參芪降糖顆粒對高糖環境下施萬細胞氧化應激的調節作用

康學 許保海

·論著·

參芪降糖顆粒對高糖環境下施萬細胞氧化應激的調節作用

康學 許保海

目的探討參芪降糖顆粒對高糖環境下施萬細胞氧化應激的調節作用。方法采用高糖環境下培養的施萬細胞建立氧化應激模型，實驗分為正常對照組、高糖組、參芪降糖含藥血清組和甲鈷胺含藥血清組，干預48小時后，用酶標儀檢測細胞中總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量，應用流式細胞儀檢測活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)水平。結果高糖干預48小時后，與正常對照組比較，高糖組細胞T-AOC和SOD含量明顯降低，ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖含藥血清能顯著提高細胞T-AOC和SOD含量，明顯下調ROS和MDA水平(P<0.05)。結論參芪降糖顆粒能夠明顯提高具有抗氧化能力物質T-AOC和SOD水平，清除有害的氧化代謝產物ROS和MDA，通過抑制高糖環境下施萬細胞的氧化應激而發揮對糖尿病周圍神經病變的保護作用。

氧化應激； 施萬細胞； 糖尿病周圍神經病變； 參芪降糖顆粒

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的并發病之一[1]。DPN的發病機制尚未完全闡明，其發生發展是多因素共同作用的結果，糖尿病并發癥統一機制學說認為：高糖狀態引起線粒體中超氧陰離子生成過多，組織細胞發生氧化應激，最終導致包括DPN在內的糖尿病慢性并發癥發生[2]。DPN目前尚無特效治療方法，西藥治療現狀并不理想，而中醫藥在防治本病方面具有較大優勢。DPN屬于中醫“消渴痹證”之范疇，其病機為氣陰兩虛，進而脈絡瘀阻。中成藥參芪降糖顆粒益氣養陰，滋脾補腎，正切合DPN之中醫病機。本文旨在探討參芪降糖顆粒對高糖環境下周圍神經膠質細胞——施萬細胞氧化應激的調節作用，為DPN的機制研究及臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物和細胞來源

SPF級雄性SD大鼠35只，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。RSC96 cell line(ATCC?CRL-2765TM)，購自American Type Culture Collection。

1.2試劑與藥品

D-(+)-Glucose(No.D7021，Sigma-Aldrich Inc.)；DMEM培養基(No.11965-092，Gibco)，0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA和酚紅，T1305，索萊寶科技有限公司)；MTT(No.M5655，Sigma)；DMSO(No.D2650，Sigma)。T-AOC試劑盒(No.20170320)、SOD試劑盒(No.20170314)、MDA試劑盒(No.20170314)和總蛋白測定試劑盒(No.20170308)，均購自南京建成生物工程研究所。ROS試劑盒(No.88-5930，eBioscience)。參芪降糖顆粒(批號：41913327，魯南厚普制藥有限公司)；甲鈷胺片(商品名：彌可保，0.5 mg/片，批號：1609066，衛材藥業有限公司)。

1.3儀器

371型CO2培養箱(Thermo)；SpectraMax Plus 384全波長酶標儀(Molecular Devices)LSRFortessa流式細胞分析儀(BD Bioscience)；LWD300-38LTI三目倒置相差顯微鏡(上海測維光電)；Biofuge 15R低溫生物離心機(Heraeus SEPATECH)；UW3100型超聲破碎儀(BANDELIN)；XDTD-8222恒溫鼓風干燥箱(精宏實驗設備有限公司)；W-01B數顯恒溫水浴鍋(金怡儀器科技有限公司)。

1.4含藥血清的制備

35只大鼠隨機分為空白血清組(7只)，高糖組(7只)，參芪降糖含藥血清組(14只)和甲鈷胺含藥血清組(7只)。按人和動物體表面積換算，大鼠給藥量為人體等效劑量8倍，即參芪降糖組按1.2 g/kg灌胃中藥水溶液，陽性藥含藥血清組給予20 mg/kg甲鈷胺水溶液，空白對照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續7天。于末次給藥2小時后，腹主動脈取血，靜置2小時后，離心取血清，56℃水浴40分鐘滅活，除菌過濾，分裝后置于-80℃冰箱凍存備用。

1.5細胞活力MTT檢測

將對數生長期的RSC96細胞復蘇后，分別加入25 mM的DMEM培養基+10%正常大鼠血清、150 mM葡萄糖+10%正常大鼠血清、150 mM葡萄糖+10%參芪降糖血清、150 mM葡萄糖+1%參芪降糖血清、150 mM葡萄糖+10% 甲鈷胺含藥血清。孵育48小時后，吸棄培養基，每孔加入20% MTT/DMEM培養基，孵育4小時后，每孔加入DMSO，混勻溶解，于490 nm測OD值。

每組取4個復孔的OD值計算細胞活力。細胞活力(%)=實驗組OD值/25 mM組OD值×100%。

1.6實驗分組及給藥

取對數生長期低糖培養的RSC96細胞，胰蛋白酶消化計數后，接種于96孔板培養，待細胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的DMEM低糖培養基同步化24小時后，吸掉培養上清，分組加入藥物血清。實驗共分5組：(1)正常對照組(25 mM的DMEM培養基+10%正常大鼠血清)；(2)高糖組(150 mM葡萄糖+10%正常大鼠血清)；(3)參芪降糖高劑量組(150 mM葡萄糖+10%參芪降糖顆含藥血清)；(4)參芪降糖低劑量組(150 mM葡萄糖+1%參芪降糖顆含藥血清)；(5)陽性藥組(150 mM葡萄糖+10%甲鈷胺含藥血清)。每組設4個復孔，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中常規培養48小時后待檢。

1.7細胞氧化應激相關指標的檢測

總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒測定T-AOC活力；羥胺法測定各組細胞中SOD活力；微量丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒檢測MDA含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，最終利用統計學方法進行各組施萬細胞中三者含量的比較。

ROS試劑盒是一種利用熒光探針DCFH2-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH2-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，故使用LSRFortessa流式細胞分析儀檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，利用統計學方法進行各組細胞中DCF熒光強度(FITC)的比較。

1.8統計學處理

2 結果

2.1參芪降糖含藥血清對細胞活性的影響

分別檢測各組干預RSC96細胞48小時后細胞活性情況。結果顯示：與正常對照組比較，高糖組細胞活性顯著降低(P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖高、低劑量組及甲鈷胺組均能顯著提高細胞活性(P<0.05)。故選擇10%和1%參芪降糖含藥血清分別作為高、低劑量進行下一步試驗。見表1。

表1 各組細胞活性的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01； 與高糖組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2參芪降糖顆粒對高糖環境下施萬細胞T-AOC、SOD的影響

與正常對照組比較，高糖組細胞T-AOC和SOD含量均顯著降低(均P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖高劑量組和甲鈷胺組T-AOC含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，參芪降糖高、低劑量組及甲鈷胺組均能明顯提高細胞SOD含量(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組細胞中T-AOC、SOD含量的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.3參芪降糖顆粒對高糖環境下施萬細胞ROS、MDA的影響

與正常對照組比較，高糖組細胞ROS含量明顯升高(P<0.01)；參芪降糖高、低劑量組和甲鈷胺組細胞中ROS含量較高糖組顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖1。高糖組細胞MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)；各含藥血清組均能明顯降低細胞中MDA含量(均P<0.01)。見表3。

表3 各組細胞中ROS、MDA含量的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.01。

圖1 各組細胞中ROS熒光強度的比較

3 討論

研究表明，90%的DM患者隨病程的延長可最終發展為DPN。DPN患者存在因周圍神經功能障礙引起的肢體麻木、疼痛、異樣感，甚至肌肉萎縮[3]。因其高發病率及嚴重的致殘率，對DPN的防治已成為糖尿病并發癥研究的重要課題。DPN的主要病理學變化是神經纖維的多灶性丟失，從而使自由基防御減少，脂質過氧化，進而引發細胞損傷或凋亡。眾多研究發現，DPN的病機是細胞氧化應激導致多個代謝途徑受損的最終結果，氧化應激貫穿于DPN的發生發展過程中[4]。Brownlee[5]提出的統一機制學說認為：經典的糖尿病并發癥的多元醇途徑、氨基己糖途徑、AGES途徑和PKC途徑均是高糖環境下線粒體呼吸鏈中的超氧陰離子生成過多導致的結果，進而氧化和抗氧化系統失衡，引起組織損傷。目前，對于DPN這一復雜的病變而言，單純的西醫治療存在治療費用高、療程長、不良反應多等弊端，治療現狀并不理想。而中醫藥著重調動內因，多靶點多途徑整體調節。研究報道[6]，中藥可通過增強抗氧化物酶活性，減少過氧化物表達、抑制線粒體途徑細胞凋亡、抑制DNA氧化損傷途徑、抑制HO-1表達等發揮對DPN的治療作用，優勢顯著。

DPN具有“冷、麻、痛、痿”等特點，當屬于中醫“消渴痹癥”范疇[7]，中醫理論認為，消渴初期患者熱盛于內，燥熱日久，進而傷陰耗氣并出現氣陰兩虛，導致血行澀滯，脈絡痹阻。正如《證治要訣》所云：“消渴日久，精血虧耗，可致雀盲或四肢麻木?！痹摬∫詺馓撗潪楸?，瘀血阻絡為標；病位在肌膚、脈絡、筋肉，內及脾、腎、肝等臟腑。參芪降糖顆粒中主藥人參、黃芪大補元氣；生地黃、麥冬、五味子等養陰生津；枸杞子、覆盆子滋腎固精；加之山藥、茯苓健脾和胃，諸藥合用共奏益腎養陰、滋脾補腎之功，正切合DPN之中醫病機。此外，氧化應激是DPN發生發展的核心，該機制近似于中醫的熱邪入內，耗氣傷陰，瘀血痹阻，同時熱化為毒，損傷臟腑經絡，最終出現周圍神經病變[8]?，F代藥理研究表明[9]黃芪中的主要成分黃芪多糖、皂苷、異黃酮類能抑制自由基產生，清除過剩的自由基，保護細胞，還可提高機體抗氧化酶活力；人參中的超氧化物歧化酶活力相對穩定，可保持在95%以上，具有顯著的抗氧化作用。

氧化應激損傷與DPN發病密切相關，高糖可引起線粒體電子傳遞鏈中ROS生成過量和抗氧化防御系統受損，引起氧化應激，進而通過直接損傷或激活各種通路的方式損傷血管和神經組織[10]。T-AOC是總抗氧化分子和酶含量總和，能夠清除過量的活性氧，使機體處于氧化還原相對平衡的狀態。SOD是機體重要抗氧化物酶，能將機體在正常新陳代謝中產生的有害物質及時消除，避免造成生理性損傷，它的活力和含量反映了機體清除氧自由基的能力[11]。MDA是氧自由基引發的脂質過氧化反應產物，反映機體脂質過氧化水平，它能加劇細胞膜膜損傷程度，進而誘發一系列蛋白質、核酸交聯聚合，形成細胞毒性[12]。本實驗結果顯示：高糖干預48小時后，細胞T-AOC和SOD含量明顯降低，ROS、MDA水平顯著升高(均P<0.01)，提示高糖可誘發氧化應激反應，ROS大量堆積，從而抑制抗氧化劑活性，使總抗氧化能力降低，而毒性代謝產物MDA明顯升高，機體處于氧化應激失衡狀態；參芪降糖顆粒能顯著提高細胞T-AOC和SOD含量，明顯下調ROS和MDA水平，提示藥物可通過提高抗氧化能力物質，清除有害代謝產物，減少氧化應激損傷，最終發揮對DPN的保護作用。

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EffectsofShenqiJiangtanggranuleonoxidativestressinSchwanncellswithhighglucoseenvironment

KANGXue,XUBaohai.PharmacyofTCM,BeijingJishuitanHospital,Beijing10035,China

Correspondingauthor:XUBaohai,E-mail:xubaohai70@163.com

ObjectiveTo explore the effects ofShenqiJiangtanggranule on oxidative stress in Schwann cells with high glucose environment.MethodsOxidative stress model of Schwann cells was established by high glucose environment. The experiment was divided into normal control group, high glucose group,ShenqiJiangtangserum group and methylcobalamin serum group and treatment for 48 hours (h). Microplate Reader was used to detect the content of total antioxidant capacity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). Flow cytometry was used to analysis the level of reactive oxygen species (ROS).ResultsAfter incubated with high glucose for 24 h, the content of T-AOC and SOD in high glucose group were significantly lower, while ROS and MDA activity were significantly higher than normal control group (P<0.01). Compared with high glucose group,ShenqiJiangtangserum could significantly increase the content of T-AOC and SOD, while the level of ROS and MDA was decreased obviously (P<0.05).ConclusionShenqiJiangtanggranule can obviously improve the levels of antioxidant substances T-AOC and SOD, meanwhile eliminate the harmful oxidation metabolites ROS and MDA, play a protective effect on diabetic peripheral neuropathy by inhibiting oxidative stress in Schwann cells with high glucose environment.

Oxidative stress； Schwann cells； Diabetic peripheral neuropathy；ShenqiJiangtanggranule

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.002

2017-04-11)

(本文編輯： 王馨瑤)

100035 北京積水潭醫院中藥房

康學(1989- )，女，碩士，藥師。研究方向：中藥藥效與作用機制。E-mail：kangxue0907@126.com

許保海(1970- )，本科，主任藥師。研究方向：中藥調劑、鑒定，合理使用中成藥。E-mail：xubaohai70@163.com