雞白痢沙門菌套式PCR檢測方法的建立及初步應用

劉志科，李村院，張秋雨，劉 洋，馬亞茹，王月麗，陳創夫*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；3.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉 453003)

雞白痢沙門菌套式PCR檢測方法的建立及初步應用

劉志科1△，李村院2△，張秋雨3，劉 洋1，馬亞茹1，王月麗1，陳創夫1*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；3.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉 453003)

為了建立一種快速、高效和簡便的雞白痢沙門菌套式PCR檢測方法，根據沙門菌侵襲蛋白基因invA的高度保守區域，利用Primmer 5.0軟件設計2對特異性的套式引物，以提取的沙門菌DNA為模板克隆invA基因，將其連入T載體并計算拷貝數作為套式PCR的模板，在對反應條件進行優化的基礎上，建立最佳的套式PCR反應條件，確定其上、下游引物用量分別為0.3 μL，套式PCR的第1次退火溫度為57.4℃，第2次為53.5℃。應用該方法對已構建好的不同濃度的標準陽性質粒作為模板進行檢測，其靈敏度為102拷貝數/20 μL，遠高于常規PCR的106拷貝數/20 μL。用建立的套式PCR方法對從新疆石河子某雞場采集的25樣品進行檢測，與傳統的診斷方法比較符合率達95.00%。建立的雞白痢沙門菌套式PCR檢測方法具有快速、可行、特異性強、準確率高等特點，為雞沙門菌病的早期診斷和研究提供了技術支撐。

雞白痢沙門菌；套式PCR；常規PCR；invA基因；靈敏性

沙門菌是一種寄生在人和多種動物腸道內的革蘭陰性菌，是一種重要的人畜共患病病原。雞白痢沙門菌病是一種急性敗血性疾病，多危害20日齡以內的雛雞，患病雞表現為白痢、高病死率；成年雞主要是生殖器官感染，多數呈隱性局部炎癥，并通過卵黃內帶菌傳播給雛雞[1]。沙門菌不但能引起多種畜禽疾病，還會污染食物及引起人食物中毒，嚴重危害人類健康，世界衛生組織(WHO)將沙門菌列入了具有嚴重危害和中等危害的食物傳播性病原。

當前雞白痢沙門菌病的診斷主要根據沙門菌屬的培養特性、生化試驗和血清學試驗，這些傳統方法步驟比較繁瑣、費時費力，已不能滿足當前快速診斷的需求。由于沙門菌屬的血清型比較多，有2 500種以上，所以建立一種快速、高效、準確的檢測方法，對于沙門菌病的診斷具有重要意義。國內外已經建立了斑點免疫金滲濾法、免疫熒光標記法、恒溫核酸擴增技術及熒光定量PCR方法，但由于試驗所需條件比較高，儀器昂貴，并不適合在基層推廣和應用[2]。根據雞白痢沙門菌的傳播特點，利用已經建立的PCR技術可以檢測出極微量的病原菌，這種方法在雛雞沙門菌病檢疫方面的應用越來越廣泛，但其敏感性和特異性沒有一個通用和嚴謹的判定標準，存在一些不足之處。而套式PCR是在原有的PCR技術上又增加了一條引物，其靈敏性比常規PCR要高很多[3]。但目前這個技術在檢測沙門菌方面并不是太完善，報道也比較少。本研究對雞白痢沙門菌套式PCR檢測方法的體系和條件進行優化和改善，進一步驗證其敏感性、特異性和重復性，并初步應用建立的檢測方法對臨床樣品進行檢測，為沙門菌快速檢測提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀生物公司產品；DH5α感受態細胞、2×ESTaqMasterMix、T-vector PMD19、細菌基因組DNA提取試劑盒、高純度質粒小提試劑盒、IGTP/X-gal，Tiangen公司產品；LTD、沙門菌成套生化鑒定管，青島博海生物技術有限公司產品；PCR儀，Eppendorf公司產品；紫外凝膠成像分析系統，Molecular Imager公司產品；高速離心機，德國Sigma公司產品；核酸蛋白檢測儀，美國Thermo Scientific公司產品。

1.1.2 菌株及臨床病料 雞白痢沙門菌(CVCC530)購于中國獸醫藥品檢查所；其他對照菌(多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、李斯特菌和放線桿菌)均由石河子大學微生物教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 invA基因編碼沙門菌的一種侵襲蛋白，決定細菌進入動物上皮細胞的能力，與致病性密切相關。根據GenBank公布的雞白痢沙門菌invA基因(登錄號：NC003197.1)保守區核苷酸序列，利用Preimer5.0，設計3對引物，并用DNA Man進行基因同源性分析?？寺∫飅nvAK，套式PCR內外引物分別為invAW和invAN，具體引物序列見表1。引物由上海Sangon Biotech公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 重組質粒制備

1.2.2.1 目的基因擴增與重組質粒的構建 用DNA提取試劑盒提取雞白痢沙門菌的DNA作為模板，用克隆引物 (invAK) 進行常規PCR擴增invAK基因的片段。反應結束后，PCR產物以170 V、120 mA在10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳來驗證分析。用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶。與pMD19-T載體過夜連接，重組質粒轉化到大腸埃希菌DH5α感受態細胞中，通過IPTG/X-gal篩選陽性克隆菌，PCR驗證正確后，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.2.2 質粒的提取、鑒定及定量 按照高純度質粒小提試劑盒的說明書進行質粒的提取，用核酸蛋白檢測儀測定其質粒濃度，提取質粒OD 260/OD 280的比值在1.8～2.0范圍時，說明提取質粒純度高、雜質較少[4]，根據公式計算出重組質粒的拷貝數。

拷貝數﹦質粒濃度(ng/μL)×10-9/重組質粒分子質量×6.022×1023

1.2.3 最佳引物用量的確立 分別將invAW和invAN的上、下游引物稀釋至20 μmol/L,分別取 0.2、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，以106拷貝/μL的重組質粒標準品為模板，采用常規PCR方法進行擴增，篩選出引物的最優反應濃度。

1.2.4 PCR反應體系 以106拷貝/μL雞白痢沙門菌標準株重組質粒的為模板，第1輪PCR反應體系20 μL，包括ddH2O 8.2 μL，上、下游引物 invAWF、invAWR 0.3 μL，模板1.5 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL；第2輪PCR反應體系20 μL：ddH2O 8.7 μL，上、下游引物 invANF、invANR 0.3 μL，模板1 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL ,第2輪PCR反應模板為第1輪PCR反應的膠回收產物。

1.2.4.1 退火溫度的優化 第1輪PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，57.4℃～59℃ 30 s，30個循環；72℃ 50 s。第2輪PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53.5℃ 30 s，35個循環；72℃ 30 s。經30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。將長度為278 bp的目的DNA片段切下后，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收。最后，取8 μL的PCR產物進行凝膠電泳和測序驗證。

1.2.4.2 靈敏性和特異性分析 將質粒按10倍梯度稀釋成不同的拷貝數，建立標準曲線，分別以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷貝/μL為模板，進行套式PCR擴增，確定方法的靈敏度。利用本試驗優化的套式PCR反應程序，對已知陽性菌和5株非目標菌進行檢測，驗證所建立的套式PCR方法檢測雞白痢沙門菌的特異性。

1.2.4.3 重復性試驗 選擇濃度為10、105、107拷貝/μL的invA基因陽性質粒進行套式PCR擴增，分別進行批內和批間重復性試驗，對每個拷貝數模板進行3個平行重復；同時，對批間中的105的稀釋拷貝數的陽性質粒作為批內檢測，共復檢3次，根據瓊脂糖凝膠電泳結果確定方法的重復性。

1.2.4.4 臨床樣品檢測 在新疆石河子某雞場采樣，利用沙門菌成套生化鑒定管對采集的25份樣品進行鑒定，共檢出20份陽性樣品和5陰性樣品，用DNA提取試劑盒提取樣本的DNA。以陽性質粒為對照組，用本研究建立的雞沙門菌套式PCR方法進行檢測，來比較常規PCR擴增方法與套式PCR方法準確性。

2 結果

2.1 目的基因PCR擴增及測序結果

以雞白痢沙門菌的DNA為模板，利用克隆引物invAK進行PCR擴增目的條帶，經瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小為1 143 bp(圖1)。送到公司測序并對結果進行比對，擴增的目的片段序列與原始序列的同源性一致。

M.DNA 標準 DL 5 000；1.PCR產物

M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR product

圖1 invA基因PCR結果電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of invA gene PCR result

2.2 重組質粒標準品的鑒定

對獲得的陽性質粒進行PCR驗證，擴增出625 bp條帶，與雞白痢沙門菌為模板進行PCR反應所得到的片段大小相同。測序結果顯示,連接片段的序列和目的基因序列同源性為100%，表明成功構建了重組質粒。提取重組質粒，并將質粒濃度稀釋至1010拷貝/μL,再依次進行10倍梯度稀釋為1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷貝/μL，作為套式PCR的標準品，置-20℃保存備用。

2.3 套式PCR檢測方法的建立

2.3.1 最佳引物用量的確立 分別取不同體積濃度20 μmol/L的引物，進行PCR擴增。結果發現，當上下游引物的體積各為0.3 μL時，對重組質粒的檢測可以獲得最優的條帶(圖2)。

2.3.2 退火溫度的優化 對套式PCR的第1輪退火溫度設計梯度，結果表明最適退火溫度為57.4℃(圖3)。

2.3.3 靈敏性和重復性試驗 分別以100～1010拷貝/μL的標準品為模板，用設計的外引物(invAWF和invAWR)進行套式PCR的第1次擴增，在106拷貝/μL時能檢測出條帶，常規PCR方法在20 μL體系中最低檢出的下限為106拷貝/μL(圖4)。用上述的PCR反應產物作為第2輪PCR擴增的模板，用設計的內引物(invANF和invANR)進行第2輪擴增，結果顯示，套式PCR在模板濃度為102拷貝/μL就可用擴增到目的條帶，比常規PCR靈敏性提高10 000倍(圖5)。106拷貝/μL質粒為模板進行3次重復性試驗(圖6)。結果顯示，雞白痢沙門菌invA基因建立的套式PCR的靈敏度較高、重復性好。

M.DNA 標準 DL 2 000；1～6.引物體積用量為0.2 μL、0.1 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.primer volumes as 0.2 μL,0.1 μL,0.3 μL,0.4 μL,0.5 μL and 0.6 μL

圖2常規PCR最佳引物體積分析

Fig.2 Optimal primer volume analysis of conventional PCR

M.DNA 標準 DL 2 000 ;1～7.退火溫度分別是57.4℃、57.7℃、58℃、58.3℃、58.6℃、58.9℃、59.2℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-7. The annealing temperatures as 57.4℃，57.7℃，58℃，58.3℃，58.6℃，58.9℃ and 59.2℃,respectively

圖3套式PCR第1輪最佳退火溫度確定

Fig.3 Determination of optimal annealing temperature for first round nested PCR

M.DNA 標準 DL 2 000；.1.陰性對照;2～11.分別為模板量為10、102、103、104、105、 106、107、108、109、 1010拷貝/μL的PCR產物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-11.PCR products of template amounts as10,102,103,104,105,106,107,108,109,1010copies/μL, respectively

圖4第1輪套式PCR擴增靈敏性分析

Fig.4 Sensitivity analysis of first round nested PCR amplification

M.DNA 標準 DL 500；1、2.原質粒濃度；3～12.1010、109、108、107、106、 105、104、103、102、10拷貝/μL

M.DNA Marker DL 500；1，2.The original plasmid concentration；3-12.PCR products of template amounts respectively 1010,109,108,107,106,105,104,103,102,10 copies/μL

圖5第2輪套式PCR擴增靈敏性分析

Fig.5 Sensitivity analysis of second round nested PCR amplification

M.DNA 標準 DL 2 000；1.陰性對照 ；2～4.模板濃度為106拷貝/μL的質粒

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control;2-4.Template concentration 106copies / μL

圖6雞白痢沙門菌PCR產物重復性分析

Fig.6 Repeatability analysis of PCR products ofSalmonellapullorum

2.3.4 套式PCR方法的特異性分析 以雞白痢沙門菌為對照，用建立的套式PCR方法對6個非沙門菌病原進行擴增，以雞白痢沙門菌為模板分別擴增出625 bp(圖7A)和278 bp(圖7B)的特異性條帶，而其他樣品均無條帶，表明建立的套式PCR方法特異性好。

2.3.5 臨床樣品的檢測結果 對采集已經確認的雞白痢沙門菌的陽性樣品和陰性樣品,分別按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA為模板，用常規的PCR方法檢測到陽性樣品10份，陰性樣品3份，檢出率50.00%；用建立的套式PCR方法檢測到陽性樣品19份，陰性樣品5份，檢出率95.00%(圖8)，這可能是樣品中沙門菌含量比較低的原因所造成的?？傊?，套式PCR的檢測率比常規PCR要高很多。

3 討論

沙門菌是全世界危害最嚴重的食源性病原菌之一，雞感染后病死率達83%以上[5]，給畜牧業造成巨大的經濟損失。國內外學者一直致力于沙門菌快速檢測方法的研究，主要在PCR技術、基因芯片技術、免疫學檢測及斑點免疫金滲濾法等方面[6]。沙門菌的血清學種類比較復雜，疫苗種類比較多，養殖戶常常是防了又防，但效果甚微，即使發現了該病，也沒有一個好的預防藥物和方法。沙門菌感染人后可以黏附到小腸黏膜的M細胞，通過M細胞侵入到表皮下層組織，而濾泡上皮細胞中有分布著捕捉抗原的M細胞，具有吞噬功能；而沙門菌含有O、Vi和H等抗原，具有血清抗性，可導致沙門菌釋放較強的內毒素，從而使機體產生一些嚴重不適反應[7-8]。

邵景東等[9]利用免疫膠體金層析法研發出O9群沙門菌膠體金快速檢測試劑盒，該方法具有色譜層析法和免疫反應法的共同優勢。由于腸炎沙門菌含有一種SEF菌毛，在侵襲過程中具有毒力因子的作用，可以誘導細菌黏附在動物的生殖道和腸道的黏膜細胞上，造成不同的病理反應。蔣穎等[10]利用SEF菌毛建立了腸炎沙門菌特異性的診斷方法，但由于該方法對抗原和試驗條件要求比較高，并沒有廣泛應用到臨床檢測當中。劉景武等[11]建立的免疫膠體金法檢測沙門菌的靈敏度為81.8%，但由于其敏感度問題極容易造成假陰性結果，在實際臨床中只能作為一種輔助手段。劉斌等[12]在原有PCR方法的基礎上，為了降低檢測時出現的假陰性概率，在PCR反應體系中人工加入了1條擴增內標片段，該檢測方法的靈敏度可到8 CFU/25 mL,增加了診斷的準確性。Amaro M等[13]基于納米金材料設計了一種鼠傷寒沙門菌免疫分析法，其檢測的下限為42 CFU/mL。李佳桐等[14]根據沙門菌的STN基因的保守序列設計了1套LAMP引物，建立了一種環介導等溫擴增鑒定方法，克服了傳統方法的局限性，其最低檢出細菌濃度為10 CFU/mL,50 min就可以完成檢測，但該方法對引物的要求比較高。而本研究根據沙門菌的特異性invA基因，用BLAST檢索進行核苷酸序列分析表明，在沙門菌的兩個種屬中存在較高的同源性，而與其他生物無同源關系；并利用Preimer5.0軟件設計兩對引物，而內引物位于第1輪PCR擴增產物的內部。

A.第1輪套式PCR特異性分析；M.DNA 標準DL 2 000;B.第2輪套式PCR特異性分析;M.DNA 標準 DL 1 000；1.雞白痢沙門菌;2～7.多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、李斯特菌、放線桿菌

A.First-round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 2 000；B.Second round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 1 000； 1.Salmonellapullorum；2-7.Pasteurellamultocida,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,ListeriaandActinobacillus

圖7套式PCR特異性分析

Fig.7 Nested PCR specificity analysis

M.DNA 標準 DL 1 000；1～5.陰性樣品；6～24.陽性樣品 M.DNA Marker DL 1 000；1-5.Negative samples；6-24.Positive samples

綜上所述，本研究建立了一種沙門菌的套式PCR檢測方法，不需要特殊的儀器和設備，并對反應的引物用量和退火溫度進行了優化，試驗要求和技術條件一般實驗室都能滿足，其優勢是常規檢測方法不能比擬的。但套式PCR也有其不足之處，就是容易造成模板污染和假陽性結果，有待對其進行更深入的研究。對收集的25份臨床樣品進行檢測并與常規PCR方法檢測結果進行比較，其靈敏性較高(95.00%)，尤其是對于沙門菌含量極低的樣品的檢測。同時，對于沙門菌的臨床商品化快速檢測試劑盒的研究與開發提供了技術參考。

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Abstract:In order to establish a rapid,efficient and simple nested PCR method for detectingSalmonellapullorum,two pairs of specific nested primers were designed according to the highly conserved region of the invA gene ofSalmonellainvasion protein by Primers 5.0 software.The invA gene was cloned from the extractedSalmonellaDNA,and the copy number was calculated as a nested template by ligating the invA gene into the T vector.The optimum nested PCR conditions were determined.The amount of primer used was 0.3 μL respectively,the first annealing of nested PCR was 57.4 ℃ and the second was 53.5 ℃.The method was used to detect the standard plasmids of different concentrations as templates，the sensitivity was 102copies / 20 μL,it was much higher than that of the conventional PCR which was about 106copies / 20 μL.The nested PCR method was used to detect 25 samples collected from a farm in Shihezi,Xinjiang,and the coincidence rate was 95.00% compared with the traditional diagnostic method.The results of the present study showed that the nested PCR method was successful,rapid,feasible,specific and accurate,and it provided a new method for the early diagnosis and study ofSalmonellaspp.

Keywords:Salmonellapullorum; nested PCR; conventional PCR; invA gene; sensitivity

EstablishmentandPreliminaryApplicationofNestedPCRforDetectingSalmonellapullorum

LIU Zhi-ke1,LI Cun-yuan2,ZHANG Qiu-yu3,LIU Yang1,MA Ya-ru1, WANG Yue-li1,CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832003,China; 2.CollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang，832003,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang,Henan,453003,China)

S852.612

A

1007-5038(2017)08-0023-06

2016-11-23

省級協同創新中心項目(2013-179)

劉志科(1989-)，男，河南新鄉人，碩士研究生，主要從事人畜共患病研究?！魍蓉暙I作者*