焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的方法學比較

渠滕，田文君，劉義慶，劉春梅，張慶，崔朝杰，邱旸

（山東大學附屬省立醫院 臨床檢驗醫學部，山東 濟南 250021）

焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的方法學比較

渠滕，田文君，劉義慶，劉春梅，張慶，崔朝杰，邱旸

（山東大學附屬省立醫院 臨床檢驗醫學部，山東 濟南 250021）

目的探討焦磷酸測序法檢測丙肝分型在臨床應用中的準確性和敏感性，評價其方法的優缺點。方法收集100例丙肝患者的血漿標本，分裝相同的2份，通過焦磷酸測序法和Sanger測序法分別進行丙型肝炎病毒基因分型的檢測，對兩種測序方法的結果進行比較。結果焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測HCVRNA基因分型時，100例標本中，92例結果一致，8例結果不一致，一致率為92%。其中，HCV-RNA病毒載量＞1×104IU/ml有80例，其測序結果完全一致為100%，HCV-RNA病毒載量＜1×104IU/ml有20例，其中焦磷酸測序共檢測20例，Sanger測序法共檢測14例，12例結果相同。結論焦磷酸測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型，不僅結果準確可靠，而且與Sanger測序法比較，其敏感性更高。此外，焦磷酸測序還可以進行定量分析。

丙型肝炎；焦磷酸測序；Sanger測序

Abstract:ObjectiveTo compare the accuracy and sensitivity of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes.MethodsPyrosequencing and Sanger sequencing were used to detect the hepatitis C virus genotypes using plasma of the same 100 patients,results of the two methods were analyzed.ResultsThe results were consistent in 92 of 100 cases when detecting the HCV-RNA genotyping,of which the concordance rate was 92%.There were 80 samples whose HCV-RNA concentration was above 1×104IU/ml,with completely consistent sequencing results of the two methods.And there were 20 samples whose HCV-RNA concentration wasbelow 1×104IU/ml,allofwhich were detected successfully by Pyrosequencing,while 14 of which were detected successfully by Sanger sequencing,12 of which had identical results.ConclusionsCompared with Sanger sequencing,Pyrosequencing can make results accurate and reliable,and the sensitivity of which is higher.In addition,Pyrosequencing can be used for quantitative analysis.

Keywords:hepatitis C;Pyrosequencing;Sanger sequencing

丙型肝炎（丙肝）是一種由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起、以肝臟受累為主，腎臟、骨髓和甲狀腺等其他器官均可受累的全身性疾病[1]。人體感染HCV后，因急性丙肝常呈亞臨床感染，癥狀輕微，常常不能引起患者的重視而導致50%～80%的丙肝患者發展成為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），而CHC自發清除病毒的比例很低，如果不能進行及時有效的抗病毒治療，絕大多數將逐漸發展為肝硬化、肝功能失代償，甚至肝細胞癌，嚴重危害患者的健康和生命[2-3]。據世界衛生組織報告，全球丙型肝炎流行率平均為3%，每年新發HCV感染300～400萬例，估計已有1.3～1.7億慢性HCV感染者。每年約35萬人死于與HCV感染相關的肝臟疾病。據估計，今后10～15年內，丙型肝炎相關死亡將繼續上升，到2015年丙型肝炎相關死亡將增加2倍，2025年增至3倍[4-6]。在我國，根據2006年全國血清流行病學調查推算，我國一般人群HCV感染者約為560萬[7]。目前，PR方案（聚乙二醇化干擾素α聯合利巴韋林）仍是我國現階段HCV感染者抗病毒治療的主要方案，可應用于所有基因型HCV現癥感染，同時無治療禁忌證的患者。在PR治療基因1型、2/3型患者中，不同基因型患者RBV的用量不同，據應答指導治療（responsed guidedtherapy，RGT）的調整策略也不一樣，同時丙型肝炎防治指南（2015更新版）推薦意見中第6條建議抗病毒治療前應根據病毒載量、基因分型、肝纖維化分期以及有無抗病毒治療禁忌證等綜合評估[8]。

目前，HCV基因分型檢測方法主要有直接測序、限制性片段長度多態性分析法（RFLP）、特異性引物聚合酶鏈反應（PCR）法、特異性探針熒光PCR法和基因芯片法等[9]。Sanger測序法采用的就是直接測序法，是一代測序法的經典代表，發展較為成熟，測序片斷較長，成本相比較低，但是只能測序，無法準確定量，同時操作耗時、煩瑣、通量受局限，在臨床應用不方便。焦磷酸測序技術是介于一代測序和二代測序之間的一種測序手段，不僅檢測項目靈活可以同一批次檢測多個項目，而且焦磷酸測序檢測成本較低、耗時短、通量高和靈敏度高，適合臨床常規檢測的推廣，但其測序的片斷一般較短＜80 bp（大多數需要檢測的與疾病相關的已知基因片斷都很短），更適合對特定已知序列的定量分析[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月-2016年10月在本院檢測HCV-RNA陽性的血漿標本100例，采用COBAS Taq Man 48全自動病毒載量儀儀器及相關試劑盒（購于瑞士羅氏公司）檢測，檢測下限為15 IU/ml，其中，HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml有80例，HCV-RNA濃度＜104IU/ml有20例。

1.2 主要試劑和儀器

病毒核酸純化柱試劑盒（德國Qiagen公司），焦磷酸測序試劑盒（德國Qiagen公司），低溫高速臺式離心機（德國Eppendorf公司），熒光定量PCR儀（美國ABI公司），焦磷酸測序儀（Pyro Mark Q24 MDx，德國Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸測序①設置Pyro Mark Q24運行文件：點擊新建程序按鈕，輸入運行的參數，設置測序板面板，從“Tools”菜單中選擇“Pre Run Information”，打印測序信息表，關閉運行菜單，拷貝到一個USB盤中。將PCR產物結合到鏈霉親和素Beads上：按照2 μl磁珠加40 μl結合緩沖液再加28 μl高純水配置用于DNA親和反應的Master mix，加入70 μl的Master mix到8聯管中，按照設定的Pyro Mark Q24程序加入10 μl PCR產物到每一個孔中，用PCR8聯蓋密封8聯管，1 400 r/min搖動10 min；②測序引物退火緩沖液的配制：按照每孔2.5 μl測序引物加22.5 μl的退火緩沖液進行足量配制，按照設定的Pyro Mark Q24程序加25 μl稀釋的測序引物到PyroMark Q24測序板的孔上；③單鏈DNA模板的制備：在真空工作站中，1號槽加入70%乙醇50ml，2號槽加入變性緩沖液40 ml，3號槽加入洗液50 ml，4號槽加入高純水50 ml，5號槽加入高純水70 ml。打開真空泵，將真空工具在5號位清洗15 s，移動到PCR8聯管吸附磁珠15 s，依次在1、2和3號位清洗5、5及10 s；④引物雜交：將真空工具真空閥關閉，放入含有測序引物的Pyro Mark Q24測序板中，充分搖動釋放磁珠，在80℃雜交2 min，室溫冷卻10 min；⑤運行Pyro Mark Q24進行測序：按照Pre Run運行報告將核酸，酶、底物分別按照合適的體積加入卡夾，打開測序板模塊，放入卡夾和測序板，插入USB選擇主菜單中的“Run”，按“OK”。

1.3.2 Sanger測序由上海申友生物技術有限責任公司使用ABI 3730xl測序儀測序。

1.4 統計學方法

數據分析采用13.0統計軟件，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種測序法的敏感性

血 HCV-RNA 為 104、5000、2000 及 1000IU/ml，重復10次，血HCV-RNA≥2 000 IU/ml的標本，焦磷酸測序法和Sanger測序法能穩定地檢測出丙型肝炎病毒的基因分型，陽性檢出率均為100%，且兩種方法的序列圖譜清晰，滿足臨床對丙型肝炎病毒基因分型檢測的需求；血HCV-RNA≤2 000 IU/ml的標本，焦磷酸測序法無法穩定檢出，雖可分出丙型肝炎病毒基因分型，但信號強度低、分辨率差，Sanger測序法陽性檢出率為0；另外，兩種方法檢測10份健康對照者血漿標本，兩種方法均低于檢出限。

2.2 2種測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的結果比較

將100例丙肝患者血漿標本分裝相同的兩份，通過焦磷酸測序法和Sanger測序法分別進行丙型肝炎病毒基因分型的檢測，100例丙肝患者血漿標本檢測結果顯示：焦磷酸測序法共測出100例，未測出0例，檢出率為100%；Sanger測序法測出94例，6例未測出，檢出率為94%。其中，92例結果一致，8例結果不一致，總體一致率為92%。焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因1b、2a以及其他型別的檢出例數的比較，經χ2檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。標本測序結果資料。見表1。

表1 2種測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型結果比較例（%）

2.3 2種測序法對不同丙肝病毒載量組的檢測結果比較

按病毒載量的不同將100例患者分為高載量組（HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml）80例和低載量組（HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml）20例。2種方法在兩組的丙肝分型檢測結果比較（見表2）。高通量組的HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml，有80例，其測序結果完全一致為100%，低通量組的HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml，有20例，其中焦磷酸測序供測出20例，Sanger測序法測出14例，12例結果相同，2例不同。檢測高載量丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法的檢出率無差異，而檢測低載量丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法檢出例數的比較，經χ2檢驗差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 2種方法對不同病毒載量組的檢測結果比較

HCV-RNA高水平載量、低水平載量和正常人2種測序方法的測序圖（見附圖）。應用Sanger測序法對丙型肝炎病毒分型檢測，對于高病毒載量樣本測序結果直觀，但存在結果分析較為復雜，不能對突變株進行定量檢測的問題；對于低載量樣本，結果判讀存在很大偏差，重復實驗結果重現性很差，不能很好的判斷型別；陰性標本測序結果呈現混亂的峰形圖，無實際意義。而對于丙型肝炎病毒高載量樣本，焦磷酸法分型測序結果直觀、峰值高、讀取簡單和定量精確等特點；對于低載量樣本測序結果存在基線不穩、峰值偏低的情況，但重復實驗結果具備很好的重現性，不影響結果的判讀；陰性標本無PCR擴增曲線，對PCR產物測序亦無峰值出現。

分別比較各組中2種檢測方法的整體一致性較好。但高載量組與低載量組之間兩種方法檢測結果比較，高載量組的檢測結果，兩種方法一致率更好，低載量組焦磷酸測序法具有更高的檢測率和更低的漏檢率，其敏感性可能略優于Sanger測序法。

2.4 2種測序法對不同低病毒載量組的檢測結果比較

通過表2對比結果可知，兩種測序方法在對丙型肝炎病毒基因分型的檢測一致性較高，但在HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml中，測序結果有所差異，現將20例HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml的標本按病毒載量分成2組，分別用焦磷酸法和Sanger法進行測序，其檢測結果比較。見表3。

標本病毒載量在104～5 000 IU/ml范圍中，檢測12個樣本，焦磷酸測序法和Sanger測序法均可檢出，且測序結果一致性為92%；當病毒載量＜5 000 IU/ml時，檢測8個樣本，焦磷酸法檢出8個，檢出率為100%，Sanger測序法檢出2個，檢出率為25%，其中，兩種方法檢測一致的標本數為1，一致率為12.5%。檢測病毒載量為104～5 000 IU/ml組丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法的檢出例數無差異，而檢測病毒載量＜5 000 IU/ml組的丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法檢出例數經χ2檢驗差異有統計學意義（P＜0.05）。

附圖 2種測序法在不同丙肝病毒載量組的測序圖

表3 2種測序法在不同低病毒載量組的檢測結果比較 %

通過2種測序方法對比可以看出在高載量檢測中，2種方法一致性更好，低載量檢測中焦磷酸測序法可能有較高的檢測率，其敏感性可能略優于Sanger測序法。故建議進行丙肝分型檢測前應先進行HCV-RNA定量檢測，分型標本病毒載量在＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可優先考慮焦磷酸測序法。

3 討論

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒感染引起、以血源性傳播為主的傳染性疾病，大部分患者感染HCV后會發展成為慢性丙型肝炎，可導致肝臟慢性炎癥反應、壞死和纖維化，更有部分患者發展為肝硬化，甚至是肝癌，對人類的健康構成嚴重威脅。而且近年來我國丙肝報告病例數及報告發病率快速上升，2011年報告發病率就達到12.97/10萬[11]，但通過科學的抗病毒治療，可以達到清除病毒、改善肝組織學、降低肝硬化發生率、防止肝臟功能衰竭和肝癌發生的目標[12]。HCV分為6個基因型和多個亞型，不同基因型會導致不同的臨床表現及后果，尤其是對干擾素治療的反應性有很大差異，因此，在治療前了解HCV的基因型，不僅有助于預測患者病情，更重要的是可根據病毒的基因型采用更合理有效的治療方案，從而既能節約治療費用又能獲得好的效果[13-15]。

本實驗發現，兩種測序方法在對丙型肝炎病毒基因分型檢測的一致性高，無差異。100例標本中，有92例結果一致，一致率為92%。其中，HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml有80例，其測序結果完全一致為100%，HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml有20例，其中焦磷酸測序共檢測20例，Sanger測序法共檢測14例，12例結果相同。初步證明，在檢測丙型肝炎病毒基因分型方面，焦磷酸測序法快速準確，而且與目前應用較為成熟普遍的Sanger測序法比較，其敏感性更高。此外，焦磷酸測序還可進行甲基化分析（特定位點定量），且通量靈活（1～24）。因此，建議進行丙肝分型檢測前應先進行HCV-RNA定量檢測，分型標本病毒載量＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可考慮焦磷酸測序法。

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Comparsion of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes

Teng Qu,Wen-jun Tian,Yi-qing Liu,Chun-mei Liu,Qing Zhang,Chao-jie Cui,Yang Qiu
(Department of Clinical Laboratory Medicine,Shandong Provincial Hospital of Shandong University,Jinan,Shandong 250021,China)

R135.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.012

1005-8982（2017）21-0066-05

2017-02-20

邱旸，E-mail：qpinger@163.com，Tel：15863199632