甲基營養型芽胞桿菌的研究進展

張妙宜+云天艷+周登博+馮仁軍+起登鳳+張錫炎

摘 要 甲基營養型芽胞桿菌是一種無致病性的細菌，對外界環境具有多抗逆性，作為芽胞桿菌屬的“后起之秀”，被越來越多的應用于各行業中。本文主要從甲基營養型芽胞桿菌的生理生化特征、代謝產物及應用等方面論述其研究進展。

關鍵詞 甲基營養型芽胞桿菌 ；特征 ；代謝產物 ；應用

中圖分類號 Q93 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.013

Research Advances on Bacillus methylotrophicus

ZHANG Miaoyi1，2） YUN Tianyan2） ZHOU Dengbo1）

FENG Renjun1） QI Dengfeng1） ZHANG Xiyan1）

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou 571101；

2 College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228）

Abstract Bacillus methylotrophicus is a non-pathogenic bacterium， and has a multiple resistance to the environment. As a "rising star" of bacillus， B. methylotrophicus has been gradually used in various industries. The advances in researches in physiological and biological characteristics and metabolite， and application of B. methylotrophicus were reviewed.

Keywords Bacillus methylotrophicus ； characteristic ； metabolite ； application

芽胞桿菌屬（Bacillus）自1872年被德國微生物學家Cohn建立以來已有100多年研究歷史，模式種為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），細胞呈桿狀或橢圓狀，因其芽胞并非繁殖體而為特殊構造的休眠體，故命名中采用“胞”字而非“孢”[1]。芽胞具有耐高溫抗輻射等特點，能有效抑制病菌的生長繁殖。隨著多相分類技術的發展，已分化出大量的芽胞桿菌近緣新屬。2010年，Munusamy Madhaiyan等[2]就首次從傳統種植的水稻根際土壤中分離得到甲基營養型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus），甲基營養型芽胞桿菌為厚壁菌門，芽胞桿菌綱，芽胞桿菌目，芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，廣泛分布于自然界中，與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rRNA基因序列同源率為98.2%～99.2%[3]，是屬于能利用甲醇等非C-C鍵低碳化合物的甲基營養菌（methylotrophy）中的一類微生物，因其代謝產物的多樣性、對外界環境因子的多抗逆性和無污染無毒害等優點，近年來被越來越多的運用于農業、醫學、商業等領域。為能更深入認識了解甲基營養型芽胞桿菌的基本特性和研究進展，本文旨在就甲基營養型芽胞桿菌的生理生化特征、代謝產物及應用等方面進行綜述。

1 甲基營養型芽胞桿菌的設立及其鑒別特征

甲基營養型芽胞桿菌的最早記載出現在M.Madhaiyan等[4]關于菌株CBMB205T的研究中，通過表型特征觀察、生理生化鑒定、基因序列分析、DNA-DNA雜交試驗將其描述為芽胞桿菌屬的新種并命名為甲基營養型芽胞桿菌，與該屬的其他種類一樣具有利用低碳化合物的能力。2008年Boden等[5]證明兼性甲基營養菌代謝C1化合物的巨大潛力，并且作為在原核生物中發現的甲基營養菌有別于傳統的細菌類別[6]。菌株CBMB205T是從水稻根際土壤中分離得到的能在高濃度甲醇環境下生長的具有產ACC脫氨酶能力的革蘭氏陽性菌，經測定，DNA g+c含量為45.0 mol[2]，與枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌的摩爾分數差分別為14和9，可鑒定三者為同屬不同種。

甲基營養型芽胞桿菌嚴格好氧，革蘭氏陽性，細胞呈桿狀，寬0.63～0.64 μm，長1.8～2.7 μm，芽胞橢圓形，具運動性。菌落在AMS培養基上28 ℃培養4 d生長直徑為0.2～0.8 mm，呈奶白色半透明狀，邊緣整齊，表面凸起有褶皺。在表型特征上有別于其它屬種，如：枯草芽胞桿菌呈灰白色或微黃色不透明狀，表面粗糙，邊緣不整齊；地衣芽胞桿菌為乳白色微透明狀，表面凸起偏光滑，邊緣整齊；解淀粉芽胞桿菌則是白色半透明狀，表面光滑隆起，邊緣不整齊。Bacillus methanolicus在NA和LB等多種培養基中均能生長。大量研究表明，不同的培養基成分和培養條件對不同的甲基營養型芽胞桿菌菌株生長有著不一樣的作用，但總的來說，菌株在一定條件范圍內適宜生長：CNaCl≤4.0%（濃度），溫度20～45℃，培養液pH值為2.0～10.0，最佳生長溫度和pH值分別為28℃和7.0。氧化酶試驗、接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗和蛋白酶、果膠酶活性測定結果均呈陽性，吲哚試驗、脲酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗、β-半乳糖苷酶試驗和纖維素酶活性測定結果均呈陰性，能水解明膠、甘油、三丁酸和七葉苷，可利用的唯一碳源有甲醇、乙醇和三甲胺，可利用的唯一氮源有硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、三甲胺、氰酸鉀、硫氰酸鉀、甘氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、1-氨基環丙烷-1-羧酸[3]。endprint

2 甲基營養型芽胞桿菌代謝產物的多樣性

微生物的正常生長與繁殖離不開自身的代謝作用，其代謝產物[7]的種類差異性又調節著生物體的生命活動。1945年Johnson等[8]首次發現枯草芽胞桿菌代謝產物具有抗菌功能，且代謝快、安全性能高、適用范圍廣、生產工藝簡便，引起國內外科研人員對微生物產物多樣性的廣泛關注，之后陸續有專家學者從芽胞桿菌屬中分離出抗菌蛋白、抗菌肽等代謝產物?？莶菅堪麠U菌的代謝產物主要有核黃素、細菌素、伊枯草菌素；地衣芽胞桿菌的主要代謝產物有苯乙酸、β-甘露聚糖酶、堿性蛋白酶、β-苯乙醇、幾丁質酶；解淀粉芽胞桿菌的主要代謝產物為表面活性素、伊枯草菌素、二磷酸硫胺素[9]。甲基營養型芽胞桿菌作為21世紀初發現的新種益生菌，同樣具有很大的研究前景。

甲基營養型芽胞桿菌中的抑菌代謝產物常見的有：抑菌蛋白、蛋白酶、纖維素酶、氨肽酶、抑菌肽等。采俊香等[10]在抱莖苦荬菜中挖掘Bacillus methylotrophicus抗菌蛋白的拮抗及耐高溫、耐酸堿能力，確定該蛋白類抑菌代謝物對番茄灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病均有明顯拮抗效果，最高可達95.4%，培養條件控制在80℃以內、5≤pH≤10、紫外照射12 h，抑菌活性穩定；康興嬌等[11]從葡萄園土壤中篩選出的甲基營養型芽胞桿菌T3能產生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素等抑菌物質，對葡萄霜霉病菌具有強烈抑制作用，通過田間試驗，菌株T3發酵液的防效效果明顯優于清水對照；武利勤等[12]在霍山石斛中分離篩選出具有強烈廣譜抗菌活性的甲基營養型芽胞桿菌RA菌株可產生長素、嗜鐵素、蛋白酶等抑菌物質；王洪梅[13]從江西鷹潭土壤樣品中分離篩選到一株廣譜活性強的甲基營養型芽胞桿菌N5，并優化其發酵條件研制成微生物菌劑，通過PCR擴增和HPLC-MC分析確定芬枯草菌素為主要拮抗物質。章寧娟等[14]通過48孔板發酵法篩選出高產3-羥基丁酮甲基營養型芽胞桿菌，并采用響應面優化培養條件，使3-羥基丁酮轉化率提高5.81%，3-羥基丁酮產量達41.17 g/L，為微生物發酵工藝、改善食品風味研究提供研究機制；呂倩等[15]將來自南海深海的SHB114進行HPLC等系統純化，確定該甲基營養型芽胞桿菌含脂肽類化合物bacillomycin Lc[16]，可抗植物病原菌；胡江春團隊[17]從遼寧渤海海域海泥中篩選出一株BAC-9912經華北制藥集團愛諾有限公司研制成新型微生物菌劑，其主要抑菌代謝產物為環脂肽類化合物，具有很強的廣譜活性和安全性，是我國首例獲批的甲基營養型芽胞桿菌9912母藥及可濕性粉劑，有望取代進口化學農藥在農作物綜合防治方面的地位。

3 甲基營養型芽胞桿菌的應用研究

3.1 農業方面

一直以來，濫用化學農藥使植物病菌對殺菌劑敏感度降低并產生一定的抗藥性，導致農民防病害成本增加，嚴重影響作物產量，并且農藥殘留也使土壤環境、水體污染問題日漸突出，甚至進入食物鏈中影響人類健康。為了改變這一不良現象，以實現農業可持續化發展，越來越多的研究轉向了生防菌劑的防害及增產功效上[18]。中國于20世紀70年代末開始微生物菌劑產業，近現代植物病理學家陳延熙教授提出的“植物體自然生態系”概念[19]及“增產菌”研究，為中國植物病害生物防治奠定了夯實的理論基礎和應用依據，在土傳病原菌生態學的基礎上研究發展生物防治方法，正確樹立了植物病害是因病原菌導致的植物體自然生態系失衡的觀念[20]；中國農業大學梅汝鴻教授認為微生態學是對自然界中微生物群落的結構、功能和各種群之間互作關系的研究的新興學科[21]，它囊括生物體自身代謝平衡體系、環境適應機制與人類健康等問題。以菌治菌[22]，將成為農業時代發展的主力軍，有利于抑制病菌病害蔓延、改善土壤肥力和生態環境。目前，已有許多科研人員在不同的原材料中分離篩選出對植物病原菌具有明顯拮抗效果的微生物菌株。黃華毅等[23]從棗樹根際土壤中分離得到一株拮抗菌株STO-12，經過研究鑒定表明該菌株為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），能同時抑制棗縮果病菌（Alternaria tenuissima）等3種病原菌且能分泌蛋白類和脂肽類抑菌物質；孫正祥等[24]從香蕉根際土壤中篩選出的地衣芽胞桿菌C-4對香蕉枯萎病菌的相對抑制率在76%以上。甲基營養型芽胞桿菌作為芽胞桿菌屬的“后起之秀”，其在生物防治領域發揮的拮抗效果也不容小覷。謝學文等[25]從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到甲基營養型芽胞桿菌WF-3，并通過田間試驗發現其對黃瓜炭疽病防效分別為68.14%和73.70%；黃霄等[26]指出了菜籽餅餅肥發酵液中分離篩選的BM-24菌株對多種植物病原菌具有高效拮抗作用，特別是對香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）的抑菌率達到80.4%。調整生防菌劑配方能同時達到防治病害和增加產量的目的，李學紅[27]進行正交試驗優化出甲基營養型芽胞桿菌可濕性粉劑的最佳配方，實現防治黃瓜灰霉病、增加產量與降低生產成本的目的；劉利強等[28]檢測出30億個/g甲基營養型芽胞桿菌可濕性粉劑500倍液藥劑對黃瓜灰霉病防效最好，且安全性最高。

3.2 環境保護方面

利用生物法降解毒害刺激物質可以有效解決工業廢水污染難題，如：甲醛降解[29]、甲醇降解[30]等。陸榆豐[31]系統考察了B.methylotrophicus對污水底泥中三聚甲醛（TOX）的降解功效；楊波等[32]將天津港富營養化水域分離篩選出的三株高效嗜鹽微生物：嗜鹽喜鹽芽胞桿菌（Halobacillus halophilus）、海桿菌（Marinobacter sp.）、甲基營養型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）按3∶2∶1比例混合使用，可去除高鹽廢水中70%以上的化學需氧量（COD）。Pengfei Sun等[33]分離到一株可通過固化抑制藍藻生長的Bacillus methylotrophicus；翟春梅[34]根據菌藻共生體系特點，從太湖銅綠微囊藻提取一株Ma-B1菌株，并通過GC/MS分析驗證了Bacillus methylotrophicus 代謝物是影響菌-藻互作關系的重要因素；陳蘇團隊[35]的研究表明甲基營養型芽胞桿菌能有效解決土壤中滴滴涕（DDT）殘留問題，具有修復土壤功能，并通過田間小區實驗發現混合表面活性劑（十二烷基苯磺酸鈉∶吐溫80=2∶3）與甲基營養型芽胞桿菌聯合可使土壤中DDT降解率從單獨施用降解菌的47.05%提高至63.98%；唐昊[36]從沼液中篩選到一株編號為“65”的高產聚羥基脂肪酸酯（PHA）甲基營養型芽胞桿菌，并優化該功能菌的培養條件，為探索餐廚垃圾回收降解的可行性提供數據支撐。endprint

3.3 工業方面

李潭[37]通過平板劃線法及高嶺土懸濁法從廣西大學池塘土樣中篩選出一株穩定性能高、絮凝活性98.27%的甲基營養型芽胞桿菌C412，并優化其培養條件制成安全性能高、無污染的新型高分子微生物絮凝劑，為規?；I應用提供有效思路；向軍[38]從豆豉中分離到一株能使蛋白質脫苦的甲基營養型芽胞桿菌CC，優化培養后氨肽酶產量和酶活性均明顯提高，這對以后工業研究具有一定的參考價值。

3.4 食品加工方面

國內外大量研究表明，甲基營養型芽胞桿菌因可將外界一氧化碳物轉化為自身營養物質這一特性被廣泛應用于食品發酵領域，胡寶東等[39]研究確定了甲基營養型芽胞桿菌水解酶在固態發酵產業（醬香型大曲）中的突出表現；田丹丹[40]提出了產L-絲氨酸甲基營養型芽胞桿菌在食品添加劑、飼料添加劑等方面的應用前景；吳燕燕等[41]研究發現，甲基營養型芽胞桿菌中抗菌肽對羅非魚片有明顯的保鮮防腐效果；唐曉星[42]對產蛋白酶的兼性厭氧甲基營養型芽胞桿菌NCU507進行發酵豆粕工業研究，確定其最佳發酵條件，為進一步研制飼用益生菌奠定基礎。

3.5 養殖方面

李卓偉[43]為探索飼用微生物菌劑在降低養殖成本和提高養殖質量的可行性，從飼養28 d的還未喂食的健康雛雞腸道黏膜中篩選出三株芽胞桿菌，其中兩株為分別產蛋白質酶和纖維素酶的Bacillus methylotrophicus，后進行芽胞發酵條件優化和肉雞飼養試驗，較對照組測定結果相比，糞便中營養物質殘留明顯減少、腸道中有益菌群濃度升高，說明甲基營養型芽胞桿菌可抑制有害菌種群、促進機體營養吸收及增強免疫，有望降低飼養費用。田良等[44]在仿刺參飼養實驗中利用從仿刺參自身消化道篩選的甲基營養型芽胞桿菌等制成復合益生菌懸液提高仿刺參生長率、消化酶活性及免疫力。張廣亮[45]以土壤、奶牛瘤胃液為樣品，同時分離到具有較高固氮活性的甲基營養型芽胞桿菌，表明它們能對動物消化系統具有重要作用，并且來源之廣，可自然界中廣泛存在。

3.6 醫藥方面

目前正處于“后抗生素時代”[46]，濫用抗生素已使病菌慢慢產生抗藥性，傳統的中藥發酵方法因受環境等因素的影響，無法完全促使微生物菌釋放其功效，培養優勢菌種用以定植于宿主器官內，可調節微生態系統平衡，所以加強益生菌在藥理學上的應用成了醫學界的重要研究方向。鄭榕等[47]為進一步了解藥用植物內生芽胞桿菌的生物多樣性，從武夷山夏枯草植株及根際土壤中分離得到2株甲基營養型芽胞桿菌；李潤靜等[48]研究發現甲基營養型芽胞桿菌SK21.002在30℃下pH為6.5的環境以接種量2%、裝液量30%發酵21 h，代謝產物果聚糖蔗糖酶增加3.75倍，可促進腸道吸收、調節血糖。魏萌[49]運用多種發酵技術優化N-14黃芪發酵液，使黃芪多糖提取率提高57.31%，并通過動物實驗驗證該菌株具有生物轉化能力，可抵抗環磷酰胺對人體器官造成的免疫抑制，經鑒定為甲基營養型芽胞桿菌，代謝產物為纖維素酶、木質素酶。B.methylotrophicus等益生菌可調節宿主體內外營養平衡、促進消化、抑制有害菌繁殖，具有一定的醫療保健功能，是取代抗生素的不二選擇。

4 小結

目前，已有較多芽胞桿菌屬的發展研究面世，但針對甲基營養型芽胞桿菌的綜合論述還并未見報道，國內外關于甲基營養型芽胞桿菌來源介紹主要有土壤、受污染水質、植物根系、動物器官內壁、食材等，并主要分析該類益生菌的代謝產物作用及最佳培養條件，探索其在植物病原菌防治、作物增產保質、減肥減藥等生物技術方面，土壤修復、水資源凈化、工業污染防治等生態環境治理方面，水產養殖、動物飼養方面，食品加工、醫療保健和化工原料等方面的應用，較多的運用于農業推廣上。當今世界已將生態農業模式列為可持續發展的主要趨勢，化學農藥帶來的“三R”問題（“抗性”、“殘留”、“再猖獗”）亟須解決，所以研制高效安全的綜合性復合生物菌劑勢在必行。另外在探究甲基營養型芽胞桿菌的抑菌性能時也應考慮其致病性，避免因病理學特征影響防效。在微生物廣泛適存的自然界原料來源中分離得到更多新的甲基營養型芽胞桿菌，發現還未被挖掘的代謝產物種類，以及開發該菌種在工業制造業方面的應用等方面還可以做進一步的研究。

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