變溫對仿刺參（Apostichopus japonicus）免疫力及抗病力的影響

高楊

摘 要：水溫一直以來被認為是影響仿刺參（Apostichopus japonicus）各項免疫指標的重要環境因素。為了探討其對于仿刺參免疫力及抗病力的影響，首先對仿刺參進行了兩組溫度突變試驗，分別為A組（11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃）和B組（18 ℃→11 ℃→4 ℃），取體壁、觸手、體腔液、內臟四個不同組織，測定抗菌活力、超氧化物歧化酶（SOD） 、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）四個免疫指標。隨后取B組溫度突變的條件，進行攻毒感染試驗，計算發病率和死亡率。結果表明：（1）在A組溫度突變試驗中，各項免疫酶指標一般在前兩輪的溫度突變中，差異不顯著（P<0.05），而到了第三輪的溫度突變時，體壁和觸手中免疫相關酶活性顯著上升（P<0.05）。（2）在B組溫度突變試驗中，刺參機體的免疫及其相關酶在最適生長溫度18 ℃下的活性較高，溫度突降至11 ℃其活性下降，再降至4 ℃后有所回升，但仍低于18 ℃下的免疫活性；觸手和體壁中免疫酶活性變化顯著（P<0.05），而體腔液和內臟中免疫酶的活性變化不顯著（P<0.05）。（3）攻毒試驗結果顯示，溫度突變各組刺參發?。ㄍ履c及化皮率）及死亡率明顯高于正常組。由此表明，溫度突變作為一種環境脅迫，對于仿刺參的免疫力和抗病力產生重要的影響。體壁和觸手作為刺參免疫屏障的第一道防線，對于環境變化最為敏感。

關鍵詞：仿刺參（Apostichopus japonicus）；變溫；免疫力；抗病力

仿刺參（Apostichopus japonicus）屬于變溫動物，自身免疫力受環境影響大。溫度波動對刺參的生理活動及免疫反應均具有重要影響[1]。目前有關溫度對仿刺參免疫力影響的研究，主要集中在降溫對仿刺參生長及生理現象的研究等方面[2-4]。如低溫使仿刺參耗氧量下降，出現負增長。不同群體仿刺參還出現排臟、皮膚潰爛（化皮）和死亡等現象。變溫對刺參免疫力及抗病力的影響還未見報道。

在本研究中，作者設計了兩組溫度突變實驗，并取體壁、觸手、體腔液、內臟四個不同組織，進行了抗菌活力、超氧化物歧化酶（SOD） 、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）四個免疫指標的測定。隨后進行攻毒試驗，統計發病率和死亡率。為深入并系統地研究環境因子對刺參免疫力及抗病力的影響提供了參考。目前認為，機體抗病力的下降是導致發病死亡的主要原因之一。本研究有助于深入了解刺參免疫防御特性，為刺參苗種的健康養殖提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和條件

實驗所用幼參于2016年 3月6日取于大連黑石礁海域某海參養殖場，體長3～5 cm，平均體重2.60 g。取回后在60 cm×25 cm×40 cm玻璃水族箱內暫養，養殖用水為鹽度29‰～32‰、pH 7.9～8.3、溫度17～19 ℃的大連黑石礁海域過濾海水。暫養期間進行不間斷充氣、每日投飼、換水等日常管理，經暫養一周無異?，F象，作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組

設計了兩組溫度突變組，每24 h溫度突變一次，每組6頭幼參，設置3個平行組。

A組： 11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃，由起始溫度11 ℃經24 h后，將幼參直接轉到4 ℃下，共反復3次。

B組：18 ℃→11 ℃→4 ℃，由起始溫度18 ℃經24 h后，將幼參直接轉到11 ℃，再經24 h轉到4 ℃下。

控溫：將盛有2 L過濾海水的聚乙烯燒杯放入已調好溫度的可控溫生化培養箱中，24 h后，小心地把幼參移到下一個調節好溫度的燒杯中。

取樣：分別在每次溫度突變后的第1 h、12 h、24 h時每組隨機取幼參1頭，最后取3個樣品平均值。

1.2.2 樣品的制備

在冰盤上解剖取觸手、體壁、內臟、體腔液，裝入樣品袋中，-80 ℃深冷冰箱中保存，備用。

觸手、體壁、內臟分別稱重后，按1∶10（w/v）加入冷PBS緩沖液進行勻漿，勻漿液移入1.5 mL離心管，離心。觸手、體壁在4 ℃、6 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃冷凍保存，備用；腸、體腔液在4 ℃、7 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃冷凍保存，備用。

1.2.3 免疫酶的測定

抗菌活力：采用Hultmaik等[5]方法在96孔酶標儀中進行。

超氧化物歧化酶（SOD）活力：采用南京建成生物醫藥公司的試劑盒測定。

堿性磷酸酶（AKP）：采用磷酸苯二鈉法[6-7]。以每100 μL樣品上清液在37 ℃與底物作用15 min，產生1 mg酚定義為一個酶活力單位。

酸性磷酸酶（ACP）：采用磷酸苯二鈉法[6-7]。以每100 μL樣品上清液在37 ℃與底物作用60 min，產生1 mg酚定義為一個酶活力單位。

蛋白質含量：采用考馬斯亮蘭試劑盒測定。

1.2.4 攻毒感染試驗

感染用實驗室分離獲得的3株對刺參有致病性的細菌（鑒定為弧菌屬細菌），分別編號為06021802（2#），050124201（8#），05040702（27#）。將三株菌在2216E斜面25 ℃培養18～24 h，然后用無菌海水洗脫培養物并稀釋，制成菌懸液（濃度為7.5×107個/mL）。另取刺參分成4個試驗組，每組10頭，設置3個平行組。其中2組經過B組溫度突變后，體腔注射0.1 mL菌懸液；取正常條件下暫養的幼參同時注射等量無菌海水。實驗水溫12～15 ℃。觀察并統計發病率和死亡率。

1.3 統計分析

所得試驗數據均用平均值±標準差（X±SE） 表示，以酶的比活力即每毫克蛋白中的酶活力進行數據統計。采用SPSS17.0進行方差分析和Duncan多重檢驗。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。endprint

2 結果

2.1 A組溫度突變對仿刺參免疫相關酶的影響

A組溫度突變對仿刺參免疫相關酶的影響如圖1所示。

注：同一次采樣組間標有不同字母者表示差異顯著（ P<0.05 ） ，標有相同字母者表示差異不顯著（ P>0.05）。a，b，c：同一溫度下的不同組織之間顯著差異（ P<0.05 ）；A，B，C：不同溫度下的同一組織之間的顯著差異（ P<0.05），下同。

2.2 B組溫度突變對仿刺參幼參免疫相關酶的影響

B組溫度突變對仿刺參免疫相關酶的影響如圖2所示。

2.3 溫度突變對仿刺參發病和死亡的影響

由表1可以看出，經過溫度突變后的各組刺參發病率（吐腸及化皮率）及死亡率明顯高于正常組。其中，8#菌株的發病率和死亡率最高，死亡率為30%，可能與該菌株的毒力有關。27#和2#菌株感染組在感染15天后均無死亡，但從吐腸率和化皮率中的比較中發現，2#發病率大于27#菌株感染組。

3 討論

刺參作為外溫動物，溫度的變化會導致其內環境溫度的改變，影響其機體代謝、細胞活動變化，免疫學上表現為抗菌活力、SOD、ACP、AKP活力的變化?？咕盍V泛存在于甲殼動物的血淋巴中，在免疫反應中起重要作用。SOD是一種重要的抗氧化酶[8]，作為活性氧清除劑可清除體內自由基，在防止衰老及防生物分子損傷等方面具有極為重要的作用。ACP是高等動物體內巨噬細胞溶酶體的標志酶，在體內直接參與磷酸基團的轉移和代謝[9]。AKP是生物體內的一種重要的代謝調控酶，直接參與磷酸基團的轉移，參與鈣磷代謝，在脊椎動物的骨化作用中起重要作用。

環境因子變化是引起養殖生物應激反應使其免疫抗病能力下降的主要誘因[10]。其中溫度是重要的外界因素之一。本研究用抗菌活力、SOD、ACP和AKP的活性作為衡量刺參免疫力的指標，分別做了三組實驗。

A組實驗結果顯示：在連續的水溫突變下，刺參幼參各組織的免疫指標（除了抗菌活力外），在前兩輪11 ℃→4 ℃的溫度突變均顯示出較小幅度的波動變化，而到了第三輪11 ℃→4 ℃溫度突變時幼參機體中的免疫活性開始出現明顯波動。體壁、觸手中各項免疫酶指標出現大幅度的升高并達到峰值，而內臟和體腔液中各項免疫酶指標變化不顯著?？咕盍t在第二輪的溫度突變時就出現大幅度的波動。由此分析，11 ℃與4 ℃之間持續突變對刺參幼參是一種環境脅迫，機體的免疫水平對此產生了相應的應激反應--上下波動，且在連續刺激一定時間以后波動幅度也有所上升。劉偉[11]等在研究溫度緩降和驟降對刺參非特異性免疫影響時，提出溫度刺激會對刺參機體產生損害，為了保護機體免受外界的損害，機體會產生較強的應激反應來對抗逆境。因此各項免疫酶指標會產生變化。由此可以推測，若這種變溫刺激長時間持續下去，機體的免疫水平可能會受影響。

B組實驗結果顯示：幼參機體在最適生長溫度18 ℃下的免疫及其相關酶活性（抗菌活力、SOD、AKP、ACP）較高，隨溫度突降至11 ℃其活性下降，再降至4 ℃后有所回升，但仍低于18 ℃下的免疫活性。且觸手和體壁酶活力較高，波動較為明顯，內臟和體腔液中免疫酶活力變化不大。分析其原因，可能是由于18 ℃是幼參最佳生理狀態和免疫活性的合適溫度，這一結果與董云偉等[12]的研究結果相一致，因此各項免疫酶活力較高。當溫度突降至11 ℃，導致機體的生理功能和免疫防御能力下降，自由基代謝紊亂。再降至4 ℃，各項免疫酶活力略微上升，可能是免疫適應的結果。Yang[13]等在研究水溫對刺參生長和攝食的影響時，發現低溫會導致刺參體重下降和攝食緩慢。Vondracek[14]等研究發現變溫會影響水生生物的代謝。因此降溫作為一種環境刺激，會引起刺參機體免疫力的下降。而且兩組試驗結果顯示，刺參在對溫度脅迫的響應中，觸手和體壁的免疫酶活性較高且變幅大，這與李華[15]等在研究仿刺參不同組織中免疫相關酶的活性及其周年變化時，對于正常刺參成體的研究結果一致，而體腔液和內臟樣品中的免疫相關酶的活性變幅小。究其原因，可能是由于體壁和觸手是抵御外來刺激的第一道防御屏障，對外界環境的變化比較敏感；但內臟中免疫酶的變化，需要一定時間的響應，因此變化不顯著。

弧菌是刺參腐皮綜合癥的致病菌，對刺參養殖危害嚴重[16]。本研究的攻毒實驗結果顯示，經過3天的溫度突變（18 ℃→11 ℃→4 ℃）后，再進行菌株感染。發現溫度突變組，發病死亡率明顯升高；而正常溫度組，發病死亡率變化不大。說明溫度突變作為一種環境脅迫，對刺參幼體抗病力造成了一定的影響?？共×κ欠从硻C體免疫功能狀態的綜合性評價指標。這樣的脅迫雖從刺參外表看不出異常，但對刺參幼體抗病力造成了一定的影響。

低溫會使仿刺參幼參出現活動減弱，停止攝食等現象。而且長時間的低溫變化會引起仿刺參幼體的皮膚潰爛、排臟或死亡[17]，但低溫對仿刺參生理影響還沒有相關報道。Winton Cheng[18]等在研究溫度變化對羅氏沼蝦抗病力的影響時，發現高溫會引起抗病力的下降。陳家長[19]等在研究溫度脅迫對羅非魚抗病力影響時，也得出高溫引起抗病力下降的結論。因此，變溫作為一種環境刺激，會導致抗病力的變化。

4 結論

綜上所述，在A組試驗中，免疫酶活力上升，體壁觸手變化較顯著；由此說明，快速而連續的溫度波動，作為一種環境刺激，會引起仿刺參機體的免疫反應，增強仿刺參的非特異性免疫力。B組的試驗，免疫酶出現急劇下降后略微上升的趨勢，體壁觸手波動顯著；持續的降溫，會使仿刺參非特異性免疫力下降，攻毒試驗進一步證明，與對照組相比，經過溫度突變處理后，抗病力明顯下降。由此說明，溫度的刺激，作為一種環境脅迫，能夠引起仿刺參的非特異性免疫力下降，而且抗病力也下降。

因此在養殖和運輸過程中，應盡量避免溫度大幅度變化和持續波動，室外養參池應注意在變溫季節及時調節水深以控制水溫，防止因溫度變化幅度過大或波動，影響刺參的正常生理功能，進而影響機體免疫力。endprint

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