華東地區沙門菌流行病學及耐藥性分析

吳曉君，王少輝，楊登輝，王 棟，田明星，丁 鏟，高 崧，于圣青

（1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241）

沙門菌（Salmonella）屬腸桿菌科，是一種很常見的革蘭陰性桿菌，宿主十分廣泛。沙門菌感染人和動物后引發沙門菌病，臨床癥狀主要是敗血癥和胃腸炎等中毒癥狀。據統計，世界各地由沙門菌引起的食物中毒位居榜首[1-2]。近年來，美國[3]、澳大利亞[4]、瑞士[5]等國家爆發了不同規模的沙門菌感染。沙門菌還可引起多種畜禽疾病[6-7]，如雞白痢、雞傷寒、雞副傷寒、豬副傷寒等，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。因此，有效地鑒定和控制沙門菌的傳播已成為重中之重。本研究對華東地區養殖場中沙門菌的流行情況及其耐藥性進行了分析，為預防和控制沙門菌的流行及傳播提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑、材料和儀器 2×PCRmix、DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司；藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀購自ABI公司；核酸電泳儀及全自動凝膠成像處理系統購自上海天能科技有限公司；4℃臺式離心機及小型高速離心機購自Eppendorf公司。

1.2 病料來源 2015年4月～2017年6月于上海市、江蘇省、安徽省、浙江省等地4家豬場、2家雞場采集糞便樣品和肛拭子樣品共285份。

1.3 引物設計 根據GenBank中公布的沙門菌基因組，設計沙門菌鑒定引物、血清學鑒定引物及毒力基因檢測引物（表1）。引物均由英濰捷基（上海）貿易有限公司進行合成。

1.4 細菌的分離培養 將樣品和肛拭子樣品混于500 μL緩沖蛋白胨水培養基（BPW培養基）中，37℃培養增菌8～12 h；劃線接種于沙門菌SS培養基上，37℃培養16～20 h；挑取疑似單菌落在平板上劃線純化，并挑取疑似單菌落接種于LB培養基中，37℃培養6～8 h，進行下一步鑒定。

1.5 沙門菌粗提DNA制備 取1 mL增菌液至無菌EP管中，18 000×g離心5 min，棄上清，加入100 μL滅菌去離子水，重懸沉淀，于沸水中加熱10 min，18 000×g離心5 min，收集上清液，作為PCR反應模板。

1.6 沙門菌PCR鑒定 通過PCR擴增沙門菌invA基因鑒定沙門菌，PCR反應體系：2×PCR Master Mix 10 μL、引物invA-F/R（表1）各1 μL、模板（上1.5中所提DNA）1 μL，最后加滅菌超純水至20 μL。同時設立陽、陰性對照。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃延伸40 s，35個循環；72℃再延伸10 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下拍照，記錄結果。

1.7 血清學鑒定 根據沙門菌血清型特異性基因設計沙門菌血清學鑒定引物speC-F/R、glgC-F/R、sdfI-F/R、spy-F/R（表1）[8]，建立PCR檢測方法，對沙門菌臨床分離株進行血清學鑒定。

1.8 毒力基因檢測 根據本實驗室建立的沙門菌毒力基因檢測多重PCR方法[9]，對48株沙門菌分離株的毒力因子進行多重PCR鑒定。

1.9 LD50測定 選取臨床分離株1～7接種于LB培養基至對數生長前中期（OD600≈1.0），滅菌PBS洗滌菌體2次后稀釋至含菌量為104～107/0.2 mL。選取140只6周齡ICR清潔級小鼠，隨機分成28組，每組5只。臨床分離株1接種1～4組，各組接種量依次為104、105、106、107CFU/只，臨床分離株2～7以此類推。接種后連續觀察記錄14 d各組發病死亡情況，按改良寇氏法計算各菌株的LD50。

1.10 耐藥性檢測 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。將所保存的沙門菌分離株分別在LB培養基中培養18～24 h，致密劃線于瓊脂平板表面，用無菌鑷子將藥敏片貼于培養基表面，37℃培養24 h后測抑菌圈直徑，根據美國臨床檢驗標準委員（CLSI）標準判定沙門菌臨床分離株對藥敏紙片的敏感性。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結果

2.1 沙門菌的分離鑒定 沙門菌在SS培養基上形成呈中間黑色、周圍透明暈環的菌落，其他細菌大多呈無色菌落。從分離菌株中挑取可疑菌落，通過PCR（invA基因，244 bp）鑒定沙門菌48株，分離率為16.84%。其中豬場分離37株，分離率為12.98%；雞場分離11株，分離率為3.85%。

2.2 血清學鑒定 對PCR鑒定呈陽性的菌株進行血清學鑒定，結果顯示31株沙門菌屬于鼠傷寒沙門菌，占64.58%，為主要血清型；腸炎沙門菌占6.25%（圖2），未發現雞傷寒和雞白痢沙門菌，其他血清型占29.17%。

圖1 沙門菌的PCR鑒定結果Fig. 1 Identifi cation of Salmonella by PCR amplifi cation

圖2 沙門菌血清型鑒定結果Fig. 2 Identifi cation of Salmonella serotype by PCR

2.3 毒力基因檢測 多重PCR和單基因PCR對48株沙門菌毒力基因的檢測結果一致。檢測結果顯示，sopE基因分布率最低，僅有25%；其余15個毒力基因分布廣泛，分別是：hilA（100%）、spiA（100%）、invA（100%）、ssrA（97.92%）、ssaR（100%）、spiC（100%）、sifA（100%）、mgtB（100%）、misL（100%）、shdA（100%）、siiD（97.92%）、pipA（100%）、pipB（100%）、sopB（100%）、pagN（100%）（表2）。

2.4 LD50測定 結果顯示，臨床分離株1-7的LD50分別為：1.26×104、1.26×104、5.01×104、5.01×104、5.01×104、1.26×105、2.00×105CFU（表3）。

表2 沙門菌毒力基因分布Table 2 Distribution of virulence genes in Salmonella

表3 沙門菌LD50測定Table 3 Salmonella LD50 determination

2.4 沙門菌耐藥性檢測 48株沙門菌對克林霉素、利福平、紅霉素、四環素、新霉素、復方新諾明、大觀霉素、阿奇霉素、氨 青霉素、氯霉素、頭孢拉定、頭孢噻吩、丙氟哌酸、菌必治的耐藥性分別為100%、100%、97.92%、79.17%、62.5%、58.33%、56.25%、54.16%、47.92%、35.42%、25%、22.92%、22.92%、8.33%。

3討論

沙門菌病是危害十分嚴重的人畜共患病，對人和動物都有不同程度的致病力。2010年以來，全球每年約有100萬沙門菌感染病例，且有繼續上升的趨勢[10]。在美國和歐盟一些國家，沙門菌引起的食源性疾病高居首位，嚴重威脅人類的公共安全，另一方面，沙門菌對畜牧業也造成了不可估量的損失，制約著畜牧業的發展。

表4 沙門菌耐藥性檢測結果Table 4 Antibiotic sensitivity of Salmonella isolates

研究報道顯示沙門菌血清型約有2500種，中國約有290種血清型[11-12]。本研究采用增菌、選擇性培養基篩選、PCR鑒定的方法分析沙門菌在華東地區養殖場的分布情況。結果表明，華東地區養殖場中沙門菌的分離率高達16.84%；分離的菌株中，鼠傷寒沙門菌的流行是最為普遍的，約64.58%；腸炎沙門菌約6.25%；其他約29.17%；雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌未分離到。查華等[13]2010～2012年分離到的沙門菌中，雞白痢沙門菌為優勢菌，說明華東地區流行的沙門菌血清型可能隨著時間發生了改變，并且不同地區不同養殖場可能存在不同血清型沙門菌的流行。

目前已在不同血清型沙門菌中發現了23個毒力島[14]，分布在這些毒力島上的毒力基因與沙門菌的致病性密切相關。因此，檢測沙門菌的毒力基因分布，有助于分析沙門菌的致病力強弱。本研究選取沙門菌常見的毒力基因進行檢測，結果顯示大部分毒力基因均在沙門菌中廣泛分布，提示沙門菌分離株毒力較強。另外，我們選取的7株臨床分離株LD50均在1.26×104～2.00×105CFU之間，發病及死亡速度快，對小鼠具有較強毒力。

近年來，越來越多的沙門菌已成為多重耐藥菌[15-18]。本研究采用紙片擴散法檢測臨床分離的沙門菌的耐藥性。結果表明，沙門菌分離株對多數抗生素耐藥，其中克林霉素、利福平的耐藥率高達100%，耐藥性十分嚴重，且各菌株均存在不同程度的多重耐藥，這與李郁[19]、李茂輝[20]、蹇慧[21]等的研究結果一致。因此，針對細菌病的防控和治療，必須合理地使用抗生素，否則，不僅難以控制細菌流行，反而極有可能導致超級細菌的出現，這將會對整個畜禽養殖產業，乃至人類食品的安全產生巨大威脅。