Cu2+對鯽魚過氧化物同工酶表達的影響

劉金霞

摘 要：研究不同濃度的Cu²⁺對鯽魚過氧化物同工酶表達的影響。用四個不同濃度梯度的硫酸銅溶液飼養鯽魚，處理4 d后，使用聚丙烯凝膠垂直平板電泳法，研究不同濃度的Cu²⁺對鯽魚肝臟、鰓過氧化物同工酶的影響。結果顯示，不同濃度的Cu²⁺都有可能使肝臟、鰓組織過氧化物同工酶帶強弱發生較明顯的變化，并且對其組織過氧化物同工酶的影響顯現出一定的組織差異性，在一定量的濃度范圍內表現出應激性，可以說，低劑量的銅離子可以誘導酶活性的提高。

關鍵詞：銅離子；鯽魚；過氧化物同工酶

對于生物而言，毒物與毒性是兩個不同而又相關的概念，表現出毒性的物質，不能統統稱為毒物，毒物也只在一定濃度、一定接觸時間后才顯出毒性，有的甚至還是生物不可缺少的微量元素，銅就是這種情況[1]。銅離子（Cu²⁺）在濃度較低時可提高抗氧化酶的活性；而在濃度較高時，會降低抗氧化酶的活性，從而使Cu²⁺變成一種抑制劑或有毒制劑[1]，因此，研究、探討Cu²⁺對水生動物的影響十分必要。

Cu²⁺被魚體吸收后，一部分通過血液循環到達各組織器官，可能影響鯽魚各組織內的過氧化物同工酶的活性，過氧化物同工酶（POD）是細胞中的一組重要的抗氧化酶，它們存在于細胞的過氧化物酶體內，以鐵卟啉為輔基，可催化活性氧中的過氧化氫氧化[1]。同工酶是基因表達后分子水平的表型，測定同工酶譜是了解基因存在和表達的重要工具。

本研究以鯽魚作為研究對象，通過聚丙烯凝膠垂直平板電泳法來觀察過氧化物同工酶的表型，采用生態學單因子梯度實驗方法，對鯽魚的過氧化物酶的表型進行觀察研究。以期探討Cu²⁺對魚類的毒害機制以及與水體中的Cu²⁺濃度的相關性。

1 材料與試劑

1.1 實驗魚

鯽魚：健康，體表無損傷，體型勻稱，體長8～10 cm。將購買回來的鯽魚放在之前準備的、曝曬之后的自來水中預飼養，并投喂一定的魚食，一天后染毒。

1.2 實驗試劑及其配制

硫酸銅（分析純）：使用前先配成10 g/L的母液，使用時稀釋成所需要的濃度。

分離膠緩沖溶液（pH 8.9）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris36.8 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

濃縮膠緩沖溶液（pH 6.7）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris5.96 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

凝膠貯備液：丙烯酰胺 58 g，雙丙烯酰胺 2 g，加蒸餾水溶解，定容至200 mL。存放于4 ℃棕色瓶避光保存。

10%過硫酸銨溶液：1 g過硫酸銨溶于10 mL蒸餾水中（現用現配）。

電極緩沖液pH 8.3：Tris 6 g，甘氨酸28.8 g用蒸餾水定容至1 000 mL。用時稀釋10倍。

上樣緩沖液：濃縮膠緩沖液10 mL，甘油（丙三醇）5 g，1%溴酚蘭1 mL。

7%冰乙酸：取7 mL冰乙酸加水至100 mL容量瓶中定容。

染色劑：聯苯胺0.1 g+無水乙醇15 mL（提前配好）、15 mol/L乙酸鈉10 mL、1.5 mol/L冰乙酸10 mL、蒸餾水75 mL混勻。

PBS緩沖液pH 7.0： 取母液①32 mL和母液②68 mL混合即可。

母液的配制：① 0.2M Na2HPO4：稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O，溶于 1 000 mL 水

② 0.2M NaH2PO4：稱取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于1000 mL 水

1.3 主要實驗器材

臺式冷凍離心機、電子天平、HHS-2S型電熱恒溫水浴鍋、DYCZ-24D 雙垂直電泳儀、FD201 穩壓穩流電泳、電子稱、分析天平、托盤天平、移液槍（5 mL、1 mL、200 μL）、增氧泵、微量加樣器

2 實驗方法

2.1 鯽魚的染毒實驗

將實驗魚在實驗室暫養4 d后，挑選體格鍵壯，規格一致的鯽魚進行染毒實驗。實驗在塑料水族箱中進行，實驗用水為曝氣24 h以上的自來水，每個水族箱中加入 40 L 含有 不同濃度Cu²⁺的溶液。實驗分 4 個濃度處理組，Cu²⁺濃度分別為0.000 mg/L、0.008 mg/L、0.016 mg/L、0.032 mg/L，并配有平行組。每一水族箱中放實驗魚20尾，實驗時水溫保持在15～20 ℃，實驗期間停止喂食，并用充氣泵連續不斷的充氣。

2.2 粗酶液的制備

Cu²⁺處理3 d后，從每個處理組中隨機抽取健康鯽魚 3尾，在冰盤內迅速解剖，分別取鰓和肝胰臟，用吸水紙吸去組織液后稱重，并按 1∶1（W/V）比例加入預冷的提取液（0.1 mol/L pH 7.0 PBS），分別于冰浴中研磨成勻漿。勻漿后經 12 000 r/min，4 ℃條件下離心 20 min 制成粗酶液，于-20 ℃條件下保存。

2.3 電泳待測酶液的制備

電泳前，將已制備好的各組粗酶液與電泳上樣緩沖液按 1∶1（V/V）混勻，后直接進行電泳。

2.4 過氧化物同工酶電泳實驗

2.4.1 電泳方法 POD同工酶電泳采用不連續的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）垂直平板電泳，7%分離膠（pH 8.9） 和 3%濃縮膠（pH 6.7），電極緩沖液為Tris- Gly（pH 8.3）。用50μL的微量進樣器點樣量，點樣量 20 μL/孔。電泳開始時電流恒定在每塊板10 mA，當溴酚蘭指示劑完全進入分離膠時，電流改為每塊板20 mA，當溴酚蘭指示劑電泳至凝膠底端大約0.5 cm時，停止電泳，小心地將凝膠片分離，以備染色。電泳過程約5 h。電泳水環境溫度為 4 ℃。endprint

2.4.2 染色并固定 將制好的凝膠片做好標記后放在大培養皿內，用蒸餾水沖洗數次，然后加過氧化氫溶液5～6滴，再加染色液染色，輕輕振搖 ，觀察顏色變化。然后把染色液倒掉，放在7%的乙酸中固定。

2.4.3 結果記錄及酶譜分析 染色結束后對凝膠片進行拍照留存。隨后，按照酶帶的遷移距離及染色深淺，參考拍攝的照片，繪制出酶譜示意圖。把向距離陰極最近的酶帶進行編號為1，且按照從陰極至陽極的順序依次編號，并計算其相對遷移率（Rf值）。

相對遷移率的計算方法如下：

相對遷移率（Rf）=電泳條帶移動距離（cm）/ 染料移動距離（cm）

3 實驗結果

3.1 電泳圖片及Rf計算

不同濃度的Cu²⁺處理3 d后鯽魚肝胰臟及鰓組織POD同工酶電泳圖譜如圖1。圖1左側為鯽魚肝胰臟及鰓的POD同工酶電泳酶譜，右側為模式圖。 酶譜中各酶帶從負極到正極按POD1、POD2、POD3、POD4和POD5命名。酶譜中各酶帶Rf見表1。

不同濃度的Cu²⁺處理后POD同工酶在鯽魚肝胰臟和鰓兩種組織中的表達情況見表2。從表2可以看出，POD同工酶的表達具有明顯的組織特異性，鯽魚 POD 同工酶電泳酶譜共檢測出五條酶帶，兩種不同組織中的 POD 酶帶數量及顏色的深淺都表現出差別。鰓組織中檢測出POD-1、POD-2 、POD-4和POD-5四條酶帶，而在肝組織中只檢測出POD-1、POD-2 和POD-3三條酶帶。其中POD-2顏色最深，其與POD-1在兩種組織中都有表達。

（從左至右編號為1、2、3、4、5、6、7、8，其對應濃度分別為1號和5號：0.032 mg/L，2號和6號：0.016 mg/L，3號和7號0.008 mg/L，4號和8號為對照組即0.000 mg/L。其中1-4號為肝胰腺組織，5-8號為鰓組織）

3.2 數據分析與討論

過氧化物同工酶是一種活性較高的適應性酶，在大部分動植物體內的各個組織內都有所發現，由于該酶在逆境中適應能力特別強，反應十分敏感，因此該酶可以及早地反映出生物生長發育的特性、體內新陳代謝的狀態和對外界水環境不斷改變的適應性。

通過酶帶數目和顏色的深淺進行對比發現：POD-1和POD-2在肝胰腺和鰓組織同時都有表達，而POD-4和POD-5只有在鰓組織內有表達。說明不同組織間的過氧化物同工酶具有差異性。

相同組織間觀察，1-4號，隨著Cu²⁺的濃度升高到一定濃度，其過氧化物同工酶具有超強表達，濃度過高時反而具有抑制作用。

4 結論

正常情況下鯽魚不同組織間過氧化物同工酶具有明顯的差異性；肝組織過氧化物同工酶活性要大于鰓組織過氧化物同工酶活性；

同一組織中的過氧化物同工酶在不同濃度的Cu²⁺溶液中表現的活性是不一樣的，肝組織中的過氧化物同工酶隨著Cu²⁺濃度的升高，當達到低濃度時活性會增強，達到中濃度甚至高濃度時，其酶的活性會受到抑制，甚至表達很微弱。

而鰓組織中的過氧化物同工酶隨著Cu²⁺濃度的升高時，在達到中濃度之前，其活性一直是增強的，濃度在升高時，酶的活性會變弱。

這種現象所反映的可能是鯽魚機體對重金屬離子毒害的一種抵抗力，或者稱之為適應性。當重金屬離子進入動物體內后，動物通過同工酶的改變去抵抗該毒性或者去適應該逆境，使得動物體得以生存。由此可見，Cu²⁺染毒引起鯽魚鰓部和肝臟的損害，而這種損害又與鯽魚體組織內的過氧化物同工酶的改變有一定的聯系。其中過氧化物同工酶的變化在鯽魚Cu²⁺中毒過程中起著重要作用。

參考文獻：

[1] 湛江水產?？茖W校.淡水養殖水化學[M].北京 ：農業出版社，1979.endprint