥材炮制規范》熟地黃項下要求：取生地黃適量，切片，50%量加黃酒，悶過夜，三角瓶口藥棉塞緊，隔沸水燉60 h，每隔若干小時取樣一次，低溫干燥，粉碎(80目)，做供試樣。黃酒：浙江紹興雙宮燈黃酒生產。

1.2 方法 測試條件：測定范圍4000～400 cm-1，中紅外DTGS檢測器，OPD速度2 cm/s，掃描次數16次，分辨率4 cm-1，實時扣除H2O和CO2；測定方法：KBr壓片法制樣，取供試樣及溴化鉀(光譜純)各適量充分混合研磨均勻，壓片，按測試條件測定，得樣品紅外光譜圖；二階導數譜：利用儀器自帶軟件獲取，即打開樣品紅外光譜(吸光度譜)，選[處理]→[導數]→[導數階數-二階]→[斜率計算數據點數量-13]即可；色譜方法和條件：參《中國藥典》(一部)地黃項下梓醇含量高效液相法測定[3]，ODSC18色譜柱，流動相乙腈-水(0.6∶99.4)，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃。

2 結 果

2.1 地黃炮制過程顏色性狀變化 《中國藥典》描述熟地黃“表面和斷面呈烏黑”。從樣品粉末顏色性狀來看，酒燉過程中顏色由生地棕黃色逐漸轉變為烏黑色，5 h時樣品粉末還略有棕黃色影痕，10 h時樣品粉末完全呈烏黑色，如圖1所示。那么，按照經驗判斷熟地“顏色變黑即變熟”是不嚴謹的。

2.2 酒燉熟地黃炮制過程紅外光譜圖特征分析[4-6]依據“復雜混合物多級紅外光譜宏觀指紋分析法”，首先根據地黃化學成分特點找到主成分特征吸收峰或特征波段，如圖2所示，因地黃富含糖分,譜圖變化重點在1200～900 cm-1波段和900～700 cm-1兩個波段。前者主要就是糖的C-O(H)鍵彎曲振動吸收，后者主要是糖環的不同振動吸收。

圖1 酒燉熟地炮制過程樣品粉末顏色變化Fig 1 Color change of sample powder during processing of wine stewed Rehmannia

圖2 生地黃和熟地黃原始紅外光譜圖Fig 2 Original infrared spectra of Rehmannia Glutinosa and Radix Rehmanniae Preparata

熟地黃炮制過程,主要就是糖的轉化過程,所以這些特征波段紅外光譜規律性變化表征了熟地黃炮制過程中所含糖的變化規律。如圖3a所示，在1200～850 cm-1波段，主成分特征峰由1050 cm-1單強峰逐漸變為1058和1026 cm-1雙強峰。如圖3b，在900～700 cm-1波段，831、797和771 cm-1三個“山形峰”逐漸變成817、797和777 cm-1三個“階梯峰”，尤其是777cm-1特征峰變化突出。為提高光譜圖分辨率，增強特征信息，取“山形峰”的二階導數譜分析, 如圖3c，10 h時832 cm-1峰逐漸先變成834和817 cm-1峰，770 cm-1峰逐漸先變成778和769 cm-1峰，800 cm-1峰基本不變。15 h后圖譜趨于穩定為819、800和769 cm-1峰三個特征峰?？偟膹囊陨险w譜圖峰位、峰型和峰強變化來看，整個過程變化特征突出規律明顯，即以800 cm-1為中心，832和770 cm-1逐漸減弱并高波段，10 h的譜圖出現817和778 cm-1特征峰并逐漸增強，15 h后吸收強度相當的819、800和778 cm-1三特征峰突出。圖譜表明酒燉熟地5 h后才開始有明顯的化學變化；10 h時譜圖最復雜，說明此炮制階段正發生復雜的化學成分變化；15 h后譜峰特征性明顯穩定化。

2.3 酒燉熟地炮制過程中的理化分析及777 cm-1特征吸收峰光譜分析 地黃富含低聚糖類，其中以水蘇糖為主。生地經炮制加工成熟地,主要就是低聚糖轉化成單糖。若含量為主的水蘇糖在酒燉過程中完全轉化，那么將得到2分子半乳糖、1分子葡萄糖和1分子果糖。水解所得單糖可使得熟地黃“甜如飴”；水解所得的果糖能與氨基酸反應成蛋白黑素，故認為是由水蘇糖水解得到的大部分果糖與地黃所含氨基酸反應生成了蛋白黑素，一方面使得熟地黃“黑如漆”，同時使得果糖的含量減少到與分解所得的葡萄糖含量之比接近 1∶5，出現了777 cm-1的特征峰。如圖4所示，通過圖譜加減譜模擬和實驗驗證，表明如果按照葡萄糖∶果糖≈5∶1的配比進行混合，恰好可以得到777 cm-1處的特征峰。

圖3 酒燉熟地炮制過程特征波段紅外光譜(a和b)及二階導數譜(c)Fig 3 Characteristic band infrared spectrum(a and b) and second derivative spectrum(c) of processing of wine stewed Rehmannia

圖4 葡萄糖(a)、果糖(b)和葡萄糖與果糖(5∶1)疊加(c)紅外光譜Fig 4 Glucose (a),fructose (b),glucose and fructose (5∶1) (c) infrared spectra

2.4 紅外光譜結合熟地黃炮制過程中化學成分、生物形態及藥學性質等相關性分析 生地炮制成熟地過程主要就是糖轉化過程。在這個過程中，不論是地黃生物形態(色味)、藥學性質(性味功效)變化，還是紅外光譜特征變化都與主成分變化有關如，表1所示。因而可以利用紅外光譜的特征信息來表征熟地黃炮制過程化學成分、生物形態及藥學性質等的相關變化和變化特點。具體說就是：當主強峰由單強峰變為雙強峰、特征波段山形峰變成階梯峰、特征峰777 cm-1明顯及二階導數819、800和778 cm-1三譜峰突出時，才基本可以判斷熟地黃的炮制火候已到，傳統性狀“黑如漆、甜如飴”的生態學特點確切，糖轉化完全，指標成分梓醇含量逐漸減少在15 h時出現明顯拐點且其后逐漸檢測不到[7]，此時熟地臨床“味甘性溫效滋補”的藥學性質可靠。

表1 酒燉熟地炮制過程中紅外光譜與化學成分、生物形態及藥學性質等變化的相關性分析Tab 1 Correlation analysis of infrared spectrum and chemical composition, biological morphologyand pharmaceutical properties of processing of wine stewed Rehmannia

2.5 利用相關峰面積比量化酒燉熟地“炮制終點”[8]酒燉熟地炮制過程中，因發生糖轉化則主成分及其他相關吸收峰的峰面積也都發生相應的規律性變化。為了避免樣品用量、光程長度等因素導致的單一特征光譜強度差異的影響，需要選擇相關吸收峰做為參比峰，其二者確定的相關峰值比(峰面積比A1/A2或比峰高H1/H2)是可信的量化指標。如圖5所示，對各樣品紅外光譜分別基線校正及歸一化處理，即：基線校正后以O點為最低基點進行歸一化處理，其水平基線分別與樣品紅外光譜交與P、R兩點，另選主成分峰光譜特征點引豎直垂線交于水平基線于Q點，分別選定QR波段和OP波段做為主成分峰-1和參比峰-2，若設其峰面積分別為A1和A2，則A1/A2表示為“相關峰值比”。用“相關峰值比(A1/A2)”來量化表征熟地黃炮制過程中“主成分峰”的變化趨勢和變化程度，則得到如表2量化值。

表2所示，在酒燉地黃60 h內，單獨A1和A2值的大小受樣品量、光程差等因素影響，但是其二者相關峰面積比值(A1/A2)大小是由樣品性質決定，且不受樣品量、光程差等因素影響。

圖6所示，酒燉地黃60 h過程中，0～15 h內相關峰面積比值(A1/A2)持續快速減小，且約有2個單位的差值(5.49-3.65=1.85)，15 h處出現拐點，之后A1/A2值減小速率明顯降低，再之后基本穩定。

圖5 地黃紅外光譜主成分峰-1和參比峰-2歸一化處理圖譜Fig 5 Principal component peak-1 and reference peak-2 normalized processing infrared spectrogram of Rehmannia

表2 酒燉熟地炮制過程主成分峰面積(A1)、參比峰面積(A2)及二者比值(A1/A2)變化規律Tab 2 Change regulation of Principal component peak area (A1), reference peak area (A2) and the ratio of two (A1/A2) of processing of wine stewed Rehmannia

圖6 酒燉熟地炮制過程相關峰面積比(A1/A2)變化趨勢Fig 6 Changing tendency of Correlation-peak-area ratio(A1/A2)of processing of wine stewed Rehmannia

表3 酒燉熟地炮制過程紅外特征化指標綜合分析Tab 3 Comprehensive analysis of infrared characteristic index of processing of wine stewed Rehmannia

綜合上述于表3所示，在酒燉熟地炮制變化過程中，10 h左右是各項指標特征開始出現或復雜變化態，15 h時各項指標都趨于穩定特征化：(1)性狀變化：即顏色完全變黑；(2)譜圖特征：雙強峰(1057-1026)、階梯組峰(817-797-777)、777特征峰及二階導數譜峰(819-800-778)等特征化穩定；(3)量化指標： A1/A2值持續降低，在15 h時拐點明顯且趨于穩定， A1/A2≈3.5，和生地黃相比A1/A2差值降低約2個單位。

3 討 論

熟地黃加工方式和炮制程度都極大地影響著其質量品質，常因加工火候“過或不及”多有“酸敗”或“生制”現象，導致臨床用藥效果偏差或錯失。鑒于單指標成分(梓醇)無法客觀評價熟地黃的整體質量品質，利用紅外光譜技術“從整體到特征、先定性再定量”，對熟地炮制過程中其生物形態、化學成分及藥學特點等進行整體性相關分析，得到“客觀整體”的量化質量標準，進而有效監控熟地黃炮制加工程度，提高了熟地黃質量品質。相比其他分析方法，利用紅外光譜“相關峰面積比(A1/A2)”來評價酒燉熟地炮制程度具有“整體性和量化性”特點，其指標意義更客觀可靠，方法手段更方便快捷。

研究表明，酒燉熟地“炮制終點”應在15 h左右，此時上述各項紅外指標因素特征化明顯且穩定。但基于實際加工生產的條件和技術不同(如給熱方式、氣壓、溫度、大小分檔或是否切片等)，那么時間僅是變量因素，做為紅外光譜技術整體分析來說，熟地黃炮制程度必須達到：(1)光譜表征：雙強峰(1057-1026)、階梯組峰(817-797-777)、777特征峰及(819-800-778)二階導數譜等特征化明顯且穩定；(2)量化指標：A1/A2值降低拐點化，或確認A1/A2≈3.5為熟地黃炮制終點量化值。這樣才能避免熟地炮制“不及則功效難求，太過則氣味反失”，才能避免“顏色變黑即變熟”的經驗誤判。

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(編輯：陳希)

QuantitativeAnalysisontheProcessingEnd-pointofWineStewedRehmanniaByFTIR

FAN Ke-feng1, TANG Fa-yin1,ZHAO Jian-ping, SUN Su-qin2,ZHOU Qun2

(1.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450000,China; 2.TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.09

2017-03-18

A

1002-1280 (2017) 09-0049-07

S853.7

河南省青年骨干教師項目基金(2013GGJS-191)

樊克鋒，碩士，清華大學化學系訪問學者，從事現代分析技術對中藥質量品質方面研究。E-mail: fanke333@aliyun.com